饑餓脅迫對淡水石首魚形體指標(biāo)、肌肉脂肪酸組成及肝臟脂肪代謝基因表達的影響

劉廣翔 宋長友 聞海波 吳寧遠 陳健翔 李紅霞* 徐 跑*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，無錫 214081；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，無錫 214081)

淡水石首魚(Aplodinotusgrunniens)，又名淡水大黃魚，屬鱸形目(Perciformes)，石首魚科(Sciaenidae)，原產(chǎn)于北美洲且終生生活在淡水中[1]。淡水石首魚屬于底棲性魚類，雜食偏肉食性，適應(yīng)性強，具有生長速度快、營養(yǎng)豐富、肉味鮮美、無肌間刺的等優(yōu)點，人工養(yǎng)殖前景廣闊[2]。目前國內(nèi)外有關(guān)淡水石首魚的基礎(chǔ)研究報道比較缺乏。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心自2016年從美國引進淡水石首魚進行養(yǎng)殖及繁育研究。養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，淡水石首魚對人工配合飼料的利用率較為低下，容易受到饑餓脅迫的影響，解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟及腹部易沉積脂肪，影響淡水石首魚生理健康。

近年來，隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的快速發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量不斷提高，但水產(chǎn)品的安全問題日益突出。為降低養(yǎng)殖成本，水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中普遍使用高脂或高糖飼料，導(dǎo)致魚類肝臟和腹部脂肪沉積[3-5]，影響魚體的正常代謝，進而降低免疫及抗氧化性，最終導(dǎo)致生長受阻，嚴(yán)重時導(dǎo)致死亡[6]。肝臟作為魚類主要代謝器官，對維持魚類正常代謝及穩(wěn)態(tài)有重大作用[7]。魚類肝臟脂肪沉積成因較為復(fù)雜，目前認(rèn)為主要是由于飼料中營養(yǎng)素失衡和抗脂肪肝營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏[8]。肝臟脂肪沉積會影響魚體健康，使魚類抵抗力下降[9]。因此為切實解決魚類肝臟和腹部脂肪過度沉積，對于魚類健康養(yǎng)殖具有重要意義。李鈺等[10]通過高脂投喂構(gòu)建斑馬魚營養(yǎng)型脂肪肝探討肝臟代謝變化。此外，已有相關(guān)研究報道饑餓不僅可以降低肝臟脂肪含量[11]，還可以改善魚體肌肉品質(zhì)[12]。脂肪作為儲能最高的營養(yǎng)物質(zhì)，是魚類在饑餓脅迫時主要能量來源[13-14]。饑餓脅迫可以阻斷動物體的外源食物補給，因此在饑餓脅迫下，探討魚類對營養(yǎng)物質(zhì)代謝規(guī)律具有重要意義。

本研究以淡水石首魚為研究對象，主要研究了淡水石首魚在饑餓過程中內(nèi)臟的重量變化、肌肉脂肪酸的變化以及肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的變化，以期對淡水石首魚健康養(yǎng)殖以及建立合理的投喂制度提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心2016年從美國引進第1批淡水石首魚所繁育的子二代苗種。淡水石首魚取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心江陰試驗基地。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

饑餓脅迫試驗在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心(南泉基地)室內(nèi)循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)(規(guī)格為820 mm×700 mm)中進行。試驗魚暫養(yǎng)2月，期間連續(xù)投喂鮮活餌料(活蝦)至表觀飽食，投喂量為魚體總重的3%～5%；選擇活力強、體重均勻淡水石首魚180尾進行餓脅迫試驗，初始平均體重為(20.88±0.91) g，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)60尾；饑餓時間為0、1、4、8、12、24、36、48 h及3、4、6、10、14、21、28、42 d。養(yǎng)殖期間每隔3 d進行換水排污，保持水溫(26±1) ℃，pH 7.2～7.8，溶解氧濃度>6 mg/L，氨氮濃度<0.05 mg/L，饑餓試驗進行42 d，試驗期間不投喂。

1.3 樣品采集

分別在饑餓0、1、4、8、12、24、36、48 h及3、4、6、10、14、21、28、42 d時采集樣本，每個重復(fù)隨機采集3尾，每個饑餓時間點共采集9尾。立即放入含有0.1 mg/L丁香油的水桶中，麻醉后，測量體長、體重。解剖稱量肝重、腹部脂肪重、內(nèi)臟重，取其肝臟，液氮速凍后，放置于-80 ℃，用于脂肪代謝基因表達檢測。取其側(cè)線上、下1 cm左右背部肌肉，置入密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存，用于測定肌肉脂肪酸組成。

1.4 指標(biāo)測定與分析

1.4.1 形態(tài)指標(biāo)測定

肥滿度(CF，g/cm3)=(W/L3)×100；腹脂比(IPF，%)=(Wi/W)×100；肝體比(HSI，%)=(Wh/W)×100；臟體比(VSI，%)=(Wv/W)×100。

式中：W為魚體質(zhì)量(g)；L為魚體長(cm)；Wi為魚腹腔脂肪重(g)；Wh為魚肝臟重(g)；Wv為魚內(nèi)臟重(g)。

1.4.2 肌肉脂肪酸組成測定

肌肉樣品真空冷凍干燥48 h，研磨粉碎，干燥。制備好肌肉樣品采用氯仿∶甲醇∶水=2∶2∶1抽提總脂肪，采用氫氧化鉀-甲醇對脂肪酸甲酯化，再用正庚烷萃取脂肪酸甲酯。樣品經(jīng)皂化甲酯化后，用氣相色譜—質(zhì)譜儀(Agilent 7890B-5977A)進行分析。采用面積歸一化法測定淡水石首魚肌肉樣品脂肪酸組成及含量。

1.4.3 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達測定

用Trizol試劑提取總RNA。提取的RNA使用超微量分光光度計測量吸光度(OD)260/280的比值及RNA濃度，OD260/280比值均在1.80～2.00，RNA可用于cDNA反轉(zhuǎn)錄。

cDNA合成按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(大連TaKaRa有限公司)說明書進行操作。反應(yīng)分2步進行。第1步是去除基因組DNA，反應(yīng)體系：5×g DNA Eraser Buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、RNA 1 μg/μL、補RNA Free dH2O至10 μL，反應(yīng)條件為42 ℃ 2 min，4 ℃。第2步是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系：PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 μL、RNase Free dH2O 4 μL、步驟1反應(yīng)液10 μL，反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃。

試驗所用引物均根據(jù)淡水石首魚三代全長無參轉(zhuǎn)錄組測序所得到的基因序列，采用Primer 5設(shè)計所得。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物信息見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time quantitative PCR

RT-PCR按照PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)(大連TaKaRa有限公司)說明書進行操作?？偡磻?yīng)體系25 μL，其中TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)12.5 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μmol/L、RT反應(yīng)液(cDNA溶液)2 μL、滅菌水8.5 μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。根據(jù)三代全長轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)不同組織之間基因表達量平均值、變異系數(shù)以及差異倍數(shù)篩選候選內(nèi)參基因，制作候選內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定擴增效率，用geNorm等軟件篩選得到泛素折疊修飾蛋白1(ufm1)為相對最適內(nèi)參。本試驗選用ufm1為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26統(tǒng)計分析軟件對使用數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05視為差異顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié) 果

2.1 饑餓時間對淡水石首魚形體指標(biāo)及肌肉粗脂肪含量的影響

由表2可知，試驗期間，淡水石首魚存活率均為100%，體重顯著下降(P<0.05)。饑餓條件下，淡水石首魚肌肉粗脂肪含量下降，其中在饑餓21 d時開始顯著下降；在饑餓21 d以后，肌肉粗脂肪含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 饑餓時間對淡水石首魚體重和肌肉粗脂肪含量(濕重)的影響Table 2 Effects of starvation time on body weight and muscle crude lipid content (wet weight) of A.grunniens

由圖1可知，淡水石首魚的肥滿度、肝體比、臟體比、腹脂比隨饑餓時間增加而下降。統(tǒng)計結(jié)果表明，以饑餓0 d為對照，肥滿度在饑餓48 h內(nèi)沒有顯著差異(P>0.05)，饑餓3 d后顯著降低(P<0.05)，在饑餓4～14 d急劇下降，之后趨于平穩(wěn)(圖1-A)。臟體比在饑餓12 h后開始顯著降低(P<0.05)，饑餓4 d后趨于穩(wěn)定(圖1-B)；肝體比在饑餓48 h后開始顯著降低(P<0.05)，饑餓6 d后趨于穩(wěn)定(圖1-C)；腹脂比在饑餓10 d后顯著降低(P<0.05)，饑餓14 d后后趨于穩(wěn)定(圖1-D)。

2.2 饑餓時間對淡水石首魚肌肉脂肪酸組成的影響

基于上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)饑餓24 h及14、42 d是形體指標(biāo)變化的關(guān)鍵時間點，選取該時間點進行后續(xù)試驗分析。由表3可知，在不同饑餓時間下共檢測到脂肪酸26種，包括8種飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、6種單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)、12種多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)。結(jié)果顯示，隨著饑餓時間增加，SFA含量呈略微下降的趨勢，但無顯著差異(P>0.05)，饑餓14和42 d時，MUFA含量顯著低于饑餓24 h(P<0.05)。PUFA含量在不同饑餓時間差異顯著(P<0.05)，饑餓14和42 d顯著高于饑餓0和24 h(P<0.05)。其中，饑餓42 d時二十碳戊烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)含量均顯著高于其他饑餓時間(P<0.05)，EPA+DHA含量顯著高于其他各饑餓時間(P<0.05)。此外，饑餓42 d時，n-3系列不飽和脂肪酸含量顯著高于其他饑餓時間(P<0.05)；n-6系列飽和脂肪酸含量逐漸升高，饑餓24 h及14、42 d時均顯著高于饑餓0 h(P<0.05)。

數(shù)據(jù)點標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。Value points with different letters mean significant difference (P<0.05).圖1 饑餓時間對淡水石首魚形體指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of starvation time on body indexes of A.grunniens

表3 饑餓時間對淡水石首魚肌肉脂肪酸組成的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of starvation time on fatty acid composition in muscle of A.grunniens (DM basis) %

2.3 饑餓時間對淡水石首魚肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

如圖2可知，饑餓14和42 d顯著提高了過氧化物酶體增殖激活受體α(PPARα)和肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶A(CPT1A)基因相對表達量(P<0.05)(圖2-A，圖2-B)，饑餓24 h及14、42 d顯著提高了?；o酶A氧化酶(ACO)基因相對表達量(P<0.05)(圖2-C)；而饑餓14和42 d時，脂肪酸合成酶(FAS)基因相對表達量顯著降低(P<0.05)(圖2-D)。

圖2 饑餓時間對淡水石首魚肝臟脂肪代謝相關(guān)基因相對表達量的影響Fig.2 Effects of starvation time on relative expression levels of liver lipid metabolism-related genes of A.grunniens

3 討 論

3.1 饑餓時間對淡水石首魚形體指標(biāo)的影響

當(dāng)魚類處于饑餓狀態(tài)時，無法有效地從外界獲取能量物質(zhì)，只能消耗自身貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)維持生命活動，形體指標(biāo)可以直觀地反映自身營養(yǎng)消耗及生長狀況[15-16]。本試驗顯示，淡水石首魚在饑餓42 d時，體重、肥滿度、肝體比、臟體比、腹脂比下降，這與黒鯛幼魚(Acanthopagrusschlegelii)[17]、吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)[18]、彭澤鯽(Carassiusauratusvar.Pengze)幼魚[19]等的研究結(jié)果一致。在饑餓條件下，魚類動用各種貯能器官中能源物質(zhì)的先后順序存在不同[20]。杜震宇等[21]在研究饑餓對鱸(Percafluviatilis)形體指標(biāo)影響中發(fā)現(xiàn)，鱸在饑餓條件下，會首先動用腸系膜脂肪提供能量。鐘金香等[22]研究發(fā)鳙魚(Aristichthysnobilis)在饑餓25 d時會同時動用內(nèi)臟和肝臟中的物質(zhì)提供能量。研究發(fā)現(xiàn)，淡水石首魚(取樣時腹腔存在大量脂肪)在饑餓條件下，淡水石首魚臟體比和肝體比先顯著降低，其中臟體比在饑餓12 h后顯著降低，肝體比在饑餓48 h后顯著降低，且兩者總體降幅相似，而饑餓6 d后腹脂比明顯降低。這表明淡水石首魚在饑餓狀態(tài)下，首先會消耗用內(nèi)臟中殘留食物消化供能，其次再動用肝臟提供能量，最后消耗腹部脂肪供能。鐘金香等[23]研究發(fā)斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)在饑餓時首先動用內(nèi)臟中儲能物質(zhì)，其次動用肝臟中的儲能物質(zhì)，這與本試驗的研究結(jié)果一致。

3.2 饑餓時間對淡水石首魚肌肉脂肪酸組成的影響

肌肉作為魚類主要產(chǎn)品，其營養(yǎng)價值與人類息息相關(guān)。因此分析饑餓脅迫下肌肉脂肪酸組成種類及含量有助于推動淡水石首魚健康養(yǎng)殖以及提供高品質(zhì)魚產(chǎn)品。隨著饑餓時間的延長，肌肉粗脂肪含量逐漸在下降。而在饑餓條件下，魚類對脂肪酸的利用存在一定的規(guī)律，一般優(yōu)先利用SFA，其次利用MUFA，最后利用PUFA[24]。在饑餓狀態(tài)下，鯢(MiichthysmiiuyBasilewsky)幼魚、點帶石斑(Epinepheluscoioides)幼魚和長峭(Octopusminor)優(yōu)先利用SFA，其次利用MUFA，最后利用PUFA[25-27]。然而有些魚類在饑餓條件下對脂肪酸的利用順序存在著一定差異。養(yǎng)殖大黃魚(Larimichthyscrocea)在禁食中，SFA和MUFA含量變化趨勢不明顯，PUFA含量呈下降趨勢[28]。瓦氏黃顙魚(P.vachelli)脂肪酸利用則表現(xiàn)出SFA含量無顯著變化，MUFA含量降低，PUFA含量上升[29]。這說明魚類對脂肪酸的利用因魚的種類、禁食條件等存在差異。本試驗結(jié)果顯示，淡水石首魚在饑餓24 h時，肌肉SFA、MUFA和PUFA含量無顯著變化，這可能是因為饑餓時間太短；饑餓14和42 d時，肌肉SFA含量無顯著變化，MUFA含量顯著降低，PUFA含量顯著上升。這可能是因為SFA和MUFA容易通過線粒體進行β氧化提供能量，而PUFA經(jīng)β氧化需要差向酶和異構(gòu)酶參與[30-32]。此外，PUFA是生物膜、神經(jīng)和視覺系統(tǒng)的重要組成成分，具有比供能更加重要的生物功能而被保留下來[33-35]。在饑餓42 d后，本試驗中肌肉EPA+DHA含量升高，∑n-3PUFA和∑n-6PUFA含量升高，這與點帶石斑幼魚肌肉脂肪酸研究結(jié)果[26]一致。研究結(jié)果表明，饑餓可以改變淡水石首魚肌肉不同類型脂肪酸組成，影響魚產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。

3.3 饑餓時間對淡水石首魚肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

脂肪作為體內(nèi)能量儲存最高的物質(zhì)，維持機體的生命活動至關(guān)重要[36]。為進一步探索淡水石首魚饑餓脅迫過程脂肪代謝變化規(guī)律，對脂肪合成及分解代謝相關(guān)基因表達進行分析。脂肪代謝是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括脂肪的轉(zhuǎn)運、分解、合成。脂肪代謝過程中，有大量的酶及輔助因子參與，還會受到糖代謝、氨基酸代謝的影響，它們之間進行相互調(diào)控，維持著機體的代謝平衡[37]。因此，探討脂肪代謝關(guān)鍵因子在脂肪轉(zhuǎn)運、分解及合成的作用，有助于了解淡水石首魚在饑餓狀態(tài)下脂肪分解代謝的動態(tài)過程。過氧化物酶體增殖激活受體(PPARs)在脂質(zhì)代謝過程中具有重要作用，其中PPARα可以調(diào)節(jié)下游脂肪分解代謝關(guān)鍵因子的表達，參與脂肪代謝[38-40]。肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT)是調(diào)節(jié)體內(nèi)脂肪酸β氧化的關(guān)鍵酶與限速酶，β氧化是體內(nèi)脂肪酸主要分解過程[41]。本試驗結(jié)果顯示，淡水石首魚饑餓24 h時，肝臟PPARα和CPT1A基因相對表達量略微上調(diào)，接著在饑餓14 d以后，PPARα和CPT1A基因相對表達量顯著上調(diào)。這與寧麗軍[42]報道尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)在饑餓3 d開始顯著上調(diào)PPARα和CPT1A基因相對表達的結(jié)果一致。結(jié)果表明，淡水石首魚在饑餓24 h時，魚體暫時可以滿足正常代謝活動所需要的能量，不需要過多的脂肪酸氧化提供能量，因此CPT1A基因相對表達量無顯著變化。在饑餓14 d以后，魚體開始動用脂肪進行供能，此時CPT1A基因相對表達量急劇上升。然而，我們觀察到ACO基因相對表達量在饑餓24 h及14、42 d時無顯著變化，具體原因需要進一步試驗分析。此外淡水石首魚肝臟FAS基因相對表達量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，表明機體內(nèi)脂肪合成代謝也在降低。這與瓦氏黃顙魚[29]、虎龍斑魚[43]報道的結(jié)果一致。上述分析表明，淡水石首魚在饑餓條件下，會激活PPARα，上調(diào)CPT1A基因相對表達量，加速脂肪酸氧化供能，脂肪分解代謝加??；同時FAS基因相對表達下調(diào)，脂肪合成代謝受阻。FAS基因相對表達量下調(diào)表明脂肪酸合成減少，CPT1AS基因相對表達量上調(diào)表明脂肪酸進行β氧化分解增強，從側(cè)面反映了淡水石首魚在饑餓狀態(tài)下肌肉脂肪酸含量的變化。由此推測，在饑餓條件下，脂肪分解代謝增強而合成代謝減弱，導(dǎo)致淡水石首魚肝臟脂肪減少。

4 結(jié) 論

① 饑餓脅迫降低淡水石首魚形體指標(biāo)，如肥滿度、腹脂比、肝體比、臟體比。

② 饑餓脅迫影響淡水石首魚肌肉不同類型脂肪酸組成。

③ 饑餓脅迫促進淡水石首魚脂肪酸氧化供能，抑制脂肪酸合成。