聚苯乙烯微塑料對典型農(nóng)作物種子發(fā)芽和幼苗生長的影響

陳賦秋雪，唐思琪*，袁昊，馬子軒，陳坦, ，楊婷, ，張冰, ，劉穎,

1.中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2.中央民族大學(xué)北京市食品環(huán)境與健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081

人類活動產(chǎn)生的塑料制品在環(huán)境中暴露，經(jīng)風(fēng)化等作用后，破碎成尺寸小于5 mm的塑料稱為微塑料（Richard et al.，2004；Law et al.，2014），常見聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯（PVC）等材質(zhì)（Cole et al.，2011；侯軍華等，2020）。微塑料粒徑小、質(zhì)量輕，能在外力作用下遠距離遷移，在水體、土壤、大氣等介質(zhì)中普遍檢出（Alimi et al.，2018；邵媛媛等，2020），可進入生物體（Chae et al.，2018；任欣偉等，2018）。每年進入農(nóng)業(yè)用地中的微塑料量極大，可能超過海洋中微塑料的總量（Nizzetto et al.，2016）。農(nóng)膜的廣泛應(yīng)用是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中土壤微塑料的主要來源之一（任欣偉等，2018；胡桂林，2019）。

土壤是人類農(nóng)業(yè)活動的重要介質(zhì)，作物的生長不可避免地受到土壤環(huán)境中微塑料等各種物質(zhì)的影響。微塑料可改變土壤的物理、化學(xué)和生物特性，直接或間接影響植物的生長（Wan et al.，2019；Shi et al.，2022）。已有研究表明，100 nm的聚苯乙烯微塑料降低了蠶豆（Vicia faba）根系生物量和過氧化氫酶活性，對其植株生長有抑制作用（Jiang et al.，2019）。亞微米級球狀微塑料被植物吸收、轉(zhuǎn)運和積累，可隨蒸騰作用和營養(yǎng)運輸從根部轉(zhuǎn)移到莖、葉等上部器官（Li et al.，2020），進入細胞連接或細胞壁孔隙，造成細胞破損，影響營養(yǎng)運輸及植株生長（李連禎等，2019），從而影響作物代謝、發(fā)育特性，進而影響作物和土壤生態(tài)環(huán)境，甚至可能在作物中生物富集，通過食物鏈威脅人體健康（Kong et al.，2018；駱永明等，2018）。在作物萌發(fā)及生長初期，種子各項生理活動活躍，對外界環(huán)境敏感，且與作物幼苗后續(xù)生長密切相關(guān)，觀察種子萌發(fā)和早期幼苗生長情況是目前評估高等植物生理毒性的重要方法（Gong et al.，2001）。分析微塑料對不同作物萌發(fā)和生長初期的影響，對認(rèn)識微塑料的生態(tài)風(fēng)險及毒性具有重要意義。

農(nóng)業(yè)環(huán)境中的微塑料已引起廣泛關(guān)注，目前關(guān)于微塑料對萌發(fā)和生長初期農(nóng)作物影響方面的研究尚待深入。由于具有良好的化學(xué)性能和較低的價格，PS常被用于如農(nóng)膜等各種產(chǎn)品的生產(chǎn)，因此也已成為當(dāng)前土壤生態(tài)系統(tǒng)中最常見的污染物之一（Dong et al.，2020）。因此，本文以農(nóng)膜常用材料PS為例，選擇中國種植面積廣、產(chǎn)量大的主要糧食作物小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、谷子（Setaria italica）及重要經(jīng)濟作物花生（Arachis hypogaea）、向日葵（Helianthus annuus），觀測 5 μm聚苯乙烯微塑料（5 μm-MPs）懸浮液中幾種作物種子發(fā)芽及污染土壤中幼苗生長情況，分析微塑料對作物種子及幼苗生理生化指標(biāo)的影響，為揭示微塑料對作物的生態(tài)毒性作用機制積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥種子、花生、玉米、向日葵、谷子種子分別選購魯豐濟麥22、山東紅皮花生、水果玉米中農(nóng)甜488、美國矮向日葵、黃谷小米黃金谷21。土培基質(zhì)購自黑龍江楊曉東育苗基質(zhì)加工廠生產(chǎn)，由有機營養(yǎng)土、木屑、細椰糠、珍珠巖、蛭石等混合制備，微塑料含量極少，含水率25%—30%，可溶性有機碳（DOC）、可溶性全氮（DTN）、可溶性硝態(tài)氮（DNN）、可溶性銨態(tài)氮（DAN）、可溶性有機氮（DON）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 (120.00±13.79)、(91.43±13.46)、(38.87±2.97)、(10.33±4.61)、(42.27±15.72)mg·kg?1。5 μm-MPs 粉末購自蘇州瑞納新材料科技有限公司，聚苯乙烯材質(zhì)，標(biāo)稱粒度5 μm。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒選用北京索萊寶科技有限公司的BC0170型SOD活性檢測試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子發(fā)芽試驗

實驗方法參考Sjollema et al.（2016）、連加攀等（2019）、廖苑辰等（2019）、劉鎣鎣等（2019）報道。種子發(fā)芽實驗選用5種作物種子（小麥、花生、玉米、向日葵、谷子），設(shè)置7個外加5 μm-MPs質(zhì)量濃度梯度（0、2、5、10、20、50、100 mg·L?1），3個重復(fù)。分別將0.4、1、2、4、10、20 mg 5 μm-MPs及2滴Tween 20溶液稀釋于200 mL超純水中，超聲水浴制備各質(zhì)量濃度梯度的5 μm-MPs懸浮液。將經(jīng)過去離子水浮選和1.5% H2O2溶液浸泡后的參試種子用去離子水反復(fù)沖洗并浸泡6 h后，均勻置于鋪有兩層濾紙并以去離子水潤濕的玻璃培養(yǎng)皿中，每皿10粒（谷子種子體積過小，每皿50粒）。培養(yǎng)皿中分別加入10 mL 0、2、5、10、20、50、100 mg·L?1微塑料懸浮液（超純水配置），在25 ℃無光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，從第3天開始打開培養(yǎng)皿每天補充1—2 mL去離子水以補償蒸發(fā)水分。

第3、5、7天分別觀測發(fā)芽數(shù)和芽長。小麥胚根長度超過2 mm記為發(fā)芽，玉米露白超過0.5 mm記為發(fā)芽，花生及向日葵胚根突破種皮且長度超過種子的一半記為發(fā)芽，谷子萌發(fā)露白即視為發(fā)芽。種子的發(fā)芽情況及活力指數(shù)的計算公式如下：

式中：

Rg——發(fā)芽率；

N7——7 d內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)；

N——供試種子總數(shù)；

Ig——發(fā)芽指數(shù)，單位為d?1；

Gt——t天內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；

t——對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

Iv——活力指數(shù)，單位為 g·d?1；

m7——第7天的苗干質(zhì)量，單位為g；

tg——平均發(fā)芽時間，單位為d；

F——種子在第t天的新發(fā)芽數(shù)；

Ri——抑制率；

C7——7 d內(nèi)對照組發(fā)芽數(shù)。

1.2.2 土培試驗

土培試驗采用盆栽。選用3種作物種子（小麥、玉米、花生），設(shè)置4個外加5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度（0、20、50、100 mg·kg?1，以土壤鮮質(zhì)量計），每個梯度設(shè)置2個平行重復(fù)，按1.2.1方法配制懸浮液，在花盆內(nèi)加入約 3.75 kg土壤與懸浮液攪拌均勻，以超純水調(diào)節(jié)土壤含水率至約40%，制成微塑料梯度污染土壤。種子預(yù)處理方法同種子發(fā)芽實驗方法，播種于土壤約1 cm深處，每盆15粒，室溫、自然光照下培養(yǎng)，每隔1天澆1次去離子水保持土壤濕度大體穩(wěn)定（約40%）。

種子發(fā)芽破土后每隔2天記錄幼苗生長情況，在第1片葉片達到約3 cm寬后每隔4 d用葉綠素測定儀（北京金科利達，TYS-4N型）測量葉片葉綠素相對含量SPAD值、氮含量。在加入5 μm-MPs懸浮液前及33 d土培試驗結(jié)束后，每個處理從各平行組分別取 10 g土壤樣品混合均勻得到混合土壤樣品。以 0.01 mol·L?1CaCl2溶液浸提法（固液比1?10，平衡時間2 h）處理混合土壤樣品得到浸出液，按照HJ 501—2009、HJ 668—2013等標(biāo)準(zhǔn)方法分別測定混合土壤樣品浸出液的DOC、DTN；按標(biāo)準(zhǔn)方法NY/T 1116—2014測定混合土壤樣品中的DNN、DAN，以差值法計算可DON含量。在種植33 d時，稱取鮮質(zhì)量0.2 g作物葉片研缽粉碎加入25 mL 80%丙酮充分浸泡 10 min，離心（4800 r·min?1，10 min）后取上清液，使用酶標(biāo)儀（SpectraMax i3x，美國Molecular Devices）測定663 nm（葉綠素a）、645 nm（葉綠素b）處的吸光度，計算葉綠素a和葉綠素b含量。平行組中分別取等量葉片，剪碎混勻后稱量0.1 g（鮮質(zhì)量），以SOD試劑盒法測定樣品中SOD的活性。

實驗數(shù)據(jù)采用顯著性差異分析統(tǒng)計，P<0.05時認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 水培條件下5 μm-MPs對作物發(fā)芽的影響

微塑料往往通過土壤水直接與植物作用，在作物生長初期，種子對土壤水更敏感。種子發(fā)芽試驗可直觀反映微塑料對種子發(fā)芽的影響，是通過觀察作物種子發(fā)芽情況來評估生理毒性的重要方法。以微塑料 2、5 mg·L?1為低質(zhì)量濃度，10、20 mg·L?1為中質(zhì)量濃度，50、100 mg·L?1為高質(zhì)量濃度。

萌發(fā)期的種子對外界環(huán)境因子敏感，種子發(fā)芽率和抑制率可以反映種子的萌發(fā)能力。如圖 1a、b所示，綜合兩個指標(biāo)可知，各質(zhì)量濃度5 μm-MPs處理組中小麥發(fā)芽均受抑制；玉米、向日葵除部分高質(zhì)量濃度（玉米為 100 mg·L?1，向日葵為 50 mg·L?1）表現(xiàn)為促進外其余質(zhì)量濃度均表現(xiàn)為抑制；谷子為5 μm-MPs低質(zhì)量濃度無影響，中高質(zhì)量濃度發(fā)芽得到促進。水培中5 μm-MPs對上述4種作物萌發(fā)能力的影響盡管在統(tǒng)計學(xué)意義上不顯著，但趨勢大多與微塑料可抑制或延緩種子發(fā)芽的報道一致（紀(jì)紅等，2021）。各質(zhì)量濃度處理組中花生萌發(fā)能力均受到抑制，且表現(xiàn)為5 μm-MPs質(zhì)量濃度越大，發(fā)芽受到的抑制越明顯，20、50、100 mg·L?1處理組中花生的萌發(fā)能力受到顯著抑制（P<0.05），100 mg·L?1處理組花生發(fā)芽率最低 (43.33%±5.77%)，抑制率達到125.56%。綜上所述，不同作物種子萌發(fā)對微塑料的敏感度存在差異。

發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)體現(xiàn)種子活力，這兩個指標(biāo)越大則種子活力越強，種子在試驗條件下生長情況越好。如圖1c、d所示（谷子苗干質(zhì)量過小，未測算活力指數(shù)），小麥表現(xiàn)為50 mg·L?1質(zhì)量濃度處理組種子發(fā)芽指數(shù)顯著降低，其余質(zhì)量濃度無顯著差異；花生種子活力表現(xiàn)為中高質(zhì)量濃度處理組（20—100 mg·L?1）顯著降低，且 5 μm-MPs質(zhì)量濃度越高種子活力降低幅度越大，在100 mg·L?1時達到最低，發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)分別僅為 5.51 d?1、31.34 g·d?1；玉米、谷子、向日葵種子活力對微塑料不敏感，除向日葵在部分處理組（5—20 mg·L?1）得到促進外其余均抑制，但各質(zhì)量濃度處理組均無顯著影響?？傮w上，水培條件下花生對較高質(zhì)量濃度微塑料更敏感，發(fā)芽率、活力指數(shù)等指標(biāo)在中高質(zhì)量濃度都顯著降低。文獻報道20 nm PS塑料在質(zhì)量濃度 200 mg·L?1時對大豆（Glycine max）種子活力抑制最強，100 nm PS微塑料在高質(zhì)量濃度（1000 mg·L?1）時對種子活力抑制程度最強（吳佳妮等，2020），在高質(zhì)量濃度時對大豆種子活力的抑制程度較大的結(jié)果與本研究花生種子活力指數(shù)的結(jié)果類似。其余作物種子活力受影響程度與微塑料的質(zhì)量濃度未表現(xiàn)一致相關(guān)性，對微塑料的敏感程度也不同。

種子平均發(fā)芽時間越長，發(fā)芽越慢，種子對實驗條件的適應(yīng)越難。如圖1e所示，5 μm-MPs暴露下小麥平均發(fā)芽時間主要表現(xiàn)為低、中質(zhì)量濃度抑制，高質(zhì)量濃度促進；花生主要表現(xiàn)為低、高質(zhì)量濃度抑制，中質(zhì)量濃度促進；玉米主要表現(xiàn)為低質(zhì)量濃度促進，中質(zhì)量濃度抑制，高質(zhì)量濃度抑制減弱；向日葵則在50 mg·L?1時促進，其余質(zhì)量濃度均抑制；谷子表現(xiàn)為 2、10、100 mg·L?1時抑制，其余質(zhì)量濃度促進。統(tǒng)計學(xué)意義上，水培條件下 5 μm-MPs對 5種作物的平均發(fā)芽時間影響均不顯著（P>0.05），這與文獻報道的聚甲基丙烯酸甲酯微塑料對小麥種子平均發(fā)芽時間無顯著影響的結(jié)果相似（連加攀等，2019）。

5 μm-MPs對作物水培7 d芽長的影響如圖1f所示（因芽長過短未測量谷子）。小麥主要表現(xiàn)為5 μm-MPs質(zhì)量濃度越高，芽長越短，但在統(tǒng)計學(xué)意義上無顯著性差異?；ㄉ?00 mg·L?1時受到抑制并具有顯著性差異（P<0.05），其余處理無顯著規(guī)律。玉米在 10 mg·L?1時受到抑制，其余處理均得到促進，向日葵的芽長在各處理下均為促進，但上述趨勢在統(tǒng)計學(xué)意義上不顯著。各作物種子芽長對微塑料的敏感程度不同，其中花生芽長對微塑料較敏感，花生芽長在 100 mg·L?15 μm-MPs處理下受到顯著抑制。

圖1 不同質(zhì)量濃度微塑料暴露下5種作物的發(fā)芽情況Figure 1 Germination of 5 species of crops exposed to microplastics of different mass concentrations

綜合以上指標(biāo)可知，5種作物中花生種子的萌發(fā)對微塑料更敏感。微塑料影響種子萌發(fā)及活性的機制與水培條件較相關(guān)的可能主要有兩種，（1）微塑料的積累使種子表面孔隙物理性堵塞。微塑料具有疏水性，粒徑小、比表面積大，易附著于種子上，堵塞種子孔隙，抑制植物種子的水分吸收（李瑞靜等，2021），進而影響種子萌發(fā)及活性。如Bosker et al.（2019）發(fā)現(xiàn)聚苯乙烯熒光微塑料可在水芹（Lepidium Sativum）種衣殼的孔隙中積累。（2）微塑料進入種子的細胞內(nèi)部，影響種子的生理活動。如粒徑超過植物細胞壁孔徑的納米級塑料微珠可通過內(nèi)吞作用進入煙草（Nicotiana tabacum）BY-2細胞（cv.Bright Yellow 2）（Liu et al.，2009；Vera et al.，2012）?？紤]到實驗中選用 5 μm-MPs的粒度，導(dǎo)致本研究結(jié)果的原因更可能以前者為主，花生對微塑料的敏感可能是由于花生某些結(jié)構(gòu)比其余4種作物更易于吸附或積累微塑料，表面孔隙的堵塞影響了花生種子吸收水分，進而影響其活性、萌發(fā)及芽長。文獻報道，0、0.1%、0.5%、1%、2%的PE微塑料（13、58、178 μm）均不同程度抑制了玉米和黃瓜（Cucumis sativus）種子的活力指數(shù)及芽長，且與粒徑相比，微塑料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是植物種子發(fā)芽的影響更顯著（劉曉紅等，2022）。本研究中微塑料質(zhì)量濃度越大，花生發(fā)芽及活性受到的抑制越強，更可能是由于高質(zhì)量濃度下微塑料的團聚行為對種子吸水的機械阻礙更大所致。

2.2 土培條件下 5 μm-MPs對作物生長特性的影響

2.2.1 株高

土培實驗結(jié)果可更好地反映作物的實際生長情況，株高是反映土培效果的重要形態(tài)學(xué)指標(biāo)，如圖 2所示。小麥在土培 15 d時各質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5 μm-MPs下的幼苗株高均受到顯著抑制（P<0.05），且隨5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大受到的抑制減弱，處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20 mg·kg?1時受到的抑制最強[僅為(15.17±3.67) cm，較空白組抑制了10.82%]；在土培30 d時，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 μm-MPs處理下株高均受到抑制，且隨質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高抑制作用先增大后減小，在50 mg·kg?1時抑制最強，但在統(tǒng)計學(xué)意義上各處理無顯著性差異（P>0.05）。廖苑辰等（2019）報道土培中5 μm PS對小麥株高有抑制作用，且在土壤中微塑料質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 50、100 mg·kg?1時對小麥株高均無顯著影響，這與本文土培中小麥株高的結(jié)果趨勢相似。對于玉米，除 50 mg·kg?15 μm-MPs在種植第15天和第30天時對幼苗株高有促進作用外，其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為抑制作用，但在統(tǒng)計學(xué)意義上各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的抑制作用不顯著（P>0.05）?；ㄉ谕僚?15 d時，幼苗株高在處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg·kg?1時受到抑制，其余處理受到促進，但在統(tǒng)計學(xué)意義上各處理影響均不顯著（P>0.05）；在土培30 d時，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 μm-MPs下株高均受抑制，但在統(tǒng)計學(xué)意義上無顯著影響（P>0.05）。

圖2 土培不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料脅迫下小麥、玉米、花生的株高Figure 2 Plant heights of wheat, corn and peanut under the stress of microplastics with different mass fractions in soil culture

就培養(yǎng)時間而言，土培條件下不同生長時期中作物幼苗的株高對5 μm-MPs的敏感程度不同。微塑料在種植期間第15天對幼苗株高影響的顯著性頻次數(shù)據(jù)比第30天的大，生長前期的微塑料影響機制可能主要為通過堵塞植物根部通道影響植物營養(yǎng)水分傳遞，進而影響株高，但細胞損傷可能可逆，隨著作物的生長，作物幼苗對微塑料的抗性有所提高，削弱了微塑料的抑制作用。文獻報道，相比質(zhì)量濃度，PE微塑料對玉米株高有更顯著的粒徑效應(yīng)（劉曉紅等，2022）。本研究中較多質(zhì)量濃度下5 μm-MPs對作物株高的影響不顯著，符合前述文獻報道的規(guī)律，推測影響機制可能為根部的物理堵塞。

2.2.2 葉片葉綠素

植物葉綠素的含量反映了植物光合能力的強弱，是植物生理水平的重要指征，葉綠素儀能夠在種植過程中實時監(jiān)測植物葉面的SPAD值并以此表示植物葉片葉綠素的相對含量。培養(yǎng)過程中花生葉片較小無法檢測其SPAD值，因此只檢測了小麥及玉米葉面SPAD值變化。如圖3a所示，小麥葉片的SPAD值隨培養(yǎng)時間的延長而降低，各處理組中SPAD 值除 21 d 的 20 mg·kg?1和 50 mg·kg?1處理外，其余均低于對照組，在第17天的 50 mg·kg?1處理下顯著偏低（P<0.05）。Lian et al.（2020）報道0.1 mg·L?1和 1 mg·L?1的 PS 納米塑料可顯著提高小麥的SPAD值，這與本研究結(jié)果有差異，推測納米級別和微米級別微塑料對植物的影響機制不同（Tan et al.，2018），微塑料對植物生長的影響與微塑料粒徑關(guān)系密切。如圖3b所示，培養(yǎng)過程中玉米葉片SPAD值隨種植時間呈現(xiàn)先增后減的趨勢，除第29天的100 mg·kg?1、第33 天的 20、100 mg·kg?1處理外，其余均低于對照組。在統(tǒng)計學(xué)意義上，僅第33天的20 mg·kg?1處理顯著高于對照組（P<0.05）。SPAD 值表示植物葉片葉綠素相對含量，上述SPAD值變化情況反映了作物葉面葉綠素含量變化趨勢，本研究結(jié)果說明不同作物的葉片葉綠素含量對 5 μm-MPs的敏感程度不同，且隨著培養(yǎng)時間延長，作物對微塑料脅迫的反應(yīng)也有變化。文獻報道聚氯乙烯（PVC）微塑料在7 d內(nèi)對大豆幼苗光合效率影響不大，更長時間則表現(xiàn)出微塑料低質(zhì)量分?jǐn)?shù)抑制，中、高質(zhì)量分?jǐn)?shù)恢復(fù)的趨勢（安菁等，2021），這與本文玉米葉片葉綠素含量結(jié)果在時間上的變化趨勢相似，可能是由于植物體內(nèi)葉綠素合成等相關(guān)轉(zhuǎn)化過程因植物更易于利用或吸收低濃度微塑料所致（廉宇航等，2022）。葉片的光合作用與葉片氮含量有關(guān)，通常葉片氮會分配到葉綠體中參與光合作用（Evans，1989；Warren et al.，2022）。小麥葉片葉綠素含量與葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢有一定相似性，而玉米葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與葉綠素含量變化趨勢無一致性，印證了微塑料對不同作物的葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及葉綠素含量影響機理可能存在差異。

圖3 土培不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料脅迫下小麥、玉米生理指標(biāo)變化Figure 3 Changes of physiological indexes of wheat and corn under the stress of microplastics with different mass fractions in soil culture

培養(yǎng)33 d時，如表1所示，相比對照組，5 μm-MPs各處理組小麥葉片的葉綠素 a質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低，20、100 mg·kg?1處理下葉綠素a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著減少（P<0.05），其中 20 mg·kg?1處理最低（2.97 mg·g?1）；葉綠素 b 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨 5 μm-MPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加先降低后恢復(fù)，但在統(tǒng)計學(xué)意義上與對照組無顯著差異（P>0.05）。玉米葉片葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比對照組均顯著下降（P<0.05），隨5 μm-MPs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加均呈先降低后升高趨勢，其中20 mg·kg?1處理時葉綠素a及葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最小，分別僅為 2.07 mg·g?1和 4.66 mg·g?1。5 μm-MPs使兩種作物的葉綠素a/b比值均降低，小麥在 20 mg·kg?1處理出現(xiàn)最小值（0.60），玉米在 50、100 mg·kg?1時均出現(xiàn)最小值（0.42）。黑藻（Hydrilla verticillata）在3 μm聚苯乙烯不同濃度脅迫下葉綠素總含量、葉綠素a和葉綠素a/b比值均顯著降低（張晨等，2021），與本文結(jié)果一致，與總?cè)~綠素含量受影響的機理類似，這也可能是因為微塑料進入到植物體內(nèi)，抑制了葉綠素a、b的合成代謝途徑。文獻報道玉米的幼苗的根體積和根表面積與PE微塑料的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（劉曉紅等，2022），本研究中高于 20 mg·kg?15 μm-MPs處理對小麥及玉米葉片葉綠素的脅迫效應(yīng)反而下降也可能與此有關(guān)，即較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料的團聚作用削弱了微塑料與植物根系的接觸。

表1 土培不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)微塑料脅迫下小麥、玉米葉綠素a、葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contents of chlorophyll a and chlorophyll b in wheat and corn under the stress of microplastics with different mass fractions in soil culture

2.2.3 SOD活性

SOD是植物體中抗氧化作用的主要酶類，可清除生物體內(nèi)自由基，其活性水平體現(xiàn)了植物受外界逆境影響的程度（徐榮樂等，2010）。當(dāng)外界逆境超過承受閾值后，植物體內(nèi)的活性氧含量將超過正常的歧化能力，而對組織和細胞多種功能膜及酶系統(tǒng)造成破壞，抑制植物葉片內(nèi)的SOD活性（謝勇等，2021），SOD的活性下降幅度越大說明植物SOD體系受到的抑制越強。由圖3e可知，各處理組中小麥和玉米葉片SOD活性均顯著低于對照組（P<0.05），但小麥的SOD活性隨5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升而先增加后減少，在20 mg·kg?1處理達到最小，與對照組相比下降了 35.5%；而玉米的 SOD活性隨著 5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升呈持續(xù)上升趨勢，20 mg·kg?1處理顯著抑制SOD活性且達到最小值（P<0.05），與對照組相比下降了50.6%。

5 μm-MPs暴露引起了小麥、玉米葉片SOD活性的顯著下降，5 μm-MPs的脅迫對兩種作物的抗氧化體系產(chǎn)生了不同程度的負(fù)面影響，20 mg·kg?1處理對兩者造成的負(fù)面影響更大。已有研究發(fā)現(xiàn)隨著PVC微塑料（<15 μm）質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，大豆的SOD濃度會顯著提高（安菁等，2021），這與本文中小麥、玉米SOD活性的變化趨勢不同，可能與不同作物抗氧化系統(tǒng)抗刺激和抗逆能力的差異有關(guān)。有文獻報道通過基因轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，塑料可以直接作用于根部誘導(dǎo)抗氧化活性相關(guān)基因的下調(diào)（孫曉東，2019），該機制可能是微塑料抑制植物 SOD活性的原因。

2.3 土培中碳、氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

葉片中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是反映植物生長狀態(tài)的重要指標(biāo)。由于培養(yǎng)過程中花生葉片較小，無法檢測氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，僅檢測小麥和玉米葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化（圖3c、d）。小麥幼苗在生長過程中，葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)除第21天的 20 mg·kg?1處理高于對照組外，其余均低于對照組；第29天在 100 mg·kg?1處理受到顯著抑制（P<0.05），相比對照組抑制率為8.43%，其余時間及處理下均無顯著影響（P<0.05）。玉米葉片氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在各時間、各 5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組均受到抑制，第29天在各5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)處理組下均受到顯著抑制（P<0.05），抑制率在16%—23%之間，其余均無顯著影響（P<0.05）。有研究表明蔥（Allium fistulosum）暴露在聚酯纖維微塑料中其葉片中氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低（de Souza Machado et al., 2019），5 μm-MPs在小麥及玉米幼苗的生長中也可能存在類似機制。

微塑料會影響土壤中的可溶性營養(yǎng)物質(zhì)，而土壤的可溶性營養(yǎng)物質(zhì)含量與植物生長有著密切的聯(lián)系。如表2所示，種植小麥、玉米、花生的土壤在幼苗培養(yǎng)周期結(jié)束后，其 DOC、DTN、DNN、DAN、DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)相較培養(yǎng)前增加，而隨著土壤中5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，土壤中DNN質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷下降，其余4種指標(biāo)均上升。100 mg·kg?15 μm-MPs脅迫下，玉米土壤DON質(zhì)量分?jǐn)?shù)增長最多，達到35.5 mg·kg?1。這與高質(zhì)量分?jǐn)?shù)聚丙烯微塑料可顯著增加土壤DON與DOC的報道相似（Liu et al.，2017）。

表2 培養(yǎng)前后作物土壤中可溶性營養(yǎng)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Mass fractions of some elements in crop soil before and after culture

土壤、微塑料、植物三者是相互作用、相互影響的（馮雪瑩等，2021），一方面高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的微塑料在土壤中可能刺激作物中某些酶的活性（陳熹等，2020；劉玲等，2021），進而導(dǎo)致土壤中的碳元素和氮元素等主要營養(yǎng)元素或其他微量營養(yǎng)元素含量積累變化（Fei et al.，2020），而土壤環(huán)境營養(yǎng)元素的變化可進一步導(dǎo)致植物的株高、葉面氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)等生長特性指標(biāo)的改變，如廉宇航等（2022）報道的0.1%的PE微塑料處理下大豆根部Fe含量升高，從而引起大豆葉綠素含量升高；另一方面微塑料通過影響植物生長過程改變了土壤物質(zhì)的含量，如Zang et al.（2020）在研究PVC微塑料引起的植物-土壤系統(tǒng)中14C分配的變化時發(fā)現(xiàn)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)污染會引起微生物活性和根系分泌物周轉(zhuǎn)率增加，從而使土壤中 DOC質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。將土壤中氮磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢結(jié)合葉面氮含量變化趨勢看，僅玉米葉面氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與土壤硝態(tài)氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在添加微塑料后呈下降趨勢外，其余指標(biāo)變化趨勢并不具有一致性。玉米土壤氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的實驗結(jié)果與吾蘭（2021）的研究結(jié)果相似，該研究認(rèn)為植物吸收氮肥的主要形態(tài)是NO3?，微塑料增強了土壤中促進NO3?轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶活性，因此微塑料積累可能會通過降低土壤有效養(yǎng)分而間接影響玉米生長。而小麥的葉面氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與土壤DOC、DTN、DAN、DON的質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢不一致，有研究認(rèn)為高等植物發(fā)達的根系增加了與微塑料顆粒相互作用的可能性（Sander et al.，2019），從而減少植物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。

目前研究認(rèn)為土培中微塑料影響作物生長的機制可能有6種（Gabriela et al.，2017；Li et al.，2020；紀(jì)紅等，2021）：（1）尖銳、鋒利的微塑料可通過機械損傷降低植物細胞根長和根細胞活力；（2）堵塞根部通道，控制植物營養(yǎng)及水分傳遞；（3）微塑料可直接進入細胞連接或細胞壁孔隙，造成植物細胞的破損，影響植物正常的營養(yǎng)運輸；（4）改變土壤結(jié)構(gòu)理化性質(zhì)，影響植物養(yǎng)分吸收及傳遞；（5）影響土壤-根系體系中的微生物；（6）污染物協(xié)同作用或轉(zhuǎn)運有害物質(zhì)（劉沙沙等，2022；謝潔芬等，2022）。從培養(yǎng)時間看，土培中5 μm-MPs在種植第30天對作物除株高外的其余指標(biāo)的影響大于第15天，結(jié)合上述機制假說，5 μm-MPs對土培作物各監(jiān)測生理指標(biāo)的影響應(yīng)是多種機制綜合作用產(chǎn)生的。本研究中微塑料可能隨著培養(yǎng)時間延長伴隨土壤生物運動機械損傷而降低植物根細胞活性，同時也可能因比表面積較大，吸附于植物根細胞表面，發(fā)生物理堵塞根部通道，影響植物根對水及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而抑制植物光合作用及 SOD活性，而對光合作用的影響表現(xiàn)為抑制作物葉綠素的含量及葉面氮含量。而由于作物種類不同，其結(jié)構(gòu)、代謝途徑也有差異，因此影響的主導(dǎo)機制和作用方式也存在一定差異，微塑料對不同作物及同種作物的不同指標(biāo)影響程度也不盡相同。

3 結(jié)論

5 μm-MPs質(zhì)量濃度在 0—100 mg·L?1范圍內(nèi)，經(jīng)7 d種子發(fā)芽試驗發(fā)現(xiàn)：（1）5 μm-MPs對小麥、玉米、向日葵、谷子的種子發(fā)芽能力和種子活力無顯著影響，對花生顯著抑制，質(zhì)量濃度越大抑制越顯著，100 mg·L?1處理與對照組相比發(fā)芽抑制率達到125.56%，抑制效果明顯。（2）與對照組相比，5 μm-MPs對5種作物種子的平均發(fā)芽時間均無顯著影響。

5 μm-MPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)在 0—100 mg·kg?1范圍內(nèi)，經(jīng)33 d土培試驗發(fā)現(xiàn)，（1）株高上，5 μm-MPs對玉米、小麥、花生3種作物大體表現(xiàn)為抑制，種植第15天未表現(xiàn)相同顯著影響趨勢，第30天時對3種作物均無顯著影響。（2）不同處理均可顯著誘導(dǎo)小麥、玉米葉片SOD活性下降，20 mg·kg?1處理下兩者葉片SOD相比對照組活性下降最大。（3）高質(zhì)量分?jǐn)?shù)5 μm-MPs對小麥葉綠素表現(xiàn)為顯著抑制，中低質(zhì)量分?jǐn)?shù)對玉米葉綠素表現(xiàn)為顯著抑制；但均使兩者葉綠素a/b比值降低。（4）相比對照組，含有5 μm-MPs的土壤氮含量在種植后顯著增加，但5 μm-MPs處理組中小麥、玉米的葉面氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在種植期間均偏低。