實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)鴨血制品中摻假成分

李美桃，張春鵬，王波

徐州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心（徐州 221000）

動(dòng)物血制品是我國(guó)常見的食物原料，鴨血營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、食用功效好，但價(jià)格明顯高于豬血、雞血等同類食品。鴨血制品以新鮮血液為原料，經(jīng)過過濾、攪拌升溫、脫氣、脫味、灌裝、添加輔料、封口、滅菌等工藝后形成暗紅色豆腐樣形態(tài)。普通消費(fèi)者難以通過外觀、色澤來區(qū)分鴨血和其他血液食品，部分商家為了盈利會(huì)在鴨血中摻雜豬血、雞血、鵝血等，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者利益[1-5]。在鑒別鴨血食品摻假、制假問題中，現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展提供了有力的手段，以DNA為基礎(chǔ)的PCR技術(shù)被廣泛用來鑒定食品中的動(dòng)物源性成分[6-9]。為了初步了解徐州市市售鴨血的摻假情況，試驗(yàn)采集28個(gè)市售鴨血制品樣本，利用實(shí)時(shí)熒光PCR法分別檢測(cè)其鴨、豬、雞、鵝源性成分，判斷樣本的真實(shí)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鴨血，隨機(jī)采集28批徐州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)鴨血樣品。無水乙醇（純度≥99.7%），上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；DNA提取試劑盒、雞源性成分核酸檢測(cè)試劑盒、鴨源性成分核酸檢測(cè)試劑盒、豬源性成分核酸檢測(cè)試劑盒、鵝源性成分核酸檢測(cè)試劑盒，廣州迪澳生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CFX96型實(shí)時(shí)熒光PCR儀（新加坡BIO-RAD公司）；Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）；Vortex-Genie 2渦旋混合器（美國(guó)Scientific Industries）；恒溫水?。ńK金壇市億通電子有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

參考SB/T 10923—2012《肉及肉制品中動(dòng)物源性成分的測(cè)定 實(shí)時(shí)熒光PCR法》中的方法，結(jié)合試劑盒的使用，分別對(duì)樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)用引物及探針序列見表1。

表1 引物及探針序列

1.3.1 DNA的提取與純化

稱取0.1 g鴨血樣品于碾缽中，加入液氮碾磨。碾磨后的樣品按照DNA提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行DNA提取。

1.3.2 擴(kuò)增反應(yīng)

在冰上避光解凍反應(yīng)試劑，解凍后振蕩混勻，以10 000 r/min離心數(shù)秒，然后將反應(yīng)液按每管20 μL分裝至PCR管中，再加入5 μL模板（加樣順序?yàn)殛幮詫?duì)照、待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照），蓋好管蓋，以10 000 r/min離心30 s，將PCR管放置在實(shí)時(shí)熒光PCR儀中。循環(huán)條件：95 ℃，10 min，1個(gè)循環(huán)→95 ℃，15 s，40個(gè)循環(huán)→60 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)（熒光收集位點(diǎn)）。檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct值判定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

以樣品DNA提取液為模板，按照1.3.2所述方法，分別對(duì)28個(gè)樣品進(jìn)行鵝、雞、鴨、豬源性熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增曲線（圖1～圖4）和Ct值（表2）。Ct值是指每個(gè)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。此次試驗(yàn)的閾值線設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照吸光度的1/10。4種動(dòng)物源性熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)的陰性對(duì)照均無Ct值，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性對(duì)照Ct值均小于25，呈“S”型擴(kuò)增曲線。結(jié)果判斷：當(dāng)檢測(cè)樣品無Ct值時(shí)，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴(kuò)增曲線，可報(bào)告樣品陰性；當(dāng)檢測(cè)樣品Ct≤30（雞、鴨、鵝）或Ct≤35（豬）時(shí)，曲線呈“S”型擴(kuò)增曲線，可直接報(bào)告樣品陽(yáng)性；當(dāng)檢測(cè)樣品Ct＞30（雞、鴨、鵝）或Ct＞35（豬）時(shí)，可直接報(bào)告樣品陰性。

圖1 鵝源性成分檢測(cè)

圖2 雞源性成分檢測(cè)

圖3 鴨源性成分檢測(cè)

圖4 豬源性成分檢測(cè)

表2 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

接表2

從圖1～圖4和表2可以看出：28個(gè)樣品中，只檢出鴨成分的樣品有9個(gè)，占總數(shù)的32.1%；同時(shí)檢出3種動(dòng)物源性成分的樣品有1個(gè)，占總數(shù)的3.6%，成分為鵝、雞、鴨；其余樣品中均檢出2種動(dòng)物源性成分，分別為鵝鴨、雞鴨、豬鴨，其中檢出鵝鴨成分的樣品共7個(gè)，占總數(shù)的25.0%，檢出雞鴨成分的樣品共10個(gè)，占總數(shù)的35.7%，檢出豬鴨成分的樣品共1個(gè)，占總數(shù)的3.6%。總計(jì)67.9%的鴨血樣品中摻入了別的動(dòng)物血液。對(duì)部分結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢，檢測(cè)結(jié)果與初檢結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明：市售的鴨血制品中均有鴨成分，未發(fā)現(xiàn)直接以別的動(dòng)物血制品冒充鴨血產(chǎn)品的情況，但在鴨血制品中摻入別的動(dòng)物血液的情況較為普遍，在摻假的鴨血制品中，摻雞血的比例最高，其次是鵝血、豬血。摻假的原因就在于鴨血的“珍貴”。一般動(dòng)物宰殺后的血量相當(dāng)于出肉量的6%，鴨血量少，所以價(jià)格也略高一些。另外，與其他血制品相比，鴨血的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值均更勝一籌。為了降低成本又不被消費(fèi)者發(fā)現(xiàn)，有些不法商販就在鴨血中摻入別的動(dòng)物血液。315晚會(huì)也曾曝光北京餐飲市場(chǎng)出現(xiàn)假鴨血的情況；程逸宇等[2]曾對(duì)南京市場(chǎng)的鴨血制品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨血制品摻假情況較為嚴(yán)重；新浪財(cái)經(jīng)網(wǎng)曾報(bào)道成都4家知名火鍋店因銷售摻假的“假鴨血”被處罰。由此可見，假鴨血的事件不是偶然的、少數(shù)的，而是全國(guó)各地普遍存在的問題。此次試驗(yàn)?zāi)艽笾铝私馕沂续喲破返膿郊偾闆r，為了能更好地服務(wù)于社會(huì)，我們有必要進(jìn)一步加強(qiáng)抽樣檢驗(yàn)工作，更全面了解鴨血制品的質(zhì)量狀況。