“香附-郁金”藥對(duì)治療乳腺增生病的藥理機(jī)制

李璇 劉宇飛 樊英怡 禹堯 余紅 裴曉華

摘要 目的：應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析對(duì)“香附-郁金”藥對(duì)治療乳腺增生病的作用機(jī)制進(jìn)行探討與分析。方法：采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP）對(duì)香附、郁金的有效活性成分進(jìn)行篩選，并提取其作用靶點(diǎn)，再利用GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取乳腺增生病相關(guān)基因。映射疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)，通過STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建關(guān)鍵蛋白之間所產(chǎn)生的相互作用關(guān)系圖;Cytoscape 3.8.0建立“藥物-有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果：共獲得“香附-郁金”藥對(duì)33個(gè)活性成分，包括異鼠李素、槲皮素、豆甾醇等，與疾病潛在靶點(diǎn)取交集后得到88個(gè)共同作用靶點(diǎn)，包括ESR1、EGFR、PGR等，GO分析得到104個(gè)分子功能、41個(gè)細(xì)胞組分和1 262個(gè)生物過程，KEGG通路分析主要涉及119條通路，主要相關(guān)通路為PI3K/AKT信號(hào)通路。結(jié)論：“香附-郁金”藥對(duì)治療乳腺增生病多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用機(jī)制，可能通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)激素內(nèi)分泌水平，從而發(fā)揮治療乳腺增生病的作用，為臨床應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 香附;郁金;乳腺增生病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);藥物活性成分;靶點(diǎn);通路;作用機(jī)制

Abstract Objective：To explore and analyze the mechanism of “Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix” in the treatment of hyperplasia of mammary glands.Methods：The traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform（TCMSP） was used to screen the active ingredients of Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix，and their targets were extracted，and then the related genes of mammary gland hyperplasia were obtained by using the GeneCards database.Mapping disease targets and drug targets，and the STRING online database was used to construct the interaction diagram between key proteins; Cytoscape 3.8.0 established a “drug-active ingredient-target” network diagram，and analyzed the key targets，gene Ontology（GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） enrichment analysis.Results：A total of 33 active ingredients of “Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix” were obtained，including isorhamnetin，quercetin，stigmasterol，etc.，and 88 common targets were obtained after intersecting with potential disease targets，including ESR1，EGFR，PGR，etc.，104 results were obtained from the GO molecular function analysis，41 results from the cellular component analysis，and 1 262 results from the biological process analysis.The KEGG pathway analysis mainly involved 119 pathways，and the main related pathway was the PI3K-AKT signaling pathway.Conclusion：The mechanism of Cyperi Rhizoma-Curcumae Radix in the treatment of hyperplasia of mammary glands is multi-component and multi-target synergy，which may play a role in the treatment of hyperplasia of mammary glands by regulating the hormone endocrine level in human body，and lay a good theoretical foundation for clinical application.

Keywords Cyperi Rhizoma; Curcumae Radix; Mammary gland hyperplasia; Network pharmacology; Target; Pathway; Mechanism of action

中圖分類號(hào)：R285;R282文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.008

乳腺增生病（Hyperplastic Disease of Breast，HDB）是指乳腺導(dǎo)管、乳腺小葉、腺泡上皮、纖維組織的單項(xiàng)或多項(xiàng)良性增生[1]，在臨床上，常伴有一側(cè)或者雙側(cè)周期性加重的乳房脹痛，或者表現(xiàn)為多發(fā)性乳房腫塊，當(dāng)月經(jīng)周期發(fā)生變化之后，也會(huì)出現(xiàn)增大、縮小以及變軟變硬等癥狀[2]，部分會(huì)伴有乳頭溢液。乳腺增生病是臨床上最常見的良性乳腺疾病[3]，女性在30～50歲比較常見[4]，在乳腺疾病中，所占比例達(dá)到了75%，最近幾年，本病發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)，對(duì)患者的工作與日常生活造成了不良影響，如果患者出現(xiàn)非典型增生，癌變率也會(huì)隨之升高。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其病因則是由于卵巢功能失調(diào)、內(nèi)分泌功能紊亂等諸多因素導(dǎo)致的，任何導(dǎo)致性激素（雌激素、孕激素、泌乳素等）或其受體改變的因素均可能增加乳腺增生病的患病風(fēng)險(xiǎn)，如遺傳因素、年齡、月經(jīng)史、孕育史、哺乳史、服避孕藥史、生活習(xí)慣以及精神心理因素等[5-6]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，乳腺增生病屬“乳癖”范疇，臨床以肝郁氣滯型較為多見。癥見憂郁寡歡，心煩易躁;兩側(cè)乳房脹痛，可捫及腫塊，其腫塊常隨情志波動(dòng)而消長(zhǎng);每于經(jīng)前乳頭、乳房脹痛更甚，經(jīng)后可有所緩解;兼有兩脅脹悶，少氣懶言，善嘆息，噯氣頻作，舌質(zhì)淡，苔薄白，脈弦[7-8]。乳頭乳房為肝經(jīng)循行之處，女子以肝為先天，肝藏血、主疏泄、體陰而用陽，易于怫郁。乳癖屬肝氣郁滯者，每多有性情抑郁，憂思多慮或心煩急躁易怒，胸悶噯氣，而乳房疼痛與腫塊大小變化，亦多與情緒變化有關(guān)。乳癖以乳房疼痛及腫塊為主癥，肝郁氣滯，肝失條達(dá)，致使血行不暢，乳絡(luò)閉阻，氣滯血瘀，不通則痛。經(jīng)前沖任血液充盈，乳房腫痛加重，月經(jīng)后氣血得到疏泄，腫痛則減輕，故治療中疏肝理氣、活血化瘀尤為重要[1]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)以疏肝活血為主的中藥復(fù)方治療乳腺增生病具有較好的臨床療效，比如：周柏林[9]使用逍遙貝蔞散（瓜蔞15 g、浙貝母10 g、郁金12 g、白術(shù)12 g、香附10 g等），崔紅海等[10]使用補(bǔ)腎疏肝活血散結(jié)湯（熟地黃30 g、枸杞子15 g、郁金10 g、柴胡10 g、香附10 g等），田新民[11]自擬疏肝活血散結(jié)法（柴胡10 g、香附12 g、丹參12 g、郁金15 g等）治療乳腺增生病療效顯著，這類方劑均含有“香附-郁金”藥對(duì)，因此本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法，探索“香附-郁金”藥對(duì)乳腺增生病的潛在作用機(jī)制，在對(duì)乳腺增生病進(jìn)行治療時(shí)，主要對(duì)其信號(hào)通路與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分篩選和作用靶點(diǎn)的收集

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），TCMID（https：//bigd.big.ac.cn/databasecommons/database）、TCM@Taiwan（http：//tcm.cmu.edu.tw/）對(duì)本研究有關(guān)的化學(xué)成分進(jìn)行檢索，所設(shè)定的篩選條件即為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，以及類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18，篩選出香附、郁金的有效化合物，并獲得對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中，實(shí)現(xiàn)以上靶點(diǎn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 收集疾病相關(guān)基因

以“Hyperplasia of mammary glands”“Breast hyperplasia”“Mammary hyperplasia”作為檢索詞匯，通過GeneCard數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）進(jìn)行搜索，從而檢索乳腺增生病相關(guān)基因。

1.3 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及靶點(diǎn)映射

通過映射疾病靶點(diǎn)與藥物預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)得出香附-郁金治療乳腺增生病所產(chǎn)生的作用靶點(diǎn)，繪制韋恩圖;應(yīng)用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行操作，建立香附-郁金活性成分-乳腺增生病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于各個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）來說，指的是基因、分子或者蛋白，各節(jié)點(diǎn)之間的連接（edge），表示中藥成分及其作用靶點(diǎn)之間所產(chǎn)生的關(guān)系[12-13]。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將香附-郁金治療乳腺增生病的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）進(jìn)行分析，從而建立與之相匹配的PPI網(wǎng)絡(luò)。再運(yùn)用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，進(jìn)一步篩選關(guān)鍵蛋白。

1.5 生物過程與通路分析

通過R語言對(duì)香附-郁金治療乳腺增生病核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，獲得GO富集分析結(jié)果（P<0.05）及KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果（P<0.05）。

2 結(jié)果

2.1 “香附-郁金”藥對(duì)主要活性成分

通過TCMSP檢索出香附104個(gè)化學(xué)成分、郁金222個(gè)化學(xué)成分。根據(jù)閾值設(shè)定OB≥30%，DL≥0.18，共篩選出33個(gè)主要化學(xué)成分，其中香附18個(gè)，郁金15個(gè)。見圖1，表1。檢索香附-郁金的33個(gè)主要成分的靶點(diǎn)蛋白，可獲取唯一靶點(diǎn)蛋白質(zhì)，共計(jì)為108個(gè)。

2.2 香附-郁金治療乳腺增生的作用靶點(diǎn)及核心活性成分

在GeneCards數(shù)據(jù)庫中，獲取的乳腺增生病相關(guān)靶點(diǎn)基因共計(jì)4 259個(gè)。將香附-郁金的108個(gè)潛在作用靶點(diǎn)和GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取的4 259個(gè)疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得出香附-郁金治療乳腺增生病所產(chǎn)生的共同作用靶點(diǎn)，總計(jì)88個(gè)。見圖2。通過Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。見圖3。

2.3 香附-郁金治療乳腺增生病關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI分析

在線STRING 11.0數(shù)據(jù)庫上傳共有靶點(diǎn)，最高置信度蛋白質(zhì)參數(shù)評(píng)分值>0.9，形成與之相匹配的PPI網(wǎng)絡(luò)。見圖4。通過count值降序分析前30位的關(guān)鍵靶點(diǎn)。見圖5。利用Cytoscape 3.8.0軟件分析，以DC≥20及DC≥23為篩選條件，得到關(guān)鍵基因的拓?fù)浞治鰣D。見圖6。

2.4 GO功能富集分析

GO富集分析結(jié)果包括分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞組分（Cell Component，CC）和生物過程（Biological Process，BP）。在GO功能富集分析中，設(shè)定P<0.05，顯示104個(gè)MF，包括DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性，RNA聚合酶Ⅱ特異性（RNA polymerase Ⅱ-specific，GO：0001228）、泛素蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin protein ligase binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding，GO：0044389，GO：0031625）;41個(gè)CC，包括膜筏（membrane raft，GO：0045121），膜微區(qū)（membrane microdomain，GO：0098857），膜區(qū)（membrane region，GO：0098589）;1 262個(gè)BP，包括對(duì)類固醇激素的反應(yīng)（response to steroid hormone，GO：0048545）、對(duì)金屬離子的響應(yīng)（response to metal ion，GO：0010038）、對(duì)輻射的反應(yīng)（response to radiation，GO：0009314）。見圖7。

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG分析得出與香附-郁金治療乳腺增生病的相關(guān)信號(hào)通路共計(jì)119條。根據(jù)count選取排名前20的信號(hào)通路。見圖8。結(jié)果顯示香附-郁金治療乳腺增生病的信號(hào)通路主要與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)。見圖9。

3 討論

“香附-郁金”是中醫(yī)疏肝活血的經(jīng)典藥對(duì)，其中香附，味辛、微苦、微甘，性平[14]，歸肝、脾、三焦經(jīng)，具有行氣解郁止痛的功效。主治肝郁氣滯所致胸脅及脘腹脹痛、乳房脹痛、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)等。《本草綱目》稱之為“氣病之總司，女科之主帥”[15]。郁金，味辛、苦，性寒，歸肝、心、肺經(jīng)，具有活血止痛，行氣解郁，清心涼血的功效[16]，主治氣滯血瘀痛證。香附可通十二經(jīng)，行血中之氣，對(duì)于調(diào)氣解郁十分有效。然香附行氣有余，且活血之力不足，應(yīng)用郁金之性味辛香能活血祛瘀、行氣開郁以為助，將取得更顯著的治療效果。蓋香附行氣以活血，郁金則活血以行氣，二者合用，相輔相成，共奏疏肝解郁，活血理氣之效。

在本研究中，分析獲得香附-郁金的主要有效成分包括異鼠李素、槲皮素、豆甾醇、β-谷固醇、山柰酚等。

谷甾醇、豆甾醇屬植物甾醇，在甾醇類的作用下，能夠?qū)⒁恍┤橄偌?xì)胞在細(xì)胞分裂DNA合成期停留，對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[17-20]。植物甾醇能夠增強(qiáng)人外周血液淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，從免疫抑制的方向避免乳腺增生的進(jìn)一步發(fā)展和乳腺癌的發(fā)生[21]。

異鼠李素是一種黃酮類藥物，不僅可以同自噬/有絲分裂抑制劑結(jié)合后促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且還能通過抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)生細(xì)胞毒性、增加氧化應(yīng)激、阻滯細(xì)胞周期、抑制乳腺細(xì)胞的增殖，達(dá)到治療乳腺疾病的作用[22-23]。

山柰酚屬黃酮類黃酮醇亞屬，有研究證實(shí)黃酮醇參與了EGFR/PI3K/AKT、Notch1/PI3K/AKT等多條信號(hào)通路，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，達(dá)到阻滯細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[24]。山柰酚能顯著減少腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的表達(dá)且呈劑量依賴性，從而緩解乳腺的增生程度[25]。

槲皮素是一種類雌激素樣活性的天然植物激素，其結(jié)構(gòu)與雌二醇（E2）相似，可以與雌激素受體（ER）結(jié)合，調(diào)節(jié)激素水平，并通過下調(diào)抗凋亡因子Bcl-2及上調(diào)促凋亡因子Bax、Bak的表達(dá)調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[26-28]。

PPI分析發(fā)現(xiàn)，存在緊密相互作用關(guān)系的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括雌激素受體1（ESR1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、孕激素受體（PGR）等。ER的過度表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)纖維出現(xiàn)增生，使乳腺上皮細(xì)胞的修復(fù)能力減弱，孕激素受體過度表達(dá)會(huì)引起乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)的改變，激活特異性生長(zhǎng)因子，使乳腺上皮細(xì)胞對(duì)孕激素的應(yīng)答出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響乳腺組織的復(fù)舊，所以雌孕激素不平衡引起乳腺結(jié)構(gòu)紊亂導(dǎo)致乳腺增生[29]。雌激素受體編碼ERα蛋白，在結(jié)合雌激素之后，對(duì)激素水平進(jìn)行調(diào)節(jié)[30]，健康的乳腺腺上皮細(xì)胞中所產(chǎn)生的信號(hào)通路，與其配體共同結(jié)合之后，將會(huì)對(duì)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生刺激作用，并且影響到乳腺腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)以及凋亡等過程[31]。孕激素受體與孕激素相結(jié)合后，形成孕激素-孕激素受體復(fù)合物，并生成同源二聚體，結(jié)合啟動(dòng)因子并激活孕激素基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致正常乳腺細(xì)胞生物學(xué)特性的改變[32]。EGFR基因與雌激素分泌相關(guān)，張珺等[33]通過探索疏肝中藥治療乳腺增生病的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，通過抑制EGFR/STAR3信號(hào)通路，能同時(shí)對(duì)體內(nèi)雌激素的分泌進(jìn)行抑制，從而起到逆轉(zhuǎn)阻斷乳腺非典型增生的效果，促使其恢復(fù)至常態(tài)。

分析發(fā)現(xiàn)，GO功能主要集中在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄以及激素受體結(jié)合等方面。而KEGG通路富集結(jié)果中關(guān)鍵的作用通路是PI3K/AKT信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)雌激素具有調(diào)控作用，研究表明，AKT介導(dǎo)的ERα磷酸化在沒有配體的情況下也能增強(qiáng)ERα轉(zhuǎn)錄活性和ERα靶基因的轉(zhuǎn)錄[34]，從而造成內(nèi)分泌環(huán)境紊亂，導(dǎo)致乳腺增生[35]。PI3K的異常激活可繼發(fā)下游靶標(biāo)AKT磷酸化激活，AKT的持續(xù)激活可引起正常乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制其凋亡，并激活下游mTOR的活性，促進(jìn)乳腺細(xì)胞增殖[36-37]。除了調(diào)節(jié)ERα外，PI3K/AKT信號(hào)通路還顯示出對(duì)ERβ的調(diào)節(jié)作用，Sanchez等[38]證明，AKT能夠在其Ser255殘基的鉸鏈區(qū)內(nèi)磷酸化小鼠ERβ，且這種磷酸化能通過抑制AKT與已知的ERβ輔因子CBP的相互作用來抑制ERβ轉(zhuǎn)錄活性[39]。此外，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1，其與雌激素轉(zhuǎn)錄活性協(xié)同作用，激活雌激素信號(hào)通路。

經(jīng)進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)，許多相關(guān)實(shí)驗(yàn)佐證上述研究結(jié)論。蔣寶響等[40]在香舒丸對(duì)乳腺增生病作用及性激素調(diào)節(jié)機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，含有香附的香舒丸能顯著改善乳腺增生病模型大鼠的乳腺組織病理變化，顯著降低血清中雌二醇、泌乳素及乳腺組織中ERα、PR的表達(dá)，顯著升高血清中孕酮及乳腺組織中ERβ的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)模型病理指標(biāo)，提示香舒丸具有調(diào)節(jié)乳腺上游激素、抑制乳腺上皮增生、抑制乳腺內(nèi)血管生成的作用。錢夢(mèng)等[41]在觀察柴胡疏肝散對(duì)大鼠乳腺的作用中發(fā)現(xiàn)，柴胡疏肝散具有減輕肝郁證模型大鼠乳腺增生樣變的作用，而且還有抑制乳腺增生樣變進(jìn)一步發(fā)展為過度增殖、非典型增生的作用。李蜀平等[42]在郁金乳癖丸的藥效學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，含有香附郁金的郁金乳癖丸對(duì)注射苯甲酸雌二醇致大鼠雌激素水平增高和對(duì)大鼠乳腺組織增生有抑制作用，使乳腺腺泡數(shù)量和乳腺直徑顯著性降低，降低乳腺增生大鼠血清中雌二醇和孕酮含量。

綜上所述，“香附-郁金”藥對(duì)治療乳腺增生病的過程涉及了多個(gè)活性成分、作用靶標(biāo)及生物過程，其作用機(jī)制復(fù)雜多樣，并非只由單個(gè)成分、單個(gè)靶標(biāo)或單個(gè)通路發(fā)揮作用。本研究觀點(diǎn)認(rèn)為，“香附-郁金”藥對(duì)可能是主要通過調(diào)節(jié)人體內(nèi)激素內(nèi)分泌水平，從而發(fā)揮治療乳腺增生病的作用，整體上預(yù)測(cè)了“香附-郁金”藥對(duì)的活性成分及其在乳腺增生病中的分子機(jī)制，并探索了多種潛在的治療靶點(diǎn)。因此，本研究為進(jìn)一步研究乳腺增生病的分子機(jī)制提供了方向，為“香附-郁金”藥對(duì)指導(dǎo)臨床應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

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（2020-11-02收稿 本文編輯：楊覺雄）