抗生素對腹瀉仔豬腸道微生物及四環(huán)素耐藥基因的影響

馬 馨，張雨琛，徐婷婷，錢夢琪，楊智仁,2，韓新燕,2*

（1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，浙江杭州 310058；2.海南浙江大學(xué)研究院，海南三亞 572000）

在養(yǎng)豬業(yè)中，仔豬由于腸道功能發(fā)育不完整而腹瀉是一種常見現(xiàn)象，為預(yù)防腹瀉，大量的抗生素被應(yīng)用于飼料添加劑之中。在飼料全面禁抗背景下，仔豬腹瀉風(fēng)險增加，因此在生產(chǎn)中會采用抗生素注射來治療仔豬腹瀉。然而，隨著抗生素的泛用、濫用，動物源性細(xì)菌耐藥性形勢嚴(yán)峻，不論是人獸共用抗生素還是動物專用抗生素的耐藥性增高，均影響著食品安全與公共衛(wèi)生安全，對醫(yī)療資源產(chǎn)生威脅。四環(huán)素類抗生素是一種廣譜抗生素，菌群對四環(huán)素產(chǎn)生耐藥基因的現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，在豬場中可以普遍地檢測到抗四環(huán)素基因的存在。因此，本研究旨在探討用抗生素治療腹瀉會對仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)、四環(huán)素類抗性基因含量的影響以及二者之間的相關(guān)性，為進(jìn)一步探究菌群四環(huán)素耐藥基因的產(chǎn)生原因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計 試驗動物為“杜×長×大”三元雜交哺乳仔豬。在同一棟豬舍同期出生的仔豬中，于10日齡左右隨機選取體重3.2 kg左右且連續(xù)腹瀉2 d以上的腹瀉仔豬，采集其糞便樣本作為腹瀉組。按豬場常規(guī)治療手段對腹瀉仔豬用慶大霉素連續(xù)治療3 d，采集治療后仍腹瀉仔豬的糞便樣本作為抗生素治療組。腹瀉組與抗生素治療組各隨機選取6個樣本進(jìn)行檢測分析。動物和試驗設(shè)計經(jīng)浙江大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會批準(zhǔn)。試驗期間仔豬自由采食母乳和飲水，并按照豬場的正常免疫措施和管理模式進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 腸道菌群16S rDNA測序 利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行總DNA質(zhì)檢。16S rDNA擴增選擇區(qū)域為V3-V4區(qū)，使用的通用引物為341F和806R。在通用引物的5′端加上適合Illumina Miseq PE250測序的index序列和接頭序列，完成特異性引物的設(shè)計。Forward Primer（5′-3′）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341F）；Reverse Primer（5′-3′）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806R）。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR kit高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴增的準(zhǔn)確性和高效性。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物。回收后，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度計和2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫質(zhì)檢。文庫質(zhì)檢合格后，使用Qubit進(jìn)行文庫定量，并根據(jù)每個樣品的數(shù)據(jù)量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。使用Illumina Miseq PE250進(jìn)行上機測序。

1.3 耐藥基因的檢測 按照糞便基因組DNA提取試劑盒(TIA Namp Stool DNA kit)說明書提取樣本DNA。首先通過PCR和電泳對8種四環(huán)素類抗性基因（）進(jìn)行定性檢測。對于定性檢測到的基因進(jìn)行定量測定。引物由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Master Mix（2×Conc.）10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，混合染料（50× Conc.）0.4 μL，模板（50 μg/mL）2.0 μL，ddHO 6.8 μL。定量PCR的程序條件：95℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行40個循環(huán)，循環(huán)內(nèi)程序為95℃ 10s，退火30 s（退火溫度見表2），熔解曲線95℃ 15 s，60℃60 s，95℃ 15s。為消除PCR抑制物的干擾，DNA樣品稀釋10倍后再進(jìn)行定量PCR。DNA的定量在LightCycler480II（Roche，德國）上進(jìn)行。定量PCR擴增效率控制在100%±10%。同時檢測熔解曲線是否出現(xiàn)非特異性擴增。

表1 ARGs和16SrDNA基因引物信息

1.4 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)均用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件處理，以平均數(shù)±方差表示，以<0.05為差異顯著。各組間數(shù)據(jù)采用Duncan′s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗。對微生物組數(shù)據(jù)進(jìn)行Student′s檢驗，使用Pearson相關(guān)性分析生成腸道差異物種與耐藥基因之間的相關(guān)矩陣，并利用Graphpad prism作圖。

2 結(jié)果

2.1 抗生素對腹瀉仔豬糞便菌群的影響

2.1.1 OUT分析 腹瀉組與抗生素組共有OTU數(shù)為142，腹瀉組特有的OTU為377，抗生素治療組特有的OTU為75（圖1-A）。主成分分析初步反映出不同處理或不同環(huán)境間的樣品可能表現(xiàn)出分散和聚集的分布情況，結(jié)果表明腹瀉組與抗生素組差異明顯（圖1-B）。物種累積曲線在急劇上升后變?yōu)樯仙婢?，表明抽樣充分（圖1-C）。

圖1 抗生素治療后仔豬糞便菌群OTU分析

2.1.2 菌群α多樣性分析 如圖2所示，抗生素治療組菌群的Simpson、Shannon、Chao1指數(shù)以及物種數(shù)均顯著低于腹瀉組，說明抗生素治療顯著降低了腹瀉仔豬腸道的菌群多樣性。

圖2 組間Alpha多樣性盒型圖

2.1.3 菌群結(jié)構(gòu)分析 物種分類和豐度分析結(jié)果顯示（圖3），腹瀉仔豬的腸道菌群在門水平上共涉及到13個菌門，其中數(shù)量最大的菌門為擬桿菌門（Bacteroidetes），次豐富的為厚壁菌門（Firmicutes）；此外還發(fā)現(xiàn)梭桿菌門（Fusobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia）本身不存在于腹瀉仔豬腸道中，而在使用抗生素后出現(xiàn)。在屬水平上，普氏菌屬（）是腹瀉仔豬中最豐富的的菌屬（54.7%），而抗生素組中最豐富的菌屬為占比35.5%的擬桿菌屬（）；另有梭菌屬（）僅出現(xiàn)在抗生素組仔豬菌群中。

圖3 不同分類水平組間菌群結(jié)構(gòu)柱狀圖

2.1.4 菌群顯著性差異分析 在屬水平上，檢測出兩組間豐度差異顯著的17個菌屬（圖4），在抗生素組豐度顯著提高的有擬桿菌屬（）、志賀氏菌屬（）、薩特氏菌屬（）、副擬桿菌屬（）、柯林斯氏菌屬（）、；顯著降低的有普氏菌屬（）、擬普雷沃菌屬（）、考拉桿菌屬（）、糞球菌屬（）、。

圖4 屬水平差異物種分析盒型圖

2.2 抗生素腹瀉仔豬糞便菌群耐四環(huán)素基因的影響 對兩組樣品中8種常見的抗四環(huán)素基因進(jìn)行定性檢測后發(fā)現(xiàn)4種耐藥基因的存在，對4種基因進(jìn)一步進(jìn)行定量檢測，結(jié)果如圖5-A所示，抗生素治療組中含量均高于腹瀉組，其中具有極顯著差異。

2.3 抗生素處理組菌群與耐藥基因相關(guān)分析 如圖5-B所示，對差異菌群及耐藥基因進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，擬普雷沃菌屬（）與4種抗四環(huán)素基因均存在負(fù)相關(guān)關(guān)系（<-0.6），梭菌屬（）與3種基因存在正相關(guān)關(guān)系（>0.6）。另外，與基因正相關(guān)的菌屬有擬桿菌屬（）、；與tetC基因負(fù)相關(guān)的菌屬有普氏菌屬（）、考拉桿菌屬（）、；與正相關(guān)的菌屬有擬桿菌屬（）、；與負(fù)相關(guān)的菌屬有普氏菌屬（）、考拉桿菌屬（）、；與tetQ負(fù)相關(guān)的菌屬有考拉桿菌屬（）、。

圖5 抗生素治療豬糞便菌群與抗生素耐藥基因相關(guān)分析

3 討 論

菌群作為生物體不可或缺的一部分，在仔豬的生長發(fā)育過程中起著重要作用。He等研究表明，在仔豬腸道中厚壁菌門和擬桿菌門是絕對優(yōu)勢菌門，這與本試驗的結(jié)果一致。用抗生素進(jìn)行治療后，腹瀉仔豬腸道菌群α多樣性顯著降低，說明抗生素會損害腹瀉仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其生物多樣性下降。根據(jù)的豐度增加與減輕腸道屏障損傷改善代謝綜合征有關(guān)的結(jié)論，推測本試驗中，抗生素處理后其豐度增加與抗生素所發(fā)揮的抗炎作用有關(guān)。有研究指出，在低飼料利用率豬的腸道微生物群中擬桿菌屬（）豐度較高，在自閉癥兒童腸道中發(fā)現(xiàn)薩特菌（）引起消化障礙，本研究中抗生素治療組中此2種菌屬的豐度降低可能是由于抗生素的使用對仔豬消化系統(tǒng)產(chǎn)生了負(fù)面影響；同時，抗生素處理降低了厭氧菌和數(shù)量，此現(xiàn)象與攻毒后的豬菌群變化情況相似；考拉桿菌屬（）、乳桿菌屬、都是產(chǎn)酸菌，研究表明它們可以協(xié)助宿主進(jìn)行脂肪酸代謝，本試驗中抗生素治療組考拉桿菌屬數(shù)量顯著降低，說明抗生素對某些有益菌屬定植有著一定的消極作用。Langdon等研究發(fā)現(xiàn)菌群重建降低抗生素耐藥細(xì)菌在艱難梭菌感染復(fù)發(fā)患者腸道中的定植，說明利用菌群與抗性基因間的相關(guān)關(guān)系可以防控耐藥細(xì)菌感染和耐藥性傳播。徐成剛等對華南地區(qū)豬場中9種四環(huán)素耐藥基因調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于副豬嗜血桿菌中，而本研究發(fā)現(xiàn)的多種菌屬與抗四環(huán)素基因間相關(guān)關(guān)系中并無存在，而是檢測到4種基因；抗生素處理后菌群與耐藥基因之間具有強的相關(guān)性，尤其是擬普雷沃菌屬（）與4種抗四環(huán)素基因均負(fù)相關(guān)，推測該菌屬少有攜帶抗四環(huán)素基因；而梭菌屬（）與3種基因正相關(guān)，推測該菌屬較多具有四環(huán)素耐藥基因，與本試驗結(jié)果類似。Tunsagool等研究發(fā)現(xiàn)工業(yè)化養(yǎng)殖條件下的豬盲腸中梭菌屬和tetW基因正相關(guān)；徐先林等在兒童糞便中檢測四環(huán)素耐藥基因，總檢出率為83.2%，說明了四環(huán)素耐藥基因廣泛分布，本研究證明抗生素治療后的腹瀉仔豬基因豐度顯著升高，并且與多種菌屬具有相關(guān)性，為從菌群調(diào)控角度降低細(xì)菌耐藥性提供了新思路。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，對腹瀉仔豬進(jìn)行抗生素治療降低了仔豬腸道菌群的多樣性，使菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈改變，同時增加了菌群基因組中抗四環(huán)素基因的豐度。