高效液相色譜法快速測定大黃魚中非法染料硫代黃素

鄭文靜，趙慧男，孫珊珊，薛霞，劉艷明*，張艷俠*

1. 山東省食品藥品檢驗研究院（濟(jì)南 250101）；2. 山東省食品藥品安全檢測工程技術(shù)研究中心（濟(jì)南 250101）

大黃魚作為我國特有的經(jīng)濟(jì)魚類，因其肉鮮味美，蛋白質(zhì)、微量元素以及ω-3脂肪酸含量豐富，且具有較高的藥用價值，深受消費者喜愛[1]。由于其保鮮期短、產(chǎn)量低，大黃魚尤其是野生黃魚往往供不應(yīng)求。硫代黃素也稱為堿性黃1、硫磺素T，是一種苯并噻唑類化工染料，主要用于生物領(lǐng)域的組織染色[2]，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。根據(jù)《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第五批）》的相關(guān)規(guī)定，硫代黃素為禁止用作食品添加劑的化學(xué)制品[3]。但其由于價格低廉、染色效果好，受利益驅(qū)使、不法商販?zhǔn)褂昧虼S素等黃色化工染料對劣勢黃魚或偽黃魚進(jìn)行染色，染色后魚體色澤鮮艷，不易褪色，從而達(dá)到以次充好、以假亂真的目的。近年來“黃魚造假”食品安全事件屢屢發(fā)生。過量食用此類問題黃魚，會對人體腎臟、肝臟造成損傷，具有致癌、致畸變性的風(fēng)險，嚴(yán)重威脅消費者的身體健康[4]。為有效監(jiān)控大黃魚中硫代黃素的違法添加，建立快速準(zhǔn)確的相關(guān)檢測方法尤為必要。

圖1 硫代黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

關(guān)于大黃魚中硫代黃素的檢測尚無統(tǒng)一的相關(guān)國家、行業(yè)檢驗標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的分析檢測也少有報道，僅有一篇文獻(xiàn)報道，且在樣品提取和凈化方面存在一定局限性[2]。食品中合成色素和工業(yè)染料的分析方法主要有分光光度法[5-6]、薄層色譜法[7]、液相色譜法[8-10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]等。分光光度法設(shè)備簡單，操作方便，但存在特異性低、靈敏度低的問題。薄層色譜法自動化程度低，定量精度和重現(xiàn)性較差。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏度高，但成本較高，樣品處理要求嚴(yán)格，影響了方法的普及應(yīng)用。相比之下，高效液相色譜法具有分析速度快、檢測靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確及適用性好等特點，是目前食品領(lǐng)域量化分析合成色素和工業(yè)染料最常用的檢測方法。

試驗建立一種簡便、靈敏、準(zhǔn)確的高效液相色譜測定大黃魚中非法染料硫代黃素的方法，對目標(biāo)物穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，優(yōu)化提取溶劑及凈化方式，同時優(yōu)化色譜條件，提高目標(biāo)物的回收率及方法穩(wěn)定性。該方法的建立為有效遏制大黃魚中硫代黃素的非法添加行為和產(chǎn)品安全風(fēng)險預(yù)警提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（配備Waters 2998二極管陣列檢測器，美國Waters公司）；AB204-S型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB-800DTD型超聲波清洗器（中國寧波新芝生物科技股份有限公司）；3-18K型冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；Milli-Q超純水制備器（美國MILLIPORE公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；XBridge C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國Waters公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：硫代黃素（純度≥99%，天津阿爾塔科技有限公司）。甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

大黃魚樣品（均為市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg）硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用80%乙腈水（V/V）溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，轉(zhuǎn)移至密閉棕色容器中，置于4 ℃冰箱中避光貯存。

將硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用80%乙腈水（V/V）逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.05，0.1，0.2，1，5，10，20和50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，轉(zhuǎn)移至密閉棕色容器中，置于4 ℃冰箱中避光貯存。

1.2.2 樣品前處理過程

稱取2 g（準(zhǔn)確至0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 80%乙腈水（V/V）溶液，渦旋混勻，超聲提取15 min；加入10 mL乙腈飽和正己烷，振搖1 min后，按8 000 r/min離心5 min，取下層清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱Waters? XBridge（3.5 μm，150 mm×4.6 mm）。流動相：A甲醇，B 0.02%甲酸水；采用梯度洗脫程序，梯度條件見表1。流速0.8 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；檢測波長418 nm；柱溫35 ℃。

表1 流動相梯度程序

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過與儀器配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集與處理，采用Origin 8.5分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫代黃素穩(wěn)定性考察

正確配制標(biāo)準(zhǔn)溶液是保證試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的前提。在硫代黃素檢測過程中，研究發(fā)現(xiàn)用水配制的硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)中間液12 h內(nèi)響應(yīng)面積降低明顯，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)，影響試驗結(jié)果。同時，這種現(xiàn)象也可能會導(dǎo)致試驗前處理過程中硫代黃素回收率失真，試驗結(jié)果準(zhǔn)確度降低。因此，對不同配制試劑中的硫代黃素的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，保證試驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

硫代黃素作為一種堿性苯并噻唑類化合物，在水中的穩(wěn)定性可能與其pKa有關(guān)，分別用不同pH的水溶液配制10 μg/mL水平的硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)工作液，對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果顯示：硫代黃素在堿性水溶液中不穩(wěn)定，在4 ℃冰箱內(nèi)儲存一周后響應(yīng)面積降低20%；在pH 2～7的水溶液中較穩(wěn)定，響應(yīng)面積無明顯變化。基于部分液相色譜儀的進(jìn)樣系統(tǒng)無法實現(xiàn)控溫的條件，進(jìn)一步比較室溫下硫代黃素在pH 2～7范圍內(nèi)的水溶液中的穩(wěn)定性。如圖2所示，硫代黃素在pH 2條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。通過對硫代黃素結(jié)構(gòu)（圖1）分析可以看到，其結(jié)構(gòu)為2-苯并噻唑環(huán)與1個對二甲氨基苯基相連，推測可能是在一定的pH范圍內(nèi)2-苯并噻唑環(huán)處容易開環(huán)降解，造成其在不同pH下的穩(wěn)定性不同，而低溫可能會延緩其降解過程。

圖2 不同pH水溶液中硫代黃素含量變化圖

pH過低會影響色譜柱的使用壽命，考慮到色譜柱的pH耐受性，試驗考察乙腈-水中的硫代黃素的穩(wěn)定性，對超純水，20%，50%和80%（V/V）乙腈水溶液，純乙腈配制的硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)液48 h內(nèi)的響應(yīng)面積進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。乙腈比例高于50%的硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)液均穩(wěn)定。分析原因是乙腈本身不易解離，有利于硫代黃素中苯并噻唑環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，因此，乙腈比例高時硫代黃素呈現(xiàn)穩(wěn)定的狀態(tài)。由于純乙腈配制的硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)液在液相色譜分析中存在溶劑效應(yīng)，出現(xiàn)峰變形的現(xiàn)象，最終采用80%乙腈水溶液配制硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)液。

圖3 不同比例乙腈水溶液中硫代黃素含量變化圖

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的選擇

比較Waters? XBridge C18（3.5 μm，150 mm×4.6 mm），Waters Atlantis T3（5 μm，150 mm×4.6 mm）和Phenomenex Titank C18（5 μm，150 mm×4.6 mm）3種色譜柱對分離效果的影響。結(jié)果顯示，在相同的色譜條件下Atlantis T3、Titank C18對目標(biāo)物保留較強，出峰時間較晚，導(dǎo)致分析時間延長，易產(chǎn)生殘留。最終選擇XBridge C18色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

對不同流動相體系進(jìn)行研究，比較甲醇-水、甲醇-20 mmol/L醋酸銨、甲醇-0.01%甲酸水溶液、甲醇-0.02%甲酸、甲醇-0.05%甲酸溶液對目標(biāo)物分離情況。結(jié)果顯示：甲醇-水的流動相出峰較晚，且拖尾嚴(yán)重，對稱因子為1.56。在水相中加入醋酸銨后，出峰時間明顯縮短，但仍存在拖尾現(xiàn)象，對稱因子為1.46。在水相中加入甲酸后能夠縮短出峰時間，甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.01%存在拖尾，甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.02%和0.05%時峰形得到改善，峰形尖銳，對稱性好，兩者響應(yīng)峰面積無明顯區(qū)別，考慮甲酸體積分?jǐn)?shù)過高影響色譜柱壽命，因此選擇甲醇-0.02%甲酸作為流動相。

2.2.3 檢測波長的選擇

硫代黃素經(jīng)液相色譜分離，二極管陣列檢測器掃描檢測，在200～500 nm范圍內(nèi)測定硫代黃素的吸光度，得到的紫外光譜圖如圖4所示。硫代黃素的最大吸收峰為418 nm，在該條件下，可獲得較高的靈敏度，特異性好，可獲得較好基線及較少干擾，選擇418 nm作為定量的檢測波長。

圖4 硫代黃素在200～500 nm范圍內(nèi)的光譜圖

2.3 前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

分別考察乙腈、甲醇、水作為提取溶劑對目標(biāo)物的提取效率，結(jié)果表明以純水作為提取溶劑，目標(biāo)物的回收率約為20%，且提取液渾濁，樣品凈化困難，不適用于大黃魚高蛋白基質(zhì)的處理。乙腈和甲醇都具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，但純乙腈或甲醇易使蛋白質(zhì)快速凝結(jié)成團(tuán)，不利于目標(biāo)物的釋放，向提取液中加入一定比例水相會提高樣品分散程度，有利于目標(biāo)物的提取。因此，比較不同配比甲醇-水、乙腈-水溶液的提取效果。同一配比下，乙腈的提取效果比甲醇好。分析原因是甲醇和乙腈沉淀蛋白的效率和分子量不同，針對大黃魚中的蛋白質(zhì)種類，乙腈沉淀蛋白的效果比甲醇好，更具有選擇性，使得硫代黃素更容易同基質(zhì)釋放出來。乙腈比例高于50%，均可達(dá)到較好的回收率，回收率在90%以上。采用80%乙腈水作為提取劑時目標(biāo)物的回收率最高，達(dá)到95%左右；有機(jī)相比例低于50%時，回收率開始下降，可能與硫代黃素在溶劑中的存在形式有關(guān)。樣品經(jīng)80%乙腈水（V/V）提取，蛋白沉淀效果好，提取液更澄清，回收率高，因此選擇80%乙腈作為提取溶劑。

圖5 不同提取溶劑對硫代黃素回收率的影響

2.3.2 提取體積及次數(shù)的優(yōu)化

對提取次數(shù)和提取體積進(jìn)行優(yōu)化。以80%乙腈水作為提取溶劑，提取體積分別為10，20和25 mL，提取次數(shù)為1次的結(jié)果表明，提取體積10 mL時的回收率為90%，提取體積增大到20 mL時，回收率有所升高，進(jìn)一步增大提取體積后提取效率無明顯變化。考慮到經(jīng)濟(jì)成本，選擇用20 mL 80%乙腈水（V/V）進(jìn)行提取。進(jìn)一步對提取次數(shù)進(jìn)行考察，增加提取次數(shù)，回收率無明顯提高，基于節(jié)約時間成本的角度，選擇提取次數(shù)為1次。

2.3.3 凈化方式的比較

針對大黃魚高蛋白、高脂肪的的復(fù)雜基質(zhì)，分別考察亞鐵氰化鉀-乙酸鋅、氫氧化鈉-硫酸鋅、乙腈3種沉淀蛋白的凈化方式。由圖6可見，前2種凈化方法的回收率較低，回收率低于10%，推測原因可能是2組無機(jī)鹽沉淀劑對目標(biāo)物存在吸附現(xiàn)象，或提取液的pH對硫代黃素的穩(wěn)定性影響較大。第3種凈化方式樣品經(jīng)水分散，乙腈沉淀蛋白后，可獲得較高水平的回收率。

圖6 不同凈化方式硫代黃素回收率的比較

為清除基質(zhì)中的脂肪類雜質(zhì)，利用乙腈飽和正己烷除脂，除脂后的樣品溶液更加澄清，且除脂前后回收率無明顯差別，能夠保證較高而穩(wěn)定的回收率。因此，選用乙腈水提取目標(biāo)物，乙腈飽和正己烷除脂，達(dá)到對樣品凈化的目的。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 線性范圍、檢出限和定量限

取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用80%乙腈水（V/V）稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為0.05，0.1，0.2，1，5，10，20和50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。將系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度從低到高的順序，按1.2.3液相色譜條件進(jìn)行測定，以硫代黃素峰面積（Y）對其質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法，以信噪比S/N=10得到目標(biāo)物的定量限（SLOQ），以信噪比S/N=3得到目標(biāo)物的檢出限（SLOD）。硫代黃素在0.5～50 μg/mL之間線性關(guān)系良好，線性回歸方程為Y=6.11×104X-2.32×103，線性相關(guān)系數(shù)（R）大于0.999，SLOD為0.2 mg/kg，SLOQ為0.5 mg/kg。硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖以及陰性加標(biāo)試樣色譜圖見圖7和圖8。

圖7 硫代黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/mL）色譜圖

圖8 陰性加標(biāo)試樣（5 mg/kg）色譜圖

2.4.2 回收率和精密度

采取向大黃魚空白樣品中添加低（0.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、高（5 mg/kg）3個加標(biāo)水平，每個濃度水平平行測定6次，得到方法的回收率及精密度，見表2。在GB/T 27404—2008檢測方法的確認(rèn)要求中規(guī)定，加標(biāo)量在1～100 mg/kg，回收率范圍為90%～110%[15]。該方法3個濃度水平的加標(biāo)回收率在91.6%～97.8%。GB/T 27404—2008中實驗室內(nèi)變異系數(shù)隨待測組分含量的減小而增加，待測組分含量10 mg/kg時，實驗室內(nèi)變異系數(shù)為7.5%[15]。該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～2.1%。結(jié)果表明，方法的回收率和精密度均滿足標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 方法的回收率及精密度（n=6）

2.5 實際樣品測定

應(yīng)用所建方法對市售20批次大黃魚樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢出硫代黃素，今后可持續(xù)跟進(jìn)大黃魚中非法添加的監(jiān)測。

3 結(jié)論

試驗建立大黃魚中硫代黃素的高效液相色譜定性定量方法，對提取溶劑、凈化方式及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。同時對硫代黃素穩(wěn)定性進(jìn)行系統(tǒng)性考察，從而保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確度。該方法的前處理只需乙腈水超聲提取，乙腈飽和正己烷除脂，簡單快速，同時出峰時間短，準(zhǔn)確度、精密度等符合要求，適用于大黃魚中硫代黃素的快速測定，能夠更好地為此類產(chǎn)品的市場監(jiān)管提供服務(wù)。