3-氨基苯硼酸聯(lián)合乙二胺四乙酸碳青霉烯酶抑制增強(qiáng)試驗(yàn)檢測腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的研究

周銀娣，郭 燕張 琴，韓仁如胡付品

腸桿菌目細(xì)菌是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌，產(chǎn)超廣譜β 內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶是其對β 內(nèi)酰胺類抗菌藥物的主要耐藥機(jī)制[1]。碳青霉烯類是目前臨床上治療多重耐藥腸桿菌目細(xì)菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。但隨著該類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌（CRE）尤其是耐藥肺炎克雷伯菌（CR-KPN）的檢出率呈快速上升趨勢。由于CRE 菌株往往表現(xiàn)為廣泛耐藥特征，導(dǎo)致其所致感染的高病死率。文獻(xiàn)報(bào)道，我國臨床上分離的CRE 菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶的種類多，對碳青霉烯類的水解能力亦有較大的差異。由于不同酶抑制劑復(fù)合制劑對產(chǎn)不同類型碳青霉烯酶菌株的抑制能力不同，故不同類型碳青霉烯酶菌株感染的臨床治療方案也不盡相同[2]。因此，為應(yīng)對碳青霉烯類耐藥革蘭陰性桿菌所致感染帶來的挑戰(zhàn)，喻華等[3]的《腸桿菌目細(xì)菌碳青霉烯酶的實(shí)驗(yàn)室檢測和臨床報(bào)告規(guī)范專家共識(shí)》倡議，要求采用一種3-氨基苯硼酸（PBA）聯(lián)合乙二胺四乙酸（EDTA）碳青霉烯酶增強(qiáng)試驗(yàn)對CRE 菌株的產(chǎn)酶機(jī)制進(jìn)行檢測并將檢測結(jié)果向臨床報(bào)告。為此，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院抗生素研究所對已用分子生物學(xué)方法明確基因型的部分CRE 菌株采用PBA 聯(lián)合EDTA 協(xié)同試驗(yàn)檢測細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶，此方法亦稱碳青霉烯酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)（簡稱PBA-EDTA），并與近年來CLSI 推薦的改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（mCIM-eCIM 法）[4]對臨床分離的CRE 菌株產(chǎn)生的碳青霉烯酶檢測符合率進(jìn)行了比較，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 研究的275 株受試菌均為抗生素研究所菌種庫2017—2018 年經(jīng)PCR 及DNA 測序明確為產(chǎn)碳青霉烯酶的非重復(fù)CRE 保存菌株，其相關(guān)特性見表1。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705。

表1 經(jīng)分子生物學(xué)檢測的275 株產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌在腸桿菌目細(xì)菌中的分布Table 1 Prevalence of carbapenemase genes in 275 nonduplicate strains of Enterobacterales species by molecular test n（%）

1.1.2 主要試劑和抗菌藥物紙片 美羅培南紙片為英國OXOID 商品，紙片藥物含量為10 μg/片，碳青霉烯酶抑制劑試劑盒購于珠海迪爾生物工程有限公司，內(nèi)含EDTA 和PBA，每次使用量為10 μL/片，規(guī)格為 1 mL/瓶。

1.2 方法

1.2.1 PBA-EDTA 法 按Tsakris 等[5]2010 年 描述的PBA-EDTA 法操作步驟進(jìn)行：將受試菌調(diào)節(jié)成0.5 麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，均勻涂布于紙片法藥敏試?yàn)MH 瓊脂平板上，每個(gè)平板貼4 張不同成分的美羅培南紙片，分別為單純美羅培南（MER，細(xì)菌耐藥對照）、美羅培南加PBA（10 μL）、美羅培南加EDTA（10 μL）、美羅培南加PBA 加EDTA。見圖1?？諝猸h(huán)境、35℃±2℃孵育16～18 h。判讀標(biāo)準(zhǔn)為：PBA+MER 或EDTA+MER 或PBA+EDTA+MER 的抑菌圈直徑比單藥美羅培南的抑菌圈直徑擴(kuò)大≥5 mm 者，分別判讀為該受試菌為產(chǎn)A 組碳青霉烯酶或產(chǎn)B 組碳青霉烯酶；同時(shí)產(chǎn)A組和B 組復(fù)合碳青霉烯酶；如抑菌圈直徑擴(kuò)大＜5 mm 者，則判斷該菌不產(chǎn)A 組或B 組碳青霉烯酶[6]。此方法中的美羅培南紙片可以用亞胺培南（10 μg/片）紙片替代（摩根菌科細(xì)菌除外）。

1.2.2 mCIM-eCIM 法 CLSI 描述[7]mCIM 可以檢測腸桿菌目和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，但不能對檢測陽性的菌株進(jìn)行碳青霉烯酶相關(guān)金屬酶和絲氨酸酶的定性，但 mCIM-eCIM 聯(lián)合后可以在mCIM 檢測產(chǎn)酶陽性的基礎(chǔ)上結(jié)合eCIM 檢測的結(jié)果將檢測的酶型進(jìn)一步檢測分類定性，操作步驟為：準(zhǔn)備2 管胰蛋白大豆肉湯（TSB），每管體積2 mL，其中一管加入一張10 μg/片美羅培南紙片和1 μL 接種環(huán)一環(huán)受試菌懸液，另一管加入一張10 μg/片美羅培南紙片和1 μL 受試菌懸液和20 μL 0.5 mol/L EDTA，空氣環(huán)境、35℃±2℃孵育4 h±15 min；將哥倫比亞血瓊脂平板上生長的美羅培南敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922 調(diào)節(jié)成0.5 麥?zhǔn)蠞岫染鷳乙?，均勻涂布于紙片法藥敏試?yàn)MH 瓊脂平板上，將2 管TSB 中的美羅培南紙片取出貼在MH 瓊脂平板上，CLSI 稱mCIM-eCIM為改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)。根據(jù)EDTA 可以抑制MβL（金屬碳青霉烯酶）的原理，如受試菌株產(chǎn)MβL 酶，加入EDTA 抑制劑后可以抑制相應(yīng)的酶，則可使碳青霉烯類（美羅培南）抑菌圈直徑比未加入EDTA 時(shí)擴(kuò)大，如圖2 所示：如mCIM 檢測結(jié)果陽性（抑菌圈直徑在6～15 mm 或在16～18 mm 抑菌圈內(nèi)存在針尖樣菌落）提示菌株為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株；eCIM 結(jié)果判讀在mCIM 結(jié)果陽性基礎(chǔ)上，如果eCIM 紙片抑菌圈直徑較mCIM 紙片抑菌圈直徑擴(kuò)大≥5 mm 者，提示菌株產(chǎn)金屬酶；如果抑菌圈直徑擴(kuò)大＜5 mm 者，提示該菌株產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件，分析PBA-EDTA 法和mCIM-eCIM 法檢測CRE 菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的能力以及兩種方法與分子生物學(xué)檢測的符合率。

2 結(jié)果

2.1 PBA-EDTA 法檢測碳青霉烯酶

PBA-EDTA 法對275 株分子生物學(xué)方法鑒定為產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的檢測陽性率達(dá)87.3%（240株），其中，119 株產(chǎn)KPC 型酶的檢出率為99.2%（118 株），對109 株產(chǎn)金屬酶菌株的檢出率為100%（109 株），對13 株產(chǎn)復(fù)合酶（KPC/NDM）菌株的檢出率為100%（13 株），但未能檢出分子生物學(xué)法檢測并確認(rèn)的34 株產(chǎn)D 組OXA 酶型的菌株。具體檢測符合率見表2。PBA-EDTA 法檢測結(jié)果見圖1。

表2 PBA-EDTA 法對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌275 株的碳青霉烯酶檢測結(jié)果Table 2 Prevalence of carbapenemases in 275 strains of carbapenem-resistant Enterobacterales detected by carbapenemase inhibitor enhancement test using phenylboronic acid（PBA）and EDTA n（%）

2.2 mCIM-eCIM 法檢測碳青霉烯酶

mCIM-eCIM 法檢測產(chǎn)碳青霉烯酶菌株結(jié)果見圖2，與已知的分子生物學(xué)檢測結(jié)果相比，mCIMeCIM 法檢測119 株產(chǎn)KPC 型碳青霉烯酶菌株的陽性符合率為100 %（119 株）；檢測109 株金屬酶的陽性符合率為94.5%（103 株）；檢測D 類酶OXA-232 型的符合率為100%（34 株）；mCIMeCIM 無法有效檢測同時(shí)產(chǎn)NDM 和KPC 型碳青霉烯酶菌株。見表3。

2.3 PBA-EDTA 法與mCIM-eCIM 法檢測結(jié)果比較

對119 株A 組絲氨酸KPC 酶菌株，PBAEDTA 法與mCIM-eCIM 法檢出率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義。109 株B 組金屬酶菌株P(guān)BA-EDTA 法 與mCIM-eCIM 法檢出率，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示χ2和P值分別為3.7 和0.06，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；13 株KPC/NDM 復(fù)合酶型的菌株，PBA-EDTA 法能正確檢測出，但 mCIM-eCIM 法均未能正確檢出。反之對OXA-232 型碳青霉烯酶產(chǎn)生株，mCIM-eCIM 法完全檢出而PBA-EDTA 未能檢出。見表4。

3 討論

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細(xì)菌的發(fā)生率正在逐年上升，據(jù)CHINET 2020 年報(bào)道肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率已經(jīng)上升到21.5%和22.4%；鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率亦已經(jīng)分別達(dá)68.1%和69.0%；而細(xì)菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶正是細(xì)菌對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制[8]。按照Ambler 分類法[9]，此類耐藥酶可以分為3 組：A 組絲氨酸酶，亦稱功能分類2f 組，如最常見的KPC-2、KPC-3 型酶等KPC 酶即為這一組酶；B組金屬β 內(nèi)酰胺酶（MBL），包括NDM、VIM 和IMP；由腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)生的OXA-48 為D 組酶，亦稱功能分類2 d 組，OXA-48 同A 組酶一樣也帶有絲氨酸殘基，此酶有較弱的水解青霉素和碳青霉烯類抗生素的作用，不水解頭孢菌素類，但OXA-48 如果和超廣譜β 內(nèi)酰胺酶（ESBL）、膜孔蛋白缺失協(xié)同作用將導(dǎo)致對碳青霉烯類藥物的高水平耐藥。由于碳青霉烯酶的產(chǎn)生，可直接導(dǎo)致該類耐藥菌株所致感染瀕于無藥可用。因此臨床微生物實(shí)驗(yàn)室如能對耐藥菌賦予兼有耐藥機(jī)制的藥敏試驗(yàn)報(bào)告，將有助于臨床合理用藥，降低病死率，提高治愈率。文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)室如延遲對耐藥菌株諸如產(chǎn)碳青霉烯酶型的診斷報(bào)告，將導(dǎo)致患者死亡率上升[10]，因此快速、準(zhǔn)確的碳青霉烯酶型的診斷十分重要。

目前關(guān)于碳青霉烯酶表型檢測方法，CLSI、商品化的檢測試劑以及文獻(xiàn)均有許多相關(guān)報(bào)道和推薦，大都已為臨床應(yīng)用，但因使用過程中產(chǎn)生的各種弊端，故使用并不廣泛。如2015 年CLSI推薦的一種碳青霉烯酶表型快速檢測方法Carpa NP 試驗(yàn)，由于每次試驗(yàn)需要配制新鮮試劑[11]、且配制過程較為麻煩，還常會(huì)出現(xiàn)無效的檢測結(jié)果。CLSI 2017 年推薦的mCIM 法僅適用于腸桿菌目細(xì)菌和銅綠假單胞菌中的碳青霉烯酶，雖然2018 年又推薦mCIM 聯(lián)合eCIM 法可同時(shí)檢測和區(qū)分腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)生的金屬和絲氨酸碳青霉烯酶，但操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力[12]。商品化的酶免疫層析技術(shù)可同時(shí)檢測KPC、NDM、OXA-48、VIM 和IMP 等多種碳青霉烯酶，但價(jià)格昂貴[13]。近年來新出現(xiàn)的MLADI-TOF MS 涉及CRE 的研究較少，且沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[14]。PCR 是檢測碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)，但目前在基層微生物室普及開展[15]尚有一定困難。

本組資料對275 株已知產(chǎn)碳青霉烯酶基因型的耐藥腸桿菌目細(xì)菌，采用PBA-EDTA 法檢測這些菌株中的碳青霉烯酶及其酶型分類，欲獲取與原分子生物學(xué)方法檢出結(jié)果的符合率，以便在臨床上推廣。此法的原理是利用PBA 抑制A 組絲氨酸碳青霉烯酶，EDTA 抑制B 組金屬β 內(nèi)酰胺酶，兩者聯(lián)合亦可同時(shí)檢測和區(qū)分腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)生的A 組絲氨酸碳青霉烯酶和B 組金屬β 內(nèi)酰胺酶。結(jié)果顯示PBA-EDTA 聯(lián)合檢測275 株碳青霉烯類耐藥菌株的碳青霉烯酶型譜與原菌種分子生物學(xué)鑒定的碳青霉烯酶型譜大致相仿，檢測出的產(chǎn)KPC、MβL 和KPC+MβL 復(fù)合酶的各種酶型的符合率分別為99.2%、100%和100%。采用mCIM-eCIM 法對275 株細(xì)菌的檢出結(jié)果與分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果符合率略高于PBA-EDTA 法相應(yīng)的檢出率，而對MβL 的檢出率略低于PBA-EDTA法相應(yīng)的檢出率，分別為100%和94.5%。雖然有1 株細(xì)菌用PBA-EDTA 法未能檢出，而mCIMeCIM 法可檢測出分子生物學(xué)檢測出的KPC 酶的結(jié)果（分子生物學(xué)檢測分型），但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者檢出結(jié)果與分子生物學(xué)檢出結(jié)果的符合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外mCIM-eCIM 法未能檢測出產(chǎn)KPC+MβL 復(fù)合酶菌株，截然不同于能100%檢測出產(chǎn)復(fù)合酶菌株的PBA-EDTA 法。同樣另有34株產(chǎn)D 組blaOXA-232碳青霉烯酶菌株（分子生物學(xué)檢測分型）可100%（34/34）經(jīng)mCIM-eCIM 法順利地檢出，但PBA-EDTA 法卻未能檢出。mCIMeCIM 法原理是在mCIM 檢測結(jié)果為陽性的基礎(chǔ)上，表示耐藥菌株產(chǎn)生碳青霉烯酶，但不能分類酶型；如果此時(shí)eCIM 法結(jié)果亦為陽性，則意味耐藥細(xì)菌為產(chǎn)B 組金屬酶的菌株，如為陰性結(jié)果則可判別這株細(xì)菌為產(chǎn)絲氨酸酶型菌株。應(yīng)該說明的是本組資料中這34 株分子生物學(xué)檢測為D 組blaOXA-232酶，雖然mCIM-eCIM 法檢出為產(chǎn)酶菌株，但無法將A 組和D 組絲氨酸酶型分類，也就無法明確是產(chǎn)KPC 或OXA 酶，僅是明確為絲氨酸酶產(chǎn)生株。也提示本組資料采用的PBA-EDTA 法雖然不能檢測出34 株D 組OXA 酶，但是能檢測出分子生物學(xué)檢測和確認(rèn)的189 株A 組（2f 組）絲氨酸酶即KPC 酶。

van Dijk 等[16]以及Pournaras 等[6]分別對128株以及189 株臨床分離非重復(fù)腸桿菌目細(xì)菌檢測細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶，亦采用PBA-EDTA 法，并與分子生物學(xué)法比較。van Dijk 等[16]采用分子生物學(xué)方法檢測產(chǎn)KPC 和金屬酶的菌株分別為37 株和31 株，PBA-EDTA 法檢測出35 株 和28 株；Pournaras 等[6]采用分子生物學(xué)方法檢測KPC 和金屬酶分別為60 株和9 株，PBA-EDTA 法檢測出57株和9 株。本研究的符合率與上述文獻(xiàn)報(bào)道大致相仿。但需要注意的是，PBA-EDTA 法不適用于對除腸桿菌目細(xì)菌外的碳青霉烯酶耐藥機(jī)制的檢測。由于銅綠假單胞菌等其他不發(fā)酵糖革蘭陰性菌的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，如銅綠假單胞菌天然產(chǎn)生染色體介導(dǎo)的AmpC 酶，而PBA-EDTA 檢測法中的PBA 可抑制AmpC 酶的活性，可能將導(dǎo)致碳青霉烯酶檢測結(jié)果呈假陰性。此外，mCIM-eCIM法可用于銅綠假單胞菌碳青霉烯酶的檢測。

總體而言，PBA-EDTA 法適宜檢測腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)生的A 組絲氨酸碳青霉烯酶、B 組金屬酶以及同時(shí)產(chǎn)A 組和B 組碳青霉烯酶的菌株；操作較mCIM-eCIM 法簡單易行，不需要對受試菌株進(jìn)行繁瑣的預(yù)處理，結(jié)果易讀；便于臨床微生物實(shí)驗(yàn)室使用和開展腸桿菌目細(xì)菌產(chǎn)生的A 組絲氨酸碳青霉烯酶和B 組金屬酶，對未能檢測酶型的為數(shù)不多的碳青霉烯類耐藥菌株可繼續(xù)開展分子生物學(xué)方法檢測D 組OXA 碳青霉烯酶，為臨床合理使用抗菌藥物精準(zhǔn)治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。