精漿外泌體的轉(zhuǎn)運機制及生物學功能研究進展

秦佳麗，孫敬帥，曹婷婷,，李智麗，朱 琳，趙云翔,*

（1.佛山科學技術(shù)學院生命科學與工程學院，廣東佛山 528000；2.廣西揚翔股份有限公司，廣西貴港 537000）

在睪丸形成的哺乳動物精子經(jīng)過與周圍液態(tài)微環(huán)境間的相互作用，發(fā)生形態(tài)和功能上的變化，最終發(fā)育為具備運動能力以及與卵細胞結(jié)合能力的成熟精子。雄性生殖道的液體環(huán)境中存在大量囊泡，這些囊泡對精子的發(fā)育和生理過程起到非常重要的調(diào)節(jié)作用，其中直徑在30～100 nm的囊泡被稱為外泌體（Exosomes，EXs）。EXs是由多種活細胞主動分泌至胞外的小囊泡，在哺乳動物的多種體液中廣泛存在，其包含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等多種物質(zhì)，可以介導物質(zhì)運輸并參與多種生物過程的調(diào)節(jié)，存在于精液中的EXs被稱為精漿外泌體（Seminal Plasma Exosomes，spEXs）。spEXs將調(diào)節(jié)生育力的蛋白轉(zhuǎn)運至精子表面，具有顯著改善精子運動參數(shù)，抵抗精子損傷、影響精子受精過程的生物學功能。對于spEXs的研究有助于理解精子成熟和受精的生理過程，同時spEXs在提升精液品質(zhì)、作為雄性生殖疾病與生殖性能標志物以及雄性生殖疾病的藥物載體上具有良好的應用前景，但有關(guān)spEXs作用機制方面的研究還十分匱乏，因此本文圍繞spEXs的轉(zhuǎn)運機制以及對哺乳動物精子的調(diào)控作用展開闡述，旨在為spEXs在精子發(fā)育中的研究提供一定參考。

1 spEXs的發(fā)現(xiàn)和來源

1.1 EXs的發(fā)現(xiàn) 1983年，EXs首次發(fā)現(xiàn)于綿羊網(wǎng)織紅細胞中。Johnstone等于1987年將這種通過細胞上清液超高速離心后得到的膜性小囊泡命名為EXs。隨后人們在多個物種的不同細胞和體液中相繼發(fā)現(xiàn)EXs。因為當時缺乏更為深入的了解，人們一度將EXs視為細胞代謝的廢物。直到1996年，有報道稱來源于人和小鼠B淋巴細胞的EXs內(nèi)包含組織相容性復合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）II類分子，可以通過呈遞抗原誘導T細胞產(chǎn)生反應，從此EXs得到了更多關(guān)注和深入研究。Valadi等研究發(fā)現(xiàn)，肥大細胞產(chǎn)生的EXs可以將mRNA轉(zhuǎn)移到其他肥大細胞并被翻譯成蛋白質(zhì)，他們將這種RNA稱為EXs穿梭RNA。這意味著EXs可以通過傳遞多種信號分子調(diào)控生物表達和功能，隨著EXs純化分離技術(shù)的不斷成熟和規(guī)范，EXs的相關(guān)研究開始呈爆發(fā)式增長。

首次發(fā)現(xiàn)spEXs是在人類的前列腺液中，因此這些由多層膜包被的小囊泡被稱為前列腺小體，之后陸續(xù)在大鼠、公羊、公牛和公豬多個物種的附睪液或精液中也分離出類似的膜狀囊泡。spEXs以高含量的膽固醇和鞘磷脂為特征，在傳統(tǒng)電鏡下觀察為茶托狀多層脂質(zhì)小囊泡（圖1），EXs中富含膜蛋白家族中的四次跨膜蛋白（如CD9、CD63、CD81），這些跨膜蛋白可以作為標志物協(xié)助識別EXs的細胞起源、細胞內(nèi)含物質(zhì)以及作用的靶細胞。

圖1 電鏡下spEXs及其粒徑分布圖[7]

1.2 不同來源的spEXs spEXs來源于睪丸、附睪、前列腺及其他副性腺生殖道分泌液。由于大多數(shù)睪丸液在隨精子進入附睪時被附睪頭部所吸收，未吸收睪丸液僅占精漿的2%～3%，而其他副性腺分泌液占精漿比例約1%，所以射出精液的EXs主要源于附睪液和前列腺液，根據(jù)來源分別稱為附睪小體與前列腺小體（圖2）。

圖2 雄性生殖道中附睪小體和前列腺小體[17]

由于進入附睪后轉(zhuǎn)錄停止，精子在發(fā)育過程中高度依賴作為其周圍環(huán)境的雄性生殖道分泌液，附睪小體內(nèi)裝載的分子物質(zhì)可以與精子表面發(fā)生相互作用并完善精子的形態(tài)和功能，在精子成熟過程中起到不可或缺的作用。從解剖學角度可以將附睪分為起始段、頭部、體部和尾部，各節(jié)段在功能上都表現(xiàn)出高度區(qū)域化、功能化的特征。研究表明附睪小體蛋白質(zhì)和miRNA在附睪各段的表達水平呈現(xiàn)出明顯的節(jié)段特異性，這一特征與附睪不同節(jié)段功能區(qū)域化的特征相吻合，揭示附睪小體與附睪功能間的緊密聯(lián)系。

前列腺小體中的蛋白質(zhì)主要以酶類和轉(zhuǎn)運蛋白為主，相比于附睪小體，脂質(zhì)中含有更高的膽固醇/磷脂比例。前列腺小體被證明與抗菌、免疫調(diào)節(jié)、精子獲能、精子活力以及抗氧化保護等有關(guān)。此外，不同生理狀態(tài)的前列腺小體呈現(xiàn)異質(zhì)性，前列腺小體miRNA在作為前列腺相關(guān)疾病的生物標志物上已取得一定的研究成果。

2 spEXs的分泌、轉(zhuǎn)運機制

2.1 形成與分泌 EXs的形成是細胞質(zhì)膜連續(xù)內(nèi)陷形成多囊體，最終向胞外釋放出腔內(nèi)小囊泡的過程，在這一過程中，蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等物質(zhì)被特定地富集并裝載進EXs，最終被運送至靶細胞。這種由膜性小泡包裹的轉(zhuǎn)運方式可以很大程度上保護轉(zhuǎn)運物質(zhì)不受外界復雜微環(huán)境的影響。

spEXs在不同節(jié)段的分泌方式不同。附睪上皮細胞以頂分泌的方式釋放附睪小體，這種分泌方式是通過頂端小泡的破裂將作為內(nèi)容物的EXs釋放進附睪腔內(nèi)，整個過程不涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的參與，與通過胞吐形成的分泌囊泡也有一定區(qū)別。前列腺小體則在形成后儲存于前列腺的儲存囊中，通過腺泡上皮細胞以胞吐的方式向胞外分泌。

2.2 轉(zhuǎn)運機制 由于前列腺小體的膜特性，精子可以通過胞吞方式攝取前列腺小體的內(nèi)含物。附睪小體介導的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運機制也取得了一定的研究成果，一些缺乏末端信號肽結(jié)構(gòu)的附睪蛋白可以通過糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨點與精子結(jié)合。GPI是一種與許多膜蛋白共價連接的磷脂，為蛋白質(zhì)提供一種附著到脂質(zhì)雙層外層上的方式。許多來源于雄性生殖道上皮細胞且含有GPI錨定位點的蛋白被錨定在精子表面，例如小鼠的精子黏附蛋白1（Sperm Adhesion Molecule 1，SPAM1）和透明質(zhì)酸酶、倉鼠的P26h蛋白及公牛體內(nèi)同源基因的P25b蛋白等，而這些蛋白質(zhì)均被報道與精卵識別或是精卵互作相關(guān)。

轉(zhuǎn)運“貨物”的接受區(qū)域主要位于頂體后部，再者是頂體，而在鞭毛區(qū)域幾乎沒有檢測到轉(zhuǎn)運的痕跡，這一結(jié)論在Zhou等的研究中得到佐證，其進一步發(fā)現(xiàn)這可能是由于附睪小體對蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運分為2個連續(xù)的階段：即前期蛋白質(zhì)在頂體后部的積累以及后期蛋白質(zhì)向頂體以及鞭毛中段區(qū)域的分散，其中前期涉及到的囊泡融合可能對于后期的分散會產(chǎn)生一定影響（圖3）。

圖3 附睪小體-精子的蛋白轉(zhuǎn)運模式[21]

動力蛋白一族在精子頂體攝取“貨物”過程中起重要的介導作用。當精子與附睪小體共培養(yǎng)時，動力蛋白1在頂體周圍和頂體后區(qū)域之間發(fā)生明顯的重新定位，這種重新定位可能是通過動力蛋白1與膜筏結(jié)合實現(xiàn)的，目的是定位膜上的酶從而更好地促進精子攝取附睪小體中的蛋白質(zhì)。

轉(zhuǎn)運過程通常還具備以下2個特點：第1個特點是靶向選擇性。Andrea等研究發(fā)現(xiàn)，從附睪頭部收集的附睪小體與附睪頭部收集的精子共孵育時的轉(zhuǎn)運效率遠大于與附睪尾部收集精子的轉(zhuǎn)運效率。這說明在雄性生殖道中的轉(zhuǎn)運是有選擇性、目的性地轉(zhuǎn)運，其中可能受到一些信號分子的調(diào)節(jié)與控制。第2個特點為轉(zhuǎn)運依賴一定的環(huán)境條件。研究表明，37℃的環(huán)境條件相比于22℃具有更高的轉(zhuǎn)運效率，同時這個過程也依賴pH，pH為6.0～6.5的微酸性環(huán)境的轉(zhuǎn)運效率比pH 7.5時高出2.5倍；鋅離子濃度亦能影響蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運，當其濃度控制在0.1～1.5mmol/L的范圍內(nèi)有利于轉(zhuǎn)運的進行。考慮到在正常生理狀態(tài)下附睪液的pH為6.5以及附睪組織中含有高濃度的鋅，轉(zhuǎn)運的體外最佳條件與生理環(huán)境間具有很大的近似性和相關(guān)性。

雖然關(guān)于spEXs的轉(zhuǎn)運已取得較為豐富的研究成果，但關(guān)于特定物質(zhì)在EXs中的富集以及EXs的靶向結(jié)合是受何種物質(zhì)調(diào)控依舊不清晰，除蛋白質(zhì)外其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)運機制也需要進行深入研究。

3 spEXs的生物學功能

spEXs在精子發(fā)育過程中可以發(fā)揮多種生物學功能（表1），從而對精子不同階段的生理狀態(tài)和生理過程進行精細調(diào)控。

表1 spEXs的生物學功能

3.1 改善精子運動參數(shù) 雄性不育的大部分原因是精子質(zhì)量不佳，精子運動參數(shù)是衡量精子質(zhì)量的重要指標。精子活力是精子運動能力的宏觀體現(xiàn)。Du等研究發(fā)現(xiàn)在精子培養(yǎng)液中添加4倍和16倍的spEXs可有效提高精子活力并延長精子活力保持時間，結(jié)合EXs轉(zhuǎn)運機制的特點，spEXs可能是通過富集周圍環(huán)境以及EXs自身包含的活力調(diào)節(jié)分子轉(zhuǎn)運至精子中，從而影響精子活力。弱精子癥是一種以精子活力低下為主要特征的男性生殖疾病，是導致男性不育的重要原因之一。弱精子癥患者的spEXs與正常精液間存在顯著差異，如Abu-Halima等對正常男性和弱精子癥男性spEXs miRNA進行測序分析，結(jié)果顯示在弱精子患者的spEXs中，miR-765和miR-1275的表達水平顯著升高，miR-15a的表達水平則顯著降低，這3種miRNA分別在不育、精索靜脈曲張以及生精困難的研究中被報道過。弱精子癥與正常spEXs的蛋白質(zhì)組也呈現(xiàn)表達差異，林瑜通過測序發(fā)現(xiàn)TRPV6、ACE、PRSS8和PPAP2A等蛋白在弱精子癥患者spEXs中顯著下調(diào)，其中TRPV6可以從附睪小體轉(zhuǎn)移至精子并被定位至精子頂體以及頸部區(qū)域。Murdica等對比正常男性與弱精子癥患者spEXs蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)來自正常男性的spEXs比弱精子癥男性具有更高的半胱氨酸豐富分泌蛋白1（Cysteine Rich Secretory Protein 1，CRISP 1）表達水平，隨后其通過Western Blot驗證了spEXs介導CRISP 1蛋白向精子的轉(zhuǎn)移?；蚯贸∈笤诟讲G上皮分化和管腔酸化方面都顯示出明顯的缺陷，上皮細胞的缺陷會導致精子活力下降，而管腔酸化則是精子成熟和儲存的關(guān)鍵。將正常男性的spEXs添加至弱精子癥患者的spEXs中，精子在體外依舊可以接受EXs的轉(zhuǎn)運并且顯著提高了活力低下精子的活力，這一發(fā)現(xiàn)為弱精子癥的治療提供了新的思路。

高運動力的精子依賴于足夠的ATP才能維持運動狀態(tài)，精子中的ATP主要通過線粒體呼吸鏈以及糖酵解2種代謝方式提供。人、犬、馬、牛4個物種的前列腺小體都可以表達糖酵解酶并生成依賴于ATP酶活性控制的細胞外ATP。胞外ATP則被證明可以刺激精子的超活化、提高超活化精子比例及體外受精的受精率。Guo等實驗證明豬spEXs產(chǎn)生的細胞外ATP不僅顯著提高了精子活力，還降低了細胞凋亡率，精子線粒體膜電位也顯著提高；同時該研究還證明胞外ATP可以促進精子內(nèi)部線粒體對于乳酸的利用，進一步提高胞內(nèi)ATP濃度，降低了ADP/ATP比值。這說明spEXs產(chǎn)生的胞外ATP可以通過調(diào)節(jié)線粒體代謝以控制精子活力。

Ca內(nèi)流對維持精子活力、頂體反應以及精子超活化至關(guān)重要。能夠調(diào)節(jié)Ca內(nèi)流的精子陽離子通道（CatSper）是精子中唯一表達的陽離子通道蛋白家族，缺乏CatSper的雄性小鼠和基因突變的男性由于缺少精子的過度激活而表現(xiàn)出不育。CatSper通道需要被孕酮等生理物質(zhì)激活，有報道顯示前列腺小體能夠提供CatSper通道激活所需的Ca信號傳導工具，在鈣信號的調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。將精液中的前列腺小體分離出來后，孕酮誘導CatSper通道激活的鈣信號被嚴重破壞，這是因為由前列腺小體轉(zhuǎn)運至精子的蛋白質(zhì)在CatSper通道激活過程中扮演了重要角色。

3.2 抵抗精子損傷 精子在體外常因為外界環(huán)境刺激發(fā)生損傷，過量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）會介導氧化反應引起精子氧化應激，造成脂質(zhì)過氧化，DNA片段化等損傷，最終影響精子的形態(tài)和功能。前列腺小體可以抑制ROS產(chǎn)生，Kumar等向公牛新鮮以及凍融精液中添加1 mg/mL的前列腺小體，ROS含量顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)采用不同倍數(shù)的spEXs對公豬精子進行處理均可以顯著減緩精子發(fā)生氧化應激的趨勢，提高精子的總抗氧化活性，這是因為前列腺小體可以通過將脂質(zhì)轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)膜來抑制中性粒細胞的還原型輔酶II（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate，NADPH）氧化酶活性，從而抑制ROS產(chǎn)生。同時，這可能與spEXs中高含量的膽固醇有關(guān)，spEXs與精子發(fā)生膽固醇交換，從而改變精子質(zhì)膜膽固醇/磷脂比率，提高精子質(zhì)膜穩(wěn)定性，減少精子質(zhì)膜的脂質(zhì)過氧化。

細菌也可以對精子造成不同程度的損傷，這些負面效應主要通過細菌分泌的毒素、代謝物或直接附著在精子發(fā)生作用，嚴重者甚至導致不育。前列腺小體（1 mg/mL）與巨大芽孢桿菌在37℃條件下共培養(yǎng)后，巨大芽孢桿菌的生長被前列腺小體完全抑制。這歸功于前列腺體中大量的嗜鉻粒素能夠通過細菌壁和膜形成通道，發(fā)揮抗菌作用。此外，前列腺小體還能夠引起細菌的膜變形，導致細菌丟失生存的必須條件而死亡。

精子的膜系統(tǒng)可以維持精子的基本形態(tài)結(jié)構(gòu)，保護精子中的物質(zhì)不受外界環(huán)境的干擾，質(zhì)膜和頂體膜受損會直接影響精子活力與存活。spEXs對精子質(zhì)膜具有保護作用，體外添加前列腺小體可顯著改善公牛的新鮮和凍融精液的頂體膜完整性，公豬精子質(zhì)膜可通過添加spEXs得到改善，質(zhì)膜有序性顯著下降，有效延長了精子的保存時間。

3.3 參與調(diào)控受精過程 精子獲能是受精的前提條件，這是一個伴隨著膽固醇流失、蛋白質(zhì)磷酸化、精子膜流動性增加以及Ca信號傳遞的復雜生理過程。前列腺小體被證明在獲能過程中對蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化有抑制作用并顯著降低了精子的獲能水平。spEXs則可以通過抑制蛋白質(zhì)磷酸化、膽固醇外流以及膜流動性等多種方式抑制精子提前獲能，Piehl等的spEXs體外添加實驗證實了這一觀點，該實驗結(jié)果顯示EXs阻止了14 ku的蛋白質(zhì)的磷酸化，從而抑制其獲能后的表達，還發(fā)現(xiàn)EXs同時抑制了獲能過程中的膽固醇流失和膜流動性的增加。Du等對公豬精子進行spEXs處理后通過檢測Ca濃度判斷精子的獲能情況，結(jié)果顯示獲能精子的占比在EXs作用下顯著下降并呈現(xiàn)劑量依賴性。避免提前獲能更有利于保存精子實力，使精子在到達受精位置前避免不必要的能量消耗，這些研究提示spEXs或許在精子長期保存中可以發(fā)揮作用。

當精子在雌性生殖道中遷移時，精子的抗原性會使其受到機體免疫系統(tǒng)的攻擊。前列腺小體具有免疫抑制能力，Tarazona等研究發(fā)現(xiàn)前列腺體小體中高水平表達CD244受體的配體CD48，自然殺傷細胞（Natural Killer Cell）與前列腺小體的相互作用導致CD244表達降低，并抑制自然殺傷細胞激活。此外，前列腺小體可干擾補體系統(tǒng)，前列腺小體膜成分中表達的CD9、CD46、CD55、CD59和CD63可以抑制雌性生殖道中的膜攻擊復合物（Membrane Attack Complex，MAC）的攻擊，保護精子免受雌性生殖道的補體攻擊，從而使更多的精子通過雌性生殖道，更好地完成受精。

頂體反應和透明帶反應是精卵結(jié)合中發(fā)生的重要生理過程。研究發(fā)現(xiàn)在人和豬中前列腺小體與雌雄配子共孵育可以刺激頂體反應的發(fā)生，這一過程是通過調(diào)動雌性生殖道中的孕酮來實現(xiàn)的，前列腺可以向精子供給孕激素受體，增加精子對孕酮的敏感性。在雌雄配子共孵育獲能期以及透明帶反應時加入spEXs可以顯著抑制透明帶反應的發(fā)生。spEXs是通過抑制精子獲能去勢因子的表達（如透明帶結(jié)合蛋白AWN）來抑制透明帶反應發(fā)生。

4 結(jié) 語

spEXs以獨特的分泌轉(zhuǎn)運機制將分子物質(zhì)運送至精子中，補充精子發(fā)育所需的大分子物質(zhì)并調(diào)節(jié)多種信號通路，從而調(diào)節(jié)精子運動參數(shù)、協(xié)助抵抗精子損傷以及影響精子獲能與精卵結(jié)合的過程。近年來，有關(guān)于spEXs的研究主要集中以下3個方向：①利用高通量測序技術(shù)探究不同樣品在蛋白質(zhì)組、RNA組的差異表達分子；②探究spEXs在生殖過程中發(fā)揮的生物學功能；③spEXs分離提取及表征方法的優(yōu)化。對spEXs的認知目前還處于比較淺顯的階段，接下來需要把得到的差異分子與具體的生物學功能聯(lián)系在一起，豐富spEXs發(fā)揮調(diào)控作用的具體分子機制，這將有助于更深入地理解精子成熟過程中各種生理變化，找到影響生殖力的關(guān)鍵因素。隨著spEXs提取方法的不斷優(yōu)化和提取成本的降低，spEXs的研究進程會進一步加快，spEXs有望在改善雄性不育、提升精液質(zhì)量、延長精液保存上帶來巨大的經(jīng)濟價值。