光照時間對就巢期浙東白鵝血清生理生化指標(biāo)、盲腸揮發(fā)性脂肪酸和腸道菌群的影響

徐中寶，馬 輝，陳思穎，顏菲菲，趙阿勇

（浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，浙江臨安 311300）

光周期指晝夜周期中晝夜長短的交替變化，是鳥類重要的環(huán)境影響因子，調(diào)控著鳥類的生物節(jié)律。在自然條件下，鳥類的繁殖行為呈現(xiàn)出季節(jié)性，即在繁殖季節(jié)才開始繁殖行為，如產(chǎn)卵、就巢、孵卵等。產(chǎn)蛋后，鳥類會蹲伏在巢內(nèi)孵蛋，飲食行為減少、體溫降低和新陳代謝減慢。就巢時期，盲腸被認(rèn)為是降解日糧中纖維物質(zhì)的主要消化器官。盲腸中的微生物降解纖維和酵解未消化的物質(zhì)，產(chǎn)生乙酸、丙酸和丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（Volatile Fatty Acids，VFA），為腸黏膜細(xì)胞提供能量、降低腸道pH，促進(jìn)益生菌的生長增殖和抑制病原菌的定值等。影響腸道微生物和VFA的因素包括日糧、年齡和飼養(yǎng)方式等，但光照的研究較少。

浙東白鵝是季節(jié)性繁殖動物，其強(qiáng)就巢性限制了產(chǎn)蛋性能。在動物生產(chǎn)中，可利用光照來調(diào)控鵝的繁殖行為。前期研究發(fā)現(xiàn)，短光照（9L:15D）會顯著縮短浙東白鵝的就巢期，提高產(chǎn)蛋量及其在就巢期的采食次數(shù)和體重。因此，本研究主要探索光照時間對就巢期浙東白鵝的血清生理生化指標(biāo)、盲腸VFA含量以及腸道微生物的豐度和多樣性的影響，為光照時間調(diào)控鵝的產(chǎn)蛋和就巢性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 選取來自于浙江寧波象山浙東白鵝原種場的16只健康浙東白鵝母鵝，所有試驗鵝均為220日齡，且體重相近，隨機(jī)分為2組，每組6個重復(fù)。長光照組每日給予15 h光照（04:00—19:00），短光照組每日給予9 h光照（08:00—17:00）。用黑色記號筆標(biāo)記個體，兩組飼養(yǎng)管理條件相同，每天固定時間（08:00和17:00）喂食2次，日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。試驗時間為2018年11月15日—2019年1月16日。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 樣品采集 試驗結(jié)束后，翅下采集靜脈血，常溫靜置待血液凝固后，4℃，5 000 r/min離心5 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆?。解剖試驗鵝，采集鵝盲腸內(nèi)容物于2 mL凍存管中，迅速放入液氮。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 血清生理生化指標(biāo)檢測 血清冰上解凍后，采用A6半自動生化儀（北京松上技術(shù)有限公司）測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、胰島素（INS）、胰淀粉酶（PAMY）和脂肪酶（LIP）活力以及血清總膽紅素（TBIL）、間接膽紅素（IBIL）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、尿素（UREA）、葡萄糖（GLU）、總膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、鈣（Ca）和無機(jī)磷（PHOS）含量，檢測試劑盒購于寧波普瑞柏生物技術(shù)股份有限公司。

1.3.2 盲腸揮發(fā)性脂肪酸含量檢測 準(zhǔn)確稱取0.5 g盲腸內(nèi)容物，加入1 mL ddHO，漩渦振蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清。按上清液:25%偏磷酸為10:2（mL）的比列加入25%的偏磷酸，混合均勻，冰浴30 min。4℃、12 000 r/min離心10 min。0.22 μm濾膜過濾上清液。采用安捷倫7890B氣相色譜儀測定乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸含量。

1.3.3 腸道微生物組成 腸道微生物委托廣東美格基因科技有限公司進(jìn)行16S rRNA 測序分析及數(shù)據(jù)處理，根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚類，對生成的OTU信息進(jìn)行細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析，計算richness、Chao1、Shannon和Simpson等多樣性指數(shù)，繪制稀釋曲線。對OTUs在門屬水平上的物種相對豐度分析，分析門屬水平分布和差異菌群。

1.4 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22.0進(jìn)行K-S檢驗（Kolmogorov-Smirnov test），分析數(shù)據(jù)正態(tài)性。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用T檢驗，非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用曼-惠特尼秩和檢驗（Mann-Whitney U test），以分析數(shù)據(jù)組間差異顯著性。顯著性水平設(shè)置為=0.05，統(tǒng)計值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 光照時間對血清生理生化指標(biāo)的影響 由表2可知，長光照組的ALP、IBIL和Ca低于短光照組（<0.05），LIP高于短光照組（<0.05），其他指標(biāo)差異不顯著。

表2 光照時間對血清生理生化指標(biāo)的影響

2.2 光照時間對盲腸VFA含量的影響 由表3可得，長光照組的6種VFA均高于短光照組，其中乙酸、丙酸、異丁酸和異戊酸含量無顯著差異，丁酸和戊酸差異顯著。

表3 光照時間對浙東白鵝盲腸VFA含量的影響 μmol/g

2.3 光照時間對腸道微生物的影響

2.3.1 測序情況和OTUs分析 對測序結(jié)果質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化整理，每個處理組的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果見表 4，兩組間OTUs數(shù)量和序列堿基個數(shù)差異不顯著。97% 相似度下樣品取樣深度的稀釋曲線見圖1，當(dāng)樣品隨機(jī)抽取的數(shù)據(jù)量為66%左右時，曲線開始趨于平坦，說明測序深度足夠。

圖1 稀釋曲線圖

表4 樣本測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.3.2多樣性分析 由表5可知，光照時間對腸道菌群richness指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著性影響。

表5 光照時間對浙東白鵝腸道菌群α多樣性指數(shù)的影響

2.3.3 菌落結(jié)構(gòu) 2組腸道菌群共19個門類，主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）和藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）組成（見圖2、3）。其中短光照組未檢測到異常球菌屬-棲熱菌門（Deinococ cus-Thermus），長光照組未檢測到廣古菌門（Euryarc haeota）。與短光照組相比，長光照組的黏膠球形菌門（Lentisphaerae）顯著降低，其他門類差異不顯著。兩組腸道菌群共檢測到171個屬，主要由瘤胃菌科_UCG-009（Ruminococcaceae_UCG-009）、屬、史雷克氏菌屬（）、密螺旋體屬（）、屬、屬、脫硫弧菌屬（）、屬和屬等屬組成。

圖2 腸道微生物在門水平的分布

其中，極地桿菌屬（）、交替單胞菌屬（）、伯克氏菌屬（）、卡斯特蘭尼氏菌屬（）、代夫特菌屬（）、屬、屬、甲基桿菌屬（）、馬賽菌屬（）、甲烷短桿菌屬（）、甲烷球形菌屬（）、嗜甲基菌（）、屬、屬、血桿菌屬（）和四圓形菌屬（）共16個屬只在短光照組檢測到；漠河桿菌屬（）、特呂珀菌屬（）、屬、嗜鹽單胞菌屬（）、內(nèi)芽孢桿菌屬（）、屬、屬、弓形桿菌屬（）、屬、屬和屬共11個屬只在長光照組檢測到。

與短光照組相比，長光照組的短桿菌屬（）、甲基桿菌屬（）、嗜甲基菌（）、屬、屬和屬顯著降低，而乳桿菌屬（）顯著上升，具體見表6。

圖3 腸道微生物在屬水平的分布

表6 光照時間顯著影響腸道微生物的門類和屬類

3 討 論

3.1 光照時間對血清生理生化指標(biāo)的影響 血液是動物循環(huán)系統(tǒng)的重要組成部分，具有物質(zhì)運輸、體液調(diào)節(jié)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等功能。血液的生理生化指標(biāo)是反映動物機(jī)體的物質(zhì)代謝和組織器官機(jī)能的重要指標(biāo)。血清中TP、ALB和GLO與CHOL和TG分別反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝水平和脂類代謝水平。UREA是動物體內(nèi)氨基酸代謝的終產(chǎn)物，血清UREA濃度反映機(jī)體蛋白質(zhì)代謝水平。GLU是生命體的主要功能物質(zhì)，也是糖代謝的產(chǎn)物和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)代謝的原料。INS調(diào)控葡萄糖代謝和脂質(zhì)、蛋白質(zhì)合成代謝。本研究中，長光照組和短光照組的TP、ALB、GLO、CHOL、TG、GLU和INS差 異不顯著，說明光照時長不影響蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和葡萄糖代謝。潘棟、何松研究發(fā)現(xiàn)長光照提高蛋雞血清TP、GLO、GLU和TG含量和綠尾虹雉血清CHOL、TG含量。這可能與飼養(yǎng)模式有關(guān)。蛋雞和綠尾虹雉采食量隨光照時間增加而增加，但籠養(yǎng)模式限制其活動而降低物質(zhì)消耗，而本研究中浙東白鵝在平養(yǎng)模式下飼養(yǎng)，短光照組的采食次數(shù)增加，站立行為和踱步行為時間也增加。

LDH、轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素是檢驗肝功能的重要指標(biāo)。轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝組織細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞受損，細(xì)胞膜通透性增加，轉(zhuǎn)氨酶會釋放到血液中。衰老紅細(xì)胞的血紅蛋白衍化成動物血液中的膽紅素，膽紅素與血液中的血漿白蛋白結(jié)合形成IBIL。因此，當(dāng)紅細(xì)胞或肝功能受損時，血清中膽紅素含量升高。UREA是動物體內(nèi)氨基酸代謝的終產(chǎn)物，經(jīng)腎臟排泄出體外。血清中UREA是檢驗?zāi)I功能的重要指標(biāo)。CK主要存在于肌肉細(xì)胞的線粒體中，與ATP再生和有氧代謝有直接關(guān)系。當(dāng)肌肉組織損傷時，肌肉細(xì)胞膜通透性增加，CK釋放到血液中，使血清CK活性上升。血清CK活性是檢驗骨骼肌損傷的重要指標(biāo)。本研究中，長光照組和短光照組的ALT、AST、UREA和CK無顯著差異，光照時長不影響就巢期浙東白鵝肝、腎和骨骼肌功能；短光照組IBIL顯著上升，可能是因為紅細(xì)胞受損導(dǎo)致。血清LIP和PAMY是檢驗胰腺功能的重要指標(biāo)。本研究中，兩組間PAMY無差異，而長光照組LIP顯著上升，說明長光照影響胰腺功能。

陳冬梅等研究發(fā)現(xiàn)，血清中ALP、Ca和PHOS與家禽產(chǎn)蛋性能有關(guān)。Ca是影響骨骼發(fā)育和蛋殼形成的關(guān)鍵因子。蛋殼形成所需的碳酸鈣前體來源于血液中的鈣離子，缺鈣會出現(xiàn)產(chǎn)蛋量減少，而高水平的血鈣濃度促進(jìn)蛋殼的形成，提高產(chǎn)蛋量。ALP由成骨細(xì)胞和肝臟分泌，與骨代謝關(guān)系密切。血清ALP水平升高表示成骨細(xì)胞活性提高，骨質(zhì)生成旺盛，骨中鈣、磷的沉積增加。研究表明血清ALP與PHOS呈負(fù)相關(guān)，血液PHOS降低會使骨骼ALP釋放量增加，使Ca在骨組織沉淀。Ca和PHOS滿足機(jī)體需要能夠提高肉雞的生產(chǎn)性能和脛骨質(zhì)量。楊偉平等研究顯示鴨的血清ALP與產(chǎn)蛋量呈正相關(guān)。本研究中，長光照組和短光照組血液PHOS無差異，說明血清ALP活力上升不是由于缺PHOS引起的。ALP活力和血鈣濃度提高說明短光照有助于浙東白鵝的產(chǎn)蛋性能和骨質(zhì)生長，這與前期研究結(jié)果相一致，即短光照縮短浙東白鵝就巢期，提高了產(chǎn)蛋量。但Cui等研究發(fā)現(xiàn)252日齡金定鴨蛋鴨血清ALP、蛋殼強(qiáng)度和骨強(qiáng)度隨著光周期的增加而增加。12-20 h光照的光周期中，18L:6D的血清ALP、蛋殼強(qiáng)度和骨強(qiáng)度最高。另外，何松發(fā)現(xiàn)16L:8D能提高繁殖期綠尾虹雉血清ALT、AST、Ca、PHOS、CHOL和TG等含量和產(chǎn)蛋量。這些研究結(jié)果的差異與動物自然繁殖期的光周期有關(guān)。短光照促進(jìn)短日照繁殖性禽類繁殖，長光照則抑制其繁殖。如綠尾虹雉繁殖期從3—4月開始，日照時間逐漸增長；而浙東白鵝繁殖期在11月至次年4月，日照時間短，所以短光照提高血清Ca濃度以促進(jìn)浙東白鵝產(chǎn)蛋。另外，血清ALP活力在一定程度上反映生長速度，這也與短光照提高浙東白鵝采食量和體增重的結(jié)果相符。

3.2 光照時間對盲腸VFA含量的影響 VFA由盲腸或結(jié)腸中的微生物發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和異己酸。乙酸、丙酸和丁酸大約占VFA的85%。本試驗中，長光照組的的丁酸和戊酸含量顯著高于短光照組。丁酸主要在大腸（盲腸和結(jié)腸）中產(chǎn)生和作用，為腸道有益菌和上皮細(xì)胞提供生長能量以及良好的環(huán)境。丁酸能促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的組織和再生，改善腸道形態(tài)，減少家禽腸內(nèi)病原菌的定植和有利于保持腸絨毛結(jié)構(gòu)。戊酸鹽可增強(qiáng)丙酮酸氧化和乙酰輔酶a生成，誘導(dǎo)IL-10分泌，通過T和B淋巴細(xì)胞代謝改善小鼠腸道和大腦中T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理學(xué)。前期結(jié)果表明，長光照可提高浙東白鵝血漿中IL-10含量，說明長光照可能通過盲腸中戊酸的生成促進(jìn)血液中IL-10含量，提高浙東白鵝就巢期的免疫能力。

3.3 光照時間對腸道微生物的影響 腸道微生物有輔助營養(yǎng)吸收、物質(zhì)代謝，推進(jìn)機(jī)體發(fā)育以及維持宿主健康的功能。在機(jī)體的免疫防御功能中，腸道微生物不僅可以增強(qiáng)腸道黏膜屏障，還能夠調(diào)節(jié)宿主的整體免疫，從而有效抑制病原微生物的威脅。本試驗中，長光照組和短光照組之間腸道菌群richness指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均無顯著變化，表明光照時間對就巢期浙東白鵝腸道微生物物種豐度和多樣性無顯著性影響。楊博研究表明光照時間對蛋鴨腸道微生物無決定性影響。

短桿菌屬（）具有很強(qiáng)的蛋白水解能力，能夠進(jìn)行氨基酸代謝，如利用天冬氨酸合成蘇氨酸和賴氨酸。嗜甲基菌屬()具有降解纖維素和芳香族化合物功能。食物谷菌屬（）是黏膠球形菌門（Lentisphaerae）的菌屬。日糧中纖維素和支鏈氨基酸能增加腸道食物谷菌屬（）的相對豐度。研究發(fā)現(xiàn)短光照組的浙東白鵝體增重增加，可能因為采食頻率提高，盲腸中菌群代謝底物的增加提高了短桿菌屬（）、嗜甲基菌屬（）、食物谷菌屬（）的相對豐度，促進(jìn)物質(zhì)消化吸收。但采食和飲水頻次增加，盲腸內(nèi)容物中VFA濃度被稀釋，致使短光照組VFA濃度具有下降趨勢。乳桿菌屬（）可以使腸道處于酸性環(huán)境，與腸上皮細(xì)胞形成生理屏障，拮抗病原菌的侵襲和定植。乳桿菌屬還能調(diào)節(jié)焦慮行為和治療腸易激綜合征。長光照組的乳桿菌屬（）相對豐度增加有助于腸道健康。目前，其他相對豐度具有顯著差異的菌群研究較少。腸道微生物的多樣性受食物、季節(jié)、物種等因素影響，與腸道揮發(fā)性脂肪酸等內(nèi)容物相互影響。本研究中，光照時間對浙東白鵝腸道菌群結(jié)構(gòu)無影響，長光照使盲腸內(nèi)容物中丁酸、戊酸含量和乳桿菌屬增加，短光照使代謝纖維素和氨基酸的菌屬增加。目前，光照時間影響腸道微生物的研究較少，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，光照時長不影響就巢期浙東白鵝葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝以及肝、腎和胰腺功能，不影響腸道菌群物種相對豐度和多樣性。長光照增加盲腸內(nèi)容物中丁酸和戊酸含量及有益菌乳桿菌屬的水平，對就巢期浙東白鵝盲腸健康有一定的促進(jìn)作用。短光照增加部分腸道菌群相對豐度，提高血清ALP活力和血清Ca濃度。