鼎湖山季風(fēng)常綠闊葉林演替系列土壤細菌群落的變化特征

楊世福 ，馬玲玲 ，陳蕓芝 ，唐旭利

1.中國科學(xué)院華南植物園，廣東 廣州 510650；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

隨著人類對原始森林的干擾破壞，全球次生林面積不斷上升，次生演替成為陸地生態(tài)系統(tǒng)的研究熱點之一（Zhou et al.，2017）。植物群落的演替在森林生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，了解演替的變化過程是森林生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的重要基礎(chǔ)（Qu et al.，2020）。森林演替是由地上和地下部分相互作用所驅(qū)動的（Chai et al.，2019），植物群落組成、多樣性以及凋落物輸入數(shù)量和質(zhì)量的變化均可能導(dǎo)致土壤微生物的生物量、活性和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（Banning et al.，2011；Cline et al.，2015；Smith et al.，2015）。土壤微生物多樣性與森林生態(tài)系統(tǒng)功能多樣性呈正相關(guān)關(guān)系，任何微生物多樣性的損失都可能會降低森林生態(tài)系統(tǒng)的功能多樣性（Delgado-Baquerizo et al.，2016）。Ren et al.（2019）研究發(fā)現(xiàn)，森林演替對微生物多樣性有積極的影響，這取決于演替階段和微生物群落的分布格局。不同演替階段森林環(huán)境存在異質(zhì)性，導(dǎo)致不同的微生物群落演替模式不同（Liu et al.，2020）。細菌是森林土壤中最豐富的類群，參與了碳、氮和磷等重要元素的生物化學(xué)地球循環(huán)過程（Roesch et al.，2007；Llado et al.，2017）。雖然之前的研究認(rèn)為植被演替會導(dǎo)致土壤微生物群落發(fā)生變化（Chabrerie et al.，2003；Jia et al.，2005），但是對土壤細菌群落隨演替進行的變化模式知之甚少。了解土壤細菌群落在不同演替階段的適應(yīng)策略，有助于理解土壤細菌群落在演替過程中的重要作用和預(yù)測土壤微生物對未來環(huán)境變化的響應(yīng)。

鼎湖山自然保護區(qū)內(nèi)分布著大面積的南亞熱帶地帶性森林——季風(fēng)常綠闊葉林及其自然演替階段的多種森林類型。已有研究表明，植物多樣性、豐富度（李林等，2006）和微生物生物量（易志剛等，2005）隨演替進行逐漸增加，凋落物質(zhì)量也隨之發(fā)生改變（Huang et al.，2011），處于演替頂級的季風(fēng)常綠闊葉林中更多的碳被分配到地下（Tang et al.，2011），植物來源碳的輸入必將從“量”和“質(zhì)”兩個方面對土壤微生物群落產(chǎn)生影響。此外，環(huán)境因素（如pH、土壤養(yǎng)分等）在演替過程中發(fā)生了改變，那么在演替過程中土壤細菌群落組成和多樣性對環(huán)境因子的變化有怎樣響應(yīng)？土壤細菌群落結(jié)構(gòu)能夠反映土壤生態(tài)功能，具有重要的指示作用（Llado et al.，2017）。通常，富營養(yǎng)微生物和r策略緊密相關(guān)，而寡營養(yǎng)微生物和k策略緊密相關(guān)，在常見的細菌類群中，酸桿菌門和放線菌門被認(rèn)為是k策略細菌，變形菌門和擬桿菌門被認(rèn)為是r策略細菌（Fierer et al.，2007）。有研究從門水平的角度分析了演替過程中細菌優(yōu)勢類群的變化，認(rèn)為優(yōu)勢類群相對豐度的變化可以表征植被演替導(dǎo)致細菌群落從r策略細菌占優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)閗策略細菌占優(yōu)勢（Yan et al.，2020）。然而，目前還不清楚在亞熱帶不同演替階段森林中，土壤細菌群落是否存在生態(tài)策略的轉(zhuǎn)變。

本研究以鼎湖山國家級自然保護區(qū)內(nèi)處于不同演替階段的3個代表性森林類型，即演替初期階段的馬尾松林、演替中期階段的針闊葉混交林和演替頂級階段的季風(fēng)常綠闊葉林為研究對象，利用高通量測序方法，分析了季風(fēng)常綠闊葉林不同演替階段森林土壤細菌群落的組成、結(jié)構(gòu)和多樣性。試圖回答以下2個問題：（1）季風(fēng)常綠闊葉林不同演替階段森林土壤細菌群落組成和多樣性的變化規(guī)律如何？土壤細菌群落是否存在生態(tài)策略的轉(zhuǎn)變？（2）土壤細菌群落變化的潛在驅(qū)動因素是什么？

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究地位于廣東省肇慶市鼎湖山國家級自然保護區(qū)內(nèi)（23°09′21″—23°11′30″N，112°30′39″—112°33′41″E），面積約為 1155 hm2，該地區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候，年均降水約為1900 mm，大部分降水發(fā)生在濕季（4—9月），年均溫為21.4 ℃，年均相對濕度為80%，土壤為砂頁巖發(fā)育的赤紅壤（Huang et al.，2013）。保護區(qū)內(nèi)有代表亞熱帶森林演替的3種典型森林類型，分別是演替初期階段的馬尾松林、演替中期階段的針闊葉混交林（簡稱混交林）以及演替頂級階段的季風(fēng)常綠闊葉林（簡稱闊葉林）。

本研究所選擇的永久樣地面積均為1 hm2，是嚴(yán)格遵照生態(tài)學(xué)原則設(shè)計建立的，具有相同或相似的海拔高度、土壤類型和坡向。馬尾松林樣地，海拔為50—200 m，坡度約25°。起源于1930—1950年間營造的馬尾松人工林。喬木層主要物種為馬尾松（Pinus massoniana）；灌木層主要物種為桃金娘（Rhodomyryus tomentosa）、野牡丹（Melastoma candidum）和三叉苦（Evodia lepta）等；草本層以芒萁（Dicranopteris lineais）為主。針闊葉混交林樣地，海拔為100—250 m，坡度約30°。起源于20世紀(jì)30年代營造的馬尾松人工林，由木荷（Schima superba）和錐（Castanopsis chinensis）等闊葉樹種逐漸入侵而形成。群落結(jié)構(gòu)較為簡單，喬木層主要物種為馬尾松、錐、木荷和豺皮樟（Litsea rotundifolia）等；灌木層以桃金娘為優(yōu)勢種；草本層主要物種為芒萁和黑莎草（Gahnia tristis）。季風(fēng)常綠闊葉林樣地位于保護區(qū)的核心區(qū)內(nèi)，海拔為250—300 m，坡度約30°—36°；該群落是南亞熱帶常綠闊葉林代表類型，目前已經(jīng)有 400多年的保護歷史，森林植物類型豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，喬木層主要物種為華潤楠（Machilus chinensis）、錐、木荷、黃果厚殼桂（Cryptocarya concina）、厚殼桂（Cryptocarya chinensis）、鼎湖釣樟（Lindera chunii）和云南銀柴（Aporusa yunnanensis）等（方運霆等，2003）。

1.2 樣品采集

于2020年7月采集土壤樣品，在馬尾松林、針闊葉混交林、季風(fēng)常綠闊葉林內(nèi)分別隨機選取 8個10 m×10 m樣方，樣方間隔大于20 m。在每個樣方內(nèi)按照五點取樣法進行采樣。采集土壤樣品前，先將凋落物移除，然后使用內(nèi)徑為5 cm的土鉆取5個 0—10 cm土層的土壤樣品并將其混合均勻，作為一個樣品。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

將采集到的土壤樣品放入 4 ℃便攜式保溫箱中保存。運回實驗室后，先取一部分用于立即測定土壤含水量（Soil water content，SWC）。剩下的所有土壤樣品過2 mm篩，然后分為3份，一部分用于提取DNA，在DNA提取之前一直保存于?20 ℃冰箱。另一部分保存于4 ℃冰箱中，在一周內(nèi)完成土壤硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen，NO3?-N）、銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）的測定。最后一部分樣品經(jīng)自然風(fēng)干后，用于測定土壤pH、土壤有機碳（Soil organic carbon，SOC）、全氮（Total nitrogen，TN）、全磷（Total phosphorus，TP）和有效磷（Available phosphorus，AP）。土壤pH采用電位法測定；土壤含水量采用鋁盒烘干法測定；土壤有機碳采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；全氮采用靛酚藍分光光度比色法測定；銨態(tài)氮和硝態(tài)氮采用氯化鉀浸提-比色法測定；有效磷采用鹽酸-氟化銨浸提-鉬銻抗比色法測定；全磷采用硫酸消煮-鉬銻抗比色法測定。土壤理化性質(zhì)測定方法的詳細描述見Lie et al.（2019）。

1.4 DNA抽提、PCR擴增及Illumina Miseq測序

使用 Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals，Santa Ana，CA）試劑盒，根據(jù)說明書對土壤微生物群落總DNA進行抽提，然后使用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA的提取質(zhì)量，DNA濃度和純度使用NanoDrop2000測定；使用細菌通用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA G-3′）和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對土壤細菌16S rRNA基因的V3和V4可變區(qū)進行PCR擴增。關(guān)于PCR擴增過程、擴增子高通量測序文庫建立和DNA序列處理過程的詳細介紹見Duan et al.（2021）。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.5 DNA序列處理

使用 QIIME2對原始測序數(shù)據(jù)進行處理（Bolyen et al.，2019）。用 fastp（v 0.20.0）進行質(zhì)控（Chen et al.，2018），用FLASH（v 1.2.7）進行拼接（Magoc et al.，2011）。根據(jù) 97%的相似度，使用UPARSE（v 7.1）軟件對序列進行操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）聚類并剔除嵌合體（Edgar，2013）。利用 RDP classifier（v 2.2）比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫（v 138）對每條序列進行物種分類注釋，置信度閾值設(shè)置為70%。為減少序列數(shù)差異對后期數(shù)據(jù)分析的影響，所有樣品按最小樣本序列數(shù)進行抽平，得到的標(biāo)準(zhǔn)化序列數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。

1.6 統(tǒng)計分析

使用 Shapiro-Wilk檢驗對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，使用Levene’s檢驗對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗。采用單因素方差分析法（One-way analysis of variation）和LSD（Least significant difference）多重比較法檢驗不同演替階段森林間土壤理化性質(zhì)、細菌群落的α多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)）和主要門相對豐度的差異性。基于Bray-Curtis距離算法，使用主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）分析不同演替階段森林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異，并使用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）來檢驗不同演替階段森林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異是否存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著性。使用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）探究影響土壤細菌群落變化的主要因素。用Pearson相關(guān)性分析探究土壤細菌群落組成與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系。顯著性水平設(shè)置為P<0.05。所有數(shù)據(jù)處理與繪圖均使用R 4.0.2完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同演替階段森林土壤理化性質(zhì)

不同演替階段森林土壤理化性質(zhì)如表1所示，混交林和闊葉林的土壤有機碳、全氮、全磷、有效磷含量以及土壤含水量均顯著高于馬尾松林（P<0.05），而混交林和闊葉林之間差異不顯著。土壤銨態(tài)氮含量隨演替的進行呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，且演替頂級階段的闊葉林顯著高于演替初期階段的馬尾松林（P<0.05）。土壤硝態(tài)氮含量隨演替的進行呈增加趨勢，但差異不顯著。土壤pH值隨演替的進行而逐漸下降，且演替頂級階段的闊葉林顯著低于演替初期階段的馬尾松林（P<0.05）。

表1 鼎湖山不同演替階段森林0—10 cm土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties in top soil (0–10 cm in depth) of three successional forests in the Dinghushan National Nature Reserve

2.2 不同演替階段森林土壤細菌多樣性

24個土壤樣品共獲得1359050條有效序列，聚類得到3358個OTU。物種分類注釋結(jié)果顯示，鼎湖山不同演替階段森林土壤細菌群落分屬 27個門、80綱、189目、297科和492屬。從圖1可以看出，不同演替階段森林土壤細菌群落共有的OTU數(shù)量為1787個，馬尾松林和闊葉林特有的OTU數(shù)量較多，而混交林特有的 OTU數(shù)量最少。馬尾松林和混交林共有的OTU數(shù)量為337個，混交林和闊葉林共有的OTU數(shù)量為381個，而馬尾松林和闊葉林共有的OTU數(shù)量只有155個，說明相鄰演替階段土壤細菌群落可能有更高相似度。

圖1 不同演替階段森林土壤細菌OTU水平韋恩圖Figure 1 Venn diagrams of soil bacteria at OTU level of three successional forests in Dinghushan National Nature Reserve

土壤細菌群落的α多樣性分析結(jié)果顯示（圖2），隨著演替的進行土壤細菌群落的多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）呈先增加后降低的趨勢（圖2a），豐富度指數(shù)（Chao 1指數(shù)）呈逐漸增加的趨勢（圖2b），然而，不同演替階段森林土壤細菌群落間多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均無顯著差異。

圖2 鼎湖山不同演替階段森林土壤細菌α多樣性指數(shù)Figure 2 Soil bacterial alpha diversity index of three successional forests in the Dinghushan National Nature Reserve

2.3 不同演替階段森林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和組成

由圖 3可以看出，在門水平上，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）是鼎湖山森林演替過程中土壤細菌群落的優(yōu)勢門，它們在不同演替階段森林土壤細菌群落中的占比均超過10%。變形菌門的相對豐度從演替初期階段的馬尾松林到演替頂級階段的闊葉林呈先減少后增加的趨勢。放線菌門的相對豐度從演替初期階段的馬尾松林到演替頂級階段的闊葉林呈先減少后增加的趨勢。酸桿菌門的相對豐度隨著演替的進行逐漸增加，在演替中期階段的混交林和演替頂級階段的闊葉林中顯著高于演替初期階段的馬尾松林（P<0.05）。其他非優(yōu)勢門的相對豐度隨著演替的進行也發(fā)生變化，例如：WPS-2的相對豐度逐漸增加；綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度逐漸減少；浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度顯著增加，且在演替頂級階段的闊葉林顯著高于演替初期階段的馬尾松林（P<0.05）。

圖3 鼎湖山不同演替階段森林土壤細菌的主要門（豐度大于1%）Figure 3 Bacterial community composition at phylum level (with relative abundance >1%)of three successional forests in the Dinghushan National Nature Reserve

PCoA分析結(jié)果表明，3個不同演替階段森林土壤細菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著的差異（PERMANOVA，P<0.05），且在第一軸上明顯分開（圖4）。

圖4 鼎湖山不同演替階段森林土壤細菌群落PCoA分析Figure 4 Principal coordinates analysis (PCoA) of bacterial composition based of three successional forests in the Dinghushan National Nature Reserve

2.4 土壤細菌群落與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系

RDA分析表明，第一軸和第二軸共解釋了33.3%的土壤細菌群落變異（圖 5）。土壤有機碳（R2=0.67，P<0.001）、全氮（R2=0.59，P<0.001）、含水量（R2=0.44，P<0.01）、pH（R2=0.38，P<0.05）以及硝態(tài)氮（R2=0.32，P<0.05）是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素。相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖6），土壤細菌群落的Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)與pH呈顯著正相關(guān)關(guān)系；變形菌門和放線菌門的相對豐度與pH呈顯著負相關(guān)關(guān)系；酸桿菌門的相對豐度與硝態(tài)氮和全氮呈顯著正相關(guān)關(guān)系；綠彎菌門的相對豐度與pH呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，而與土壤有機碳和全氮呈極顯著負相關(guān)關(guān)系。

圖5 土壤理化性質(zhì)與土壤細菌群落的RDA分析Figure 5 Redundancy analysis (RDA) of soil physicochemical properties and soil bacterial community

圖6 土壤細菌主要門、多樣性與土壤理化性質(zhì)的Pearson相關(guān)性分析Figure 6 Pearson correlation analysis of soil bacterial community, diversity and soil physicochemical properties

3 討論

變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是鼎湖山不同演替階段森林土壤細菌群落優(yōu)勢門，這一結(jié)果與前人在其他森林中的研究結(jié)果類似（Fierer et al.，2007；Liu et al.，2020）。本研究中，隨著演替的進行，酸桿菌門的相對豐度顯著增加（圖 3），可能是對演替過程中土壤自然酸化程度增加的適應(yīng)。有研究表明，酸桿菌門細菌適宜于酸性土壤中繁殖生長，并且其相對豐度隨土壤pH值降低而增加（Xiang et al.，2014）。鼎湖山森林土壤為典型的赤紅壤，土壤pH值較低，0—10 cm土壤pH值隨演替的進行逐漸降低（表1），說明混交林和闊葉林中較酸的土壤環(huán)境為酸桿菌門細菌提供了相對適宜的條件，使其相對豐度增加。酸桿菌門細菌主要利用和分解難降解有機質(zhì)，是 k策略細菌的典型代表之一（Morrissey et al.，2017）。Huang et al.（2011）的研究表明，鼎湖山處于演替頂級階段的季風(fēng)闊葉林中凋落物的C/N顯著高于演替初期階段的馬尾松林，說明闊葉林中凋落物相對難分解。酸桿菌門的相對豐度的增加可能提高了闊葉林中土壤細菌群落分解和利用難降解碳的能力。放線菌門也是常見的 k策略細菌，在土壤有機質(zhì)的分解中起著重要作用（Deng et al.，2018；Guo et al.，2018），研究指出放線菌門在有氧環(huán)境中生活（Liu et al.，2020）。隨著演替的進行，放線菌門的相對豐度呈降低的趨勢（圖3），與Zeng et al.（2017）的研究結(jié)果一致，這可能是隨著演替的進行，凋落物的積累使得表層土壤氧的含量降低（Liu et al.，2020），從而影響了放線菌門的豐度。變形菌門屬于典型的r策略細菌（Fierer et al.，2007），土壤中易分解有機質(zhì)（如根系分泌物）的增加能夠促進r策略細菌的快速增長，從而加快土壤有機質(zhì)的分解（Morrissey et al.，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著演替的進行，變形菌門的相對豐度未發(fā)生顯著變化（圖 3），與前人的研究結(jié)果不同（Zhang et al.，2016；Jiang et al.，2021）。北方森林土壤中變形菌門的相對豐度隨森林演替的進行而逐漸降低（Jiang et al.，2021），農(nóng)田土壤中變形菌門的相對豐度隨農(nóng)田次生演替而逐漸增加（Zhang et al.，2016）。本研究中不同次生演替階段森林土壤中變形菌門的豐度沒有呈現(xiàn)明顯的增加或減少趨勢，可能與土壤養(yǎng)分狀況均較好有關(guān)（鄧嬌嬌等，2019）。此外，有研究表明，綠彎菌門能夠水解纖維素、木聚糖和幾丁質(zhì)等多糖，在降解植物殘體的過程中具有重要作用（Yabe et al.，2010）。隨著演替的進行，綠彎菌門的相對豐度逐漸降低，說明綠彎菌門對植物殘體分解的貢獻可能降低。這一趨勢在一定程度上可以增加植物殘體碳向土壤轉(zhuǎn)移，從而促進土壤有機碳的積累（Cao et al.，2020）。

土壤微生物多樣性與森林生態(tài)系統(tǒng)功能多樣性呈正相關(guān)關(guān)系，土壤微生物多樣性的降低可能會降低森林生態(tài)系統(tǒng)的功能多樣性（Delgado-Baquerizo et al.，2016）。本研究發(fā)現(xiàn)，鼎湖山不同演替階段森林間土壤細菌群落 Shannon指數(shù)和Chao 1指數(shù)均無顯著差異（圖2a和b），說明鼎湖山3個不同演替階段森林均能維持較高的森林生態(tài)系統(tǒng)的功能多樣性，與前人的研究結(jié)果一致（Zeng et al.，2007；Jiang et al.，2021）。雖然不同演替階段森林的土壤細菌群落α多樣性無顯著差異，但土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著（圖4）。這可能是隨著演替的進行，土壤有機碳、全氮和全磷等養(yǎng)分的含量逐漸增加（表1），為土壤細菌群落生長繁殖提供了充足的碳源和氮源（Cleveland et al.，2007）。土壤養(yǎng)分（Zhang et al.，2015；Xu et al.，2021）和酸堿性（Rousk et al.，2010）是影響土壤細菌群落的主要因素。鼎湖山季風(fēng)常綠闊葉林及其演替系列森林中，土壤有機碳、全氮、含水量、硝態(tài)氮和pH是影響土壤細菌群落變化的主要因素（圖5）。比較3個演替階段的森林可以看出，隨著土壤pH降低（表1），酸桿菌門的相對豐度逐漸增加，綠彎菌門的相對豐度逐漸減少；隨著土壤有機碳、全氮、硝態(tài)氮和含水量的增加（表1），酸桿菌門和浮霉菌門的相對豐度逐漸增加。

4 結(jié)論

隨著演替的進行，土壤細菌群落的α多樣性沒有發(fā)生顯著變化，但結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。土壤細菌群落的多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)）隨演替的進行呈先增加后降低的趨勢，而細菌群落的豐富度指數(shù)（Chao 1指數(shù)）則呈逐漸增加的趨勢。在門水平上，土壤細菌群落的優(yōu)勢類群沒有發(fā)生顯著變化，但組成發(fā)生顯著變化。與演替初期階段的馬尾松林相比，在演替頂級階段的闊葉林中，酸桿菌門的相對豐度顯著增加，而放線菌門、變形菌門的相對豐度未發(fā)生顯著變化，說明土壤細菌群落由r策略細菌占優(yōu)勢地位轉(zhuǎn)變?yōu)閗策略細菌占優(yōu)勢地位。土壤有機碳、全氮、含水量、pH以及硝態(tài)氮共同驅(qū)動了鼎湖山不同演替階段森林土壤細菌群落的變化。