復合菌發(fā)酵豆粕的效果及代謝產物研究

郭萌萌 曹 錫 張 科 楊雨鑫 王小龍 陳玉林*

(1.西北農林科技大學動物醫(yī)學院，楊凌 712100；2.西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100)

豆粕是大豆制油后的一種副產品，粗蛋白質含量在40%以上[1]，氨基酸的組成合理且供應充足，是重要的植物蛋白質資源。但是，豆粕中的蛋白質分子質量較大，還含有大豆抗原蛋白、植酸、低聚糖、胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子，不同程度地影響豆粕的消化和吸收，對動物的健康和生產性能產生了不良的影響[2-3]，限制了對豆粕的利用效率。目前世界范圍內降低豆粕抗營養(yǎng)因子的方法主要包括：熱處理、化學處理、微生物發(fā)酵等[4]。熱處理法主要使用高溫膨化，效果較好但是成本過高，不利于生產推廣；化學處理法主要使用化學試劑處理豆粕原料，但容易導致化學物質的殘留[5-7]。微生物發(fā)酵不但可以有效去除抗營養(yǎng)因子，還能在發(fā)酵的過程中將蛋白質分解成小肽，提高必需氨基酸的比例，提高動物對豆粕的消化吸收率[8]。

本試驗通過在陜西省火地塘林場、紅河谷等地采集的腐殖質及淤泥樣品中篩選的2株蛋白酶活性較高的枯草芽孢桿菌，結合實驗室貯備的3株乳酸菌和3株酵母菌，按不同接種比例進行復合菌發(fā)酵豆粕試驗，以期得到最佳的接菌量和料水比，優(yōu)化豆粕發(fā)酵工藝條件，并采用非靶向代謝組學篩選發(fā)酵豆粕中差異代謝產物，以期為飼用微生物發(fā)酵豆粕提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豆粕原料是陜西楊凌某公司提供的未發(fā)生霉變的飼料。從火地塘腐殖土、漆水河淤泥、豆粕腐殖質等樣品中篩選到枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)2株：Bacillussubtilis-Byn 8、Bacillussubtilis-dou 2，結合實驗室保存的乳酸菌[植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)]3株：Lactobacillusplantarum-L3、Lactobacillusplantarum-L11、Lactobacillusplantarum-L18，酵母菌[釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)]3株：Saccharomycescerevisiae-S1、Saccharomycescerevisiae-S11、Saccharomycescerevisiae-S12進行發(fā)酵。

1.2 試驗設計

按照枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌接種體積比例不同設置9個組(G1～G9組)，具體試驗設計如表1所示。菌液在37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，菌液總添加量為12%，紅糖添加量為2%，發(fā)酵時間5 d。Bacillussubtilis-Byn 8的活菌數(shù)為1×107CFU/mL，Bacillussubtilis-Bdou 2的活菌數(shù)為2.2×107CFU/mL，Lactobacillusplantarum-L3的活菌數(shù)為2.8×107CFU/mL，Lactobacillusplantarum-L11的活菌數(shù)為1.2×107CFU/mL，Lactobacillusplantarum-L18的活菌數(shù)為2×107CFU/mL，Saccharomycescerevisiae-S1的活菌數(shù)為1×107CFU/mL，Saccharomycescerevisiae-S11的活菌數(shù)為1×108CFU/mL，Saccharomycescerevisiae-S12的活菌數(shù)為2.1×107CFU/mL。對照組(Con組)僅添加試驗組所添加菌液等體積的無菌水?？莶菅挎邨U菌采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，乳酸菌采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)進行培養(yǎng)，具體培養(yǎng)基配方參照文獻描述[9-10]。

表1 試驗設計(接種體積比例)Table 1 Experiment design (volume ratio of bacteria liquid)

非靶向代謝組學測定前飼料樣品的制備：準備無菌發(fā)酵袋，在超凈臺上將發(fā)酵袋里層翻出，用酒精棉球反復擦拭，將其立于工作臺中。用紫外線進行滅菌，待乙醇全部揮發(fā)，將袋子恢復，并標號。試驗設置5個組，對照組(CK組)為豆粕原料未滅菌組，料水比為1∶0.42，紅糖添加量為2%，37 ℃發(fā)酵5 d；4個試驗組分別為枯草芽孢桿菌組(Bac組)、乳酸桿菌組(Lac組)、酵母菌組(Yea組)、混菌組(Mix組)，接菌量為12%，料水比為1∶0.42，紅糖添加量為2%，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌添加的體積比例為6∶3∶2，每組3個重復。

1.3 測定指標及方法

pH：稱取5 g樣品加45 mL蒸餾水在250 mL錐形瓶中充分振蕩30 min，用便攜式pH計測定溶液pH；粗蛋白質含量：參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白質的測定》方法測定；小肽含量：參照QBHHS JC006—2013發(fā)酵豆粕中小肽的檢測方法(三氯乙酸法)測定；粗脂肪含量：參照GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》方法測定；中性洗滌纖維含量：參照GB/T 20806—2006《飼料中中性洗滌纖維的測定》方法測定；酸性洗滌纖維含量：參照NY/T 1459—2007《飼料中酸性洗滌纖維的測定》方法測定；有效磷含量：用高分辨自動化學分析儀進行測定；黃曲霉毒素含量：參照酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)毒素檢測試劑盒說明書(MB-11241A，酶標生物，江蘇)測定；玉米赤霉烯酮含量：參照ELISA毒素檢測試劑盒說明書(JC-P09431A，酶標生物，江蘇)測定；大豆球蛋白含量：參照大豆球蛋白快速定量檢測試劑盒說明書(EA02，北京龍科方舟生物工程技術有限公司，北京)測定。

1.4 非靶向代謝組學測定與分析

1.4.1 樣品處理

取50 mg發(fā)酵后的豆粕樣品，加入400 μL提取液(甲醇∶水=4∶1)于樣品中，低溫條件下，高通量組織破碎儀破碎旋渦混勻后，冰上超聲萃取10 min，將樣品靜止于-20 ℃ 30 min。

1.4.2 液相色譜與質譜條件

色譜柱為BEHC18柱，流動相A為水(含0.1%甲酸)，流動相B為乙腈/異丙醇(1∶1)(含0.1%甲酸)，流速為0.40 mL/min，進樣量為20 μL，柱溫為40℃。樣品質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式，電噴霧毛細管電壓，進樣電壓和碰撞電壓分別為1.0 kV，40 V和6 eV。離子源溫度和去溶劑溫度分別為20和500 ℃，載氣流量900 L/h，質譜掃描范圍50～1 000 m/z，分辨率為30 000。

1.4.3 非靶向代謝組學數(shù)據(jù)分析

在進行統(tǒng)計分析之前，對原始數(shù)據(jù)進行預處理。原始數(shù)據(jù)導入處理軟件Progenesis QI(Waters Corporation，Milford，美國)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣，然后進行數(shù)據(jù)預處理：1)僅保留所有樣品中非零值50%以上的變量；2)原始矩陣中最小值填補缺失值；3)總峰歸一化，同時刪除QC樣本相對標準偏差(RSD)>30%的變量，得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。用軟件Progenesis QI進行搜庫鑒定。主要數(shù)據(jù)庫為http://www.hmdb.ca/; https://metlin.scripps.edu/公共數(shù)據(jù)庫。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析(one-way ANOVA)，Turkey差異檢驗。統(tǒng)計結果以P<0.05具有統(tǒng)計學意義，結果用“平均值±標準誤”表示，使用Graphpad Prism 8軟件進行圖表的繪制。采用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析差異代謝產物，通過美吉生信云平臺進行代謝組學的可視化分析。

2 結果與分析

2.1 復合菌發(fā)酵豆粕pH指標變化

如圖1所示，各試驗組初始pH約為6.2，隨著發(fā)酵時間的延長，pH一直在下降，直到第4天達到最低，約4.2，第4天后開始升高。

圖1 復合菌發(fā)酵豆粕中pH的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of pH in fermented soybean meal by compound microbes

2.2 發(fā)酵豆粕營養(yǎng)指標含量的變化

對發(fā)酵后豆粕中粗蛋白質、小肽、粗脂肪、有效磷、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量進行測定，如表2所示，與對照組相比，9個試驗組的粗蛋白質和小肽含量均顯著增加(P<0.05)。其中G9組的粗蛋白質含量增加率最高，達到了10%。G3組小肽含量增加率最高，達到39.37%。與對照組相比，G3和G6組的粗脂肪含量均顯著提高(P<0.05)，而有效磷含量只有G5組顯著增加(P<0.05)。與對照組相比，試驗組酸性洗滌纖維含量均顯著下降(P<0.05)，G7組效果最顯著；G5組中性洗滌纖維含量與對照組無顯著差異(P>0.05)，其他試驗組均顯著下降(P<0.05)。

表2 復合菌發(fā)酵對豆粕中營養(yǎng)成分含量的影響(絕干樣)Table 2 Effects of compound microbes fermentation on nutrient contents of soybean meal (absolute dry sample)

2.3 復合菌發(fā)酵豆粕大豆球蛋白含量變化

如表3所示，復合菌發(fā)酵豆粕后，各試驗組的大豆球蛋白含量均顯著降低(P<0.05)，其中G5組含量最低，為107.19 mg/g。

表3 復合菌發(fā)酵對豆粕的大豆球蛋白含量的影響Table 3 Effects of compound microbes fermentation on soybean globulin content of soybean meal mg/g

2.4 復合菌發(fā)酵豆粕毒素含量變化

如表4所示，豆粕中主要存在的毒素為黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮，經(jīng)過復合發(fā)酵后，依據(jù)GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標準》，各試驗組毒素含量均未超標。

表4 復合菌發(fā)酵對豆粕毒素含量的影響Table 4 Effects of compound microbes fermentation on soybean meal toxin contents of soybean meal ng/g

續(xù)表4組別 Groups黃曲霉毒素 Aflatoxin玉米赤霉烯酮 ZearalenoneG22.28±0.03de5.61±0.05bcG32.53±0.05bc5.28±0.04cG42.83±0.02a9.32±0.28aG52.12±0.01e6.27±0.08bG62.12±0.03e8.51±0.16aG72.58±0.02bc6.12±0.12bcG82.63±0.07b9.12±0.17aG92.43±0.03cd5.88±0.24bc

2.5 復合菌發(fā)酵豆粕代謝產物的變化

2.5.1 不同微生物發(fā)酵豆粕的代謝組分聚類分析

將液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)分析所得數(shù)據(jù)進行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，如圖2-A所示，Bac、Lac和Mix組與CK組之間顯著分開，各組發(fā)酵代謝產物分別單獨聚類，不同微生物發(fā)酵豆粕代謝產物存在明顯差異。進一步通過Venn圖分析各組之間的差異代謝產物數(shù)量發(fā)現(xiàn)，Bac、Lac、Yea和Mix組分別有20、27、22和26個獨特的差異代謝產物(圖2-B)。分析各組之間差異代謝產物的聚類情況發(fā)現(xiàn)，Bac和Yea組的代謝產物相似，Lac和Mix組的代謝產物出現(xiàn)顯著的差異聚類(圖2-C)。

A：主成分分析 PCA；B：Venn圖 Venn diagram；C：差異代謝產物聚類分析 cluster analysis of differential metabolites。2’-oxoaloesol 7-glucoside：2’-氧代木糖醇7-葡萄糖苷；Isomargaritene：刺槐黃素-6-C-新橙皮糖苷；N-(4-aminobutyl)-3-(4-hydroxyphenyl)oxirane-2-carboximidic acid:N-(4-氨基丁基)-3-(4-對羥基苯) 環(huán)氧乙烷-2-甲亞胺酸；Glucosylceramide (d18∶1/18∶0): 葡糖神經(jīng)酰胺；Farnesyl acetone：金合歡基丙酮；Octadecanamide：硬脂酸酰胺；Tridecanol：十三醇；N-linoleoyl GABA：N-亞油?；被∷幔籄mylopectin：支鏈淀粉；Pelargonidin 3-(2glu glucosylrutinoside)：花葵素；1-docosanoyl-glycero-3-phosphate：1-二十二碳酰-丙三醇-3-磷酸鹽；Daidzein 7,4′-di-O-glucoside：黃豆苷元7,4′-di-O-葡萄糖苷；Daidzin：黃豆苷；Acacetin 7-[apiosyl(1->6)-glucoside]：金合歡素；AsnTrpTrpThr：天冬酰胺色氨酸色氨酸蘇氨酸；Cytidine monophosphate N-acetylneuraminic acid：胞苷單磷酸N -乙酰神經(jīng)氨酸；6′-malonyltrifolirhizin：6′-丙二酰三葉草酸根；Myricanene A 5-[arabinosyl-(1->6)-glucoside]：月桂烯 A 5-[阿拉伯糖基-(1->6)-葡萄糖苷]；Dehydrosoyasaponin：去氫大豆皂甙；Apigenin 7-[rhamnosyl-(1->2)-galacturonide]：芹黃素7-[鼠李糖-(1->2)-葡萄糖苷]；APC：別藻藍蛋白；N-acetyl-D-phenylalanine：乙酰氨基；Mulberrofuran E：桑呋喃E；Apigenin 5-(6″-malonylglucoside)：芹黃素-5-(6″-丙二酰葡萄糖苷)；3,3′-bis(4″-hydroxyanigorufone)：3,3′-bis(4″-羥基茴香醚)；Glycerophosphocholine：甘油磷酰膽堿；1-(sn-glycero-3-phospho)-1D-myo-inositol：1-(sn-丙三基-3-磷光體)-1D-肌紅蛋白-肌醇；Ser Val Trp：絲氨酸纈氨酸色氨酸；LysoPC(18∶2(9Z,12Z))：膽堿(18∶2(9Z,12Z))；PE-NMe(14∶1(9Z)/20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z))：聚乙烯-NMe(14∶1(9Z)/20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z))；Gln Ala Pro Leu：：谷氨酰胺丙氨酸脯氨酸亮氨酸；N-lactoyl-leucine：N-乳酰-亮氨酸；Maltotriose：麥芽三糖；(±)-(Z)-2-(5-tetradecenyl)cyclobutanone：(±)-(Z)-2-(5-十四碳烯基酯)環(huán)丁酮；Lycoperdic acid：番茄紅酸；LysoPC(18∶1(9Z))：膽堿(18∶1(9Z))；13S-hydroxyoctadecadienoic acid：13s-二烯酸；(±)9-HpODE：(±)9-十八碳二烯酸；(±)11(12)-EET ethanolamide：(±)11(12)-EET乙醇胺；Oleoyl glycine：油酰甘氨酸；1-stearoylglycerophosphoglycerol：1-硬脂酰甘油磷酸甘油；2-aminomuconic acid semialdehyde：2-aminomuconic酸半醛；Zeranol：玉米赤霉醇；Calystegine C1：打碗花精C1；PS(O-16∶0/20∶2(11Z,14Z))：聚苯乙烯(O-16∶0/20∶2(11Z,14Z))；PC：聚碳酸酯；Trigonelline：葫蘆巴堿；N5-(4-methoxybenzyl)glutamine：N5-(4-甲氧苯甲醇)谷氨酰胺。圖2 不同微生物發(fā)酵豆粕的代謝產物聚類分析Fig.2 Cluster analysis of metabolites of soybean meal fermented by different microorganisms

2.5.2 不同微生物發(fā)酵豆粕差異代謝產物的篩選

根據(jù)變量權重值(VIP)>2的篩選原則，篩選試驗組與對照組的差異代謝產物，其中Bac組與CK組的差異代謝產物主要包括：亞油酸鹽(linoleamide)、1-palmitoylglycerophosphoinositol、DG、黃豆苷元(daidzein)、PC等。Lac組與CK組的差異代謝產物主要包括：亞油酸鹽、N-hexadecanoylpyrrolidine、PS、芹菜素(apigenin)、1-palmitoylglycerophosphoinositol等。Yea組與CK組的差異代謝產物主要包括：PC、黃豆苷元、PS、芹菜素、1-palmitoylglycerophosphoinositol等。Mix組與CK組的差異代謝產物主要包括：PC、linoleamide、PS、黃豆苷元、芹菜素、1-palmitoylglycerophosphoinositol等。其中4組比較共有的差異代謝產物包括：芹菜素、水蘇糖(stachyose)、麥芽三糖(maltotriose)、黃豆苷元、LysoPC、PS、tetramethylquercetin、11-keto、1-palmitoyl-2-linoleoyl PE等。其中Mix組特有的差異代謝產物包括：Pro Pro Ile Leu、N-lactoyl-isoeucine、phloretin xylosyl-galactoside、octadecanamide。其中Yea組特有的差異代謝產物包括：indoleacrylic acid、6-beta-hydroxydexamethasone、araliasaponin等。其中Lac組特有的差異代謝產物包括：pinolenic acid、netilmicin、Arg Val Val Phe、omphalotin C等。其中Bac組特有的差異代謝產物包括：1-oleoylglycerophosphoinositol、linoleoyl ethanolamide。

微生物群落代謝特征的變化反映了微生物群落動態(tài)的變化；因此，我們試圖根據(jù)代謝組學數(shù)據(jù)定義微生物群落結構與代謝功能之間的關系。如圖4所示，與CK組相比，差異代謝產物主要參與亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝、組氨酸和嘌呤衍生生物堿的生物合成、α-亞麻酸代謝、半乳糖代謝、碳水化合物的消化吸收、鞘脂代謝、植物次生代謝產物的生物合成、植物激素的生物合成。

3 討 論

本試驗以乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，按不同的接菌體積比例發(fā)酵豆粕，發(fā)酵時長為5 d，結果顯示pH在第4天降至4.2，第5天開始回升。這個過程是由于前期乳酸菌利用底物產生乳酸，降低了pH，使發(fā)酵處于酸性環(huán)境，同時枯草芽孢桿菌利用氧氣，為乳酸菌的生長提供了厭氧環(huán)境，這與陳倩倩等[11]、柯芙容等[12]研究結果一致。第5天后pH回升可能是由于乳酸菌死亡，乳酸生成減少。

在發(fā)酵過程中，粗蛋白質和小肽含量是評價發(fā)酵效果的重要指標。一方面，微生物的呼吸作用消耗部分有機物，使得產物總量減少，出現(xiàn)了蛋白質的“濃縮效應”[13]；另一方面，微生物利用發(fā)酵體系中的無機銨鹽和碳源大量繁殖，產生菌體蛋白[14]，這是提高粗蛋白質含量的重要原因。本研究各試驗組的粗蛋白質含量均顯著增加，其中粗蛋白質含量增加最多的G9組與對照組相比粗蛋白質含量提高了10%。劉星等[15]利用不同的微生物發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)產枯草芽孢桿菌組發(fā)酵使粗蛋白質含量從45.28%提高至48.37%。鄭環(huán)宇等[16]在優(yōu)化混菌株固態(tài)發(fā)酵高溫豆粕工藝的研究中，發(fā)現(xiàn)在黑曲霉、釀酒酵母菌、枯草芽孢桿菌、植物乳酸桿菌比例為2∶2∶1∶1，接種量為10%，料水比為1∶3，溫度為33 ℃的條件下發(fā)酵96 h，粗蛋白質含量相比于豆粕原料增加了24.36%。劉劍飛[17]利用枯草芽孢桿菌、酵母菌、植物乳桿菌混菌發(fā)酵豆粕后，測得粗蛋白質含量提高了13.5%，這與本研究結果一致。小肽在動物體內吸收效率高、吸收快、能耗低、不易飽和，各種肽之間轉運無競爭性抑制，因此營養(yǎng)價值更高[18]。熊濤等[19]利用篩選出的一種甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，進行單菌發(fā)酵豆粕，與未發(fā)酵豆粕相比，小肽含量提高了27.22%，而陳倩倩等[11]使用解淀粉芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌按特定接種比例進行混菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)小肽含量提高了8.68倍。本研究的小肽含量最高達到了46.37%。

研究表明，枯草芽孢桿菌能產生大量的纖維素酶，對于降解底物中的纖維素起重要作用[20]。邱豐艷等[21]在多菌復合固態(tài)發(fā)酵富硒豆粕的研究中發(fā)現(xiàn)粗纖維含量有所降低，但不顯著，而任志青等[22]利用粗壯脈紋孢菌，發(fā)酵豆粕96 h，粗纖維降解率高達71.62%。在本試驗結果中發(fā)現(xiàn)，各試驗組的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著降低，說明本試驗所篩選的枯草芽孢桿菌在降低纖維素含量方面效果顯著。經(jīng)復合菌發(fā)酵后，G2、G3、G6組的粗脂肪含量都顯著提高，這可能是豆粕中部分有機物被微生物生長所利用而造成干物質損失，使得它們的含量相對提高[11]。

A：Bac與CK組發(fā)酵豆粕的差異代謝產物 differential metabolites of fermented soybean meal between Bac group and CK group；B：Lac與CK組發(fā)酵豆粕差的異代謝產物 different metabolites of fermented soybean meal between Lac group and CK group；C：Yea與CK組發(fā)酵豆粕差的異代謝產物 differential metabolites of fermented soybean meal between Yea group and CK group；D：Mix與CK組發(fā)酵豆粕的差異代謝產物 differential metabolites of fermented soybean meal between Mix group and in CK group。Linoleamide:亞油酰胺;1-palmitoylglycerophosphoinositol:1-棕櫚酰甘油磷酸肌醇;DG(18∶2(9Z,12Z)/16∶0/0∶0):二酰甘油(18∶2(9Z,12Z)/16∶0/0∶0);Daidzein 6″-O-acetate:黃豆苷元6″-O-醋酸鹽;PC(16∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])):聚碳酸酯;N-hexadecanoylpyrrolidine:N-十六?；量┩?Apigenin 5-(6″-malonylglucoside):芹黃素5-(6″-malonylglucoside);2′-oxoaloesol 7-glucoside:2’-氧代木糖醇 7-葡萄糖苷;Stachyose:水蘇糖;9,10-DiHOME:十八-9,12-二烯酸;Maltotriose:麥芽三糖;LysoPC(18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z)):膽堿(18∶4(6Z,9Z,12Z,15Z));1-oleoylglycerophosphoinositol:1-油酰甘油磷酸肌醇;Alpha-lactose:α-乳糖;DG(18∶2(9Z,12Z)/18∶3(9Z,12Z,15Z)/0∶0):二酰甘油;PS(O-16∶0/20∶2(11Z,14Z)):磷脂酰-L-絲氨酸;9-OxoODE:氧十八碳二烯酸;Tetramethylquercetin 3-rutinoside:四甲基槲皮素3-蕓香苷;Linoleoyl ethanolamide:亞油酰乙醇酰胺;Rollinecin A:羅林霉素A;11-keto fluprostenol:11-酮氟前列腺素;Sucrose:蔗糖;PE(18∶1(9Z)/16∶0):聚乙烯(18∶1(9Z)/16∶0);PE(16∶1(9Z)/20∶1(11Z)):聚乙烯(16∶1(9Z)/20∶1(11Z));Cys Tyr Ser Thr:半胱氨酸酪氨酸絲氨酸蘇氨酸;cis-tephrostachin:順式鐵強酸;PE(18∶1(11Z)/18∶3(6Z,9Z,12Z)):聚乙烯(18∶1(11Z)/18∶3(6Z,9Z,12Z));13(S)-hpODE:13(S)-十八碳二烯酸;Simonin IV:C68H120O24;Ricinoleic acid:蓖麻油酸;Arg Ile Ile Tyr:精氨酸異亮氨酸異亮氨酸酪氨酸;Arg Val Val Phe:精氨酸纈氨酸纈氨酸苯丙氨酸;Omphalotin C:臍菇亭C;2-hydroxyhexadecanoic acid:羥基十六酸;CL(16∶0/16∶0/18∶0/22∶6:氯化物;Tetramethylquercetin 3-rutinoside:四甲基槲皮素3-蕓香苷;C18 sulfatide:C18硫苷脂;Ile Gly Pro Val:異亮氨酸甘氨酸脯氨酸纈氨酸;Netilmicin:奈替米星;12(13)-EpOME-d:(±)-斑鳩菊酸;Pinolenic acid:皮諾斂酸;1-stearoylglycerophosphoinositol:1-硬脂酰甘油磷酸肌醇;6-beta-hydroxydexamethasone:6-β-羥基地塞米松;DG(18∶2(9Z,12Z)/16∶0/0∶0):二酰甘油(18∶2(9Z,12Z)/16∶0/0∶0);1-palmitoyl-2-linoleoyl PE:1-棕櫚酰-2-亞油?；垡蚁?Phenylacetaldehyde:苯乙醛;Majoroside F6:大車前草苷 F6;Indoleacrylic acid:吲哚丙烯酸;PA(16∶0/16∶0):聚酰胺(16∶0/16∶0);Araliasaponin Ⅰ:阿拉里亞皂苷Ⅰ;Alpha-lactose:α-乳糖;6′-malonyltrifolirhizin:6′-丙二酰三葉豆紫檀苷;Apigenin:芹黃素;1-stearoylglycerophosphoglycerol:1-硬脂酰甘油磷酸甘油;Rollinecin A:羅林霉素A;2-hydroxyhexadecanoic acid:2-羥基十六烷酸;cis-tephrostachin:順式鐵強酸;Pro Pro Ile Leu:脯氨酸脯氨酸異亮氨酸亮氨酸;N-lactoyl-isoeucine:N-乳?；惲涟彼?Phloretin xylosyl-galactoside:根皮素;Octadecanamide:硬脂酸酰胺。圖3 基于OPLS-DA模型加權系數(shù)的VIP評分分析、差異代謝產物VIP氣泡圖及表達量熱圖Fig.3 VIP score analysis based on weighted coefficient of OPLS-DA model, VIP bubble map and expression heatmap of differential metabolites

Linoleic acid metabolism:亞油酸代謝;Phenylalanine metabolism:苯丙氨酸代謝;Biosynthesis of alkaloids derived from histidine and purine:組氨酸和嘌呤生物堿的生物合成;Central carbon metabolism in cancer:癌癥的中心碳代謝;alpha-Linolenic acid metabolism:亞麻酸代謝;Galactose metabolism:半乳糖代謝;ABC transporters:ABC轉運蛋白;Biosynthesisof plant hormones:植物激素的生物合成;Biosynthesis of plant secondary metabolites:植物次生代謝產物的生物合成;Sphingolipid metabolism:鞘脂類代謝;Carbohydrate digestion and absorption:碳水化合物的消化吸收;Mineral absorption:礦質營養(yǎng)吸收;mTOR signaling pathway:絲氨酸/蘇氨酸激酶(雷帕霉素靶蛋白)信號通路;Protein digestion and absorption:蛋白質消化吸收;PPAR signaling pathway:過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路;Aminoacyl-tRNA biosynthesis:氨酰生物合成;Nicotinate and nicotinamide metabolism:煙酸鹽和煙酰胺代謝;GABAergic synapse：GABA能神經(jīng)元突觸;Choline metabolism in cancer:癌癥中的膽堿代謝;Glucosinolate biosynthesis:芥子油苷生物合成。P<0.05、P<0.01和P<0.001分別用“*”、“**”和“***”表示。P<0.05, P<0.01 and P<0.001 are denoted by “*”， “**” and “***”, respectively.圖4 基于KEGG的功能富集分析Fig.4 Functional enrichment analysis based on KEGG

大豆球蛋白作為豆粕中熱穩(wěn)定型的抗營養(yǎng)因子，嚴重影響了豆粕的營養(yǎng)價值，可誘發(fā)仔豬的斷奶綜合征，降低仔豬成活率[23]，此外還可引起動物過敏反應和腸黏膜的損傷，導致動物消化不良、腹瀉和生長受阻[24]。利用發(fā)酵豆粕粉代替魚粉飼喂育蝦，發(fā)現(xiàn)可提高育蝦的品質和存活率[25]。Seo等[26]發(fā)現(xiàn)豆粕經(jīng)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)大部分β-伴大豆球蛋白被降解；程天德等[27]使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)可以降解85.39%的大豆抗原蛋白；黃穎[28]利用多菌種固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵豆粕對比發(fā)酵效果，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌液態(tài)發(fā)酵能使大豆球蛋白的降解率達到75.00%。本研究中各試驗組的大豆球蛋白含量均顯著下降，其中效果最好的G5組下降了52.15%。有研究發(fā)現(xiàn)，多種微生物復合發(fā)酵豆粕可以將豆粕的大分子蛋白質降解為小肽、氨基酸等小分子物質，減少抗營養(yǎng)因子，優(yōu)化了豆粕的營養(yǎng)質量，提高了豆粕的營養(yǎng)價值[29]。而植酸也是存在于豆粕中的一種熱穩(wěn)定型抗營養(yǎng)因子，另有研究證實，植酸會使消化酶活性降低，降低動物生產性能[30]。前期研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌與釀酒酵母代謝產生植酸酶，從而降低豆粕中植酸的含量，提高有效磷含量[31]，在本研究中，G5組有效磷含量顯著增加，這與前期研究結果一致。通過復合菌發(fā)酵處理，能有效消除了豆粕中的抗營養(yǎng)因子，使豆粕的營養(yǎng)價值得到改善。

豆粕中的主要氨基酸包括：苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸和谷氨酸等[32]。豆粕中的水蘇糖含量占大豆可溶性糖類的12.1%～35.2%。發(fā)酵豆粕增加了水蘇糖的含量。水蘇糖可以調節(jié)腸道微生物區(qū)系，增加雙歧桿菌豐度，改善腸道蠕動，增強免疫力，降低血壓和血脂[33-34]。芹菜素是一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物中，藥學價值豐富，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物學作用[35]。發(fā)酵可以降低芹菜素的含量。黃豆苷元是豆科植物的次級代謝產物大豆異黃酮的一種，具有抑菌和防控大豆胞囊線蟲病的作用[36-37]。發(fā)酵有效提高了黃豆苷元的含量。G1和G4組差異代謝產物篩選顯示，枯草芽孢桿菌和混菌發(fā)酵增加了α-乳糖的含量，而G3組(酵母菌發(fā)酵)降低了α-乳糖的含量。研究表明α-乳糖能顯著減輕膿毒癥誘發(fā)的肝臟損傷[38]?？偟膩碚f，發(fā)酵改善了飼料品質，提高了利用率。

4 結 論

本試驗在溫度為37 ℃，料水比為1∶0.42，接種量為12%，發(fā)酵時間為120 h的條件下，通過添加不同接種體積比例的枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌，進行復合菌發(fā)酵豆粕的研究。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵豆粕的粗蛋白質和小肽等營養(yǎng)物質含量顯著提高，大豆球蛋白、毒素等抗營養(yǎng)因子含量顯著下降，綜合各試驗組的結果，當枯草芽孢桿菌∶乳酸菌∶酵母菌接種體積比例為6∶2∶3時，發(fā)酵豆粕效果最優(yōu)。固態(tài)發(fā)酵豆粕顯著提高了水蘇糖、麥芽三糖、黃豆苷元、絲氨酸、纈氨酸、色氨酸、脯氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等有益物質的含量，顯著提高亞油酸代謝、苯丙氨酸代謝、組氨酸和嘌呤衍生生物堿的生物合成等代謝通路的豐度。