三陰性乳腺癌中溶酶體相關(guān)膜蛋白-2表達(dá)水平的臨床意義及預(yù)后價(jià)值

阿孜古麗·阿布都熱合曼,李宇翔,趙寰宇,朱麗萍

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高居我國(guó)女性惡性腫瘤中的第1 和第4位[1]。其中，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growthfactor receptor 2,HER2)均為陰性的乳腺癌,約占所有類(lèi)型乳腺癌中的15%～20%[2]。TNBC 最常見(jiàn)的組織學(xué)類(lèi)型為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，TNBC 細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移不受雌激素及其受體調(diào)節(jié)，具有高度異質(zhì)性和侵襲性，預(yù)后較其他類(lèi)型乳腺癌差。TNBC患者中位生存期約為13 個(gè)月[3]，即使接受乳腺癌根治性切除術(shù)及化療、放療綜合治療后的患者，也常于術(shù)后3 年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移[4]。因此，早診斷早治療對(duì)患者的預(yù)后具有極其重要的意義。

溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosome-associated membrane protein,LAMP)家族是類(lèi)高度糖基化的跨膜蛋白，包括LAMP1、LAMP2、LAMP3、CD68/Macrosialin/LAMP4、BAD-LAMP/LAMP5 五個(gè)成員。其位于溶酶體膜上，溶酶體是真核細(xì)胞中的酸性細(xì)胞器，最初被認(rèn)為是唯一能將細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的大分子降解為可用的成分的細(xì)胞器[5-6]。直到通過(guò)不斷的研究才被認(rèn)為是細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，越來(lái)越多的證據(jù)表明它們與神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等多種疾病有關(guān)[7]，也有研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤存在著LAMP 異常表達(dá)，認(rèn)為其LAMP 水平與腫瘤的嚴(yán)重程度呈現(xiàn)正相關(guān)[8-9]。本研究分析溶酶體相關(guān)膜蛋白-2（LAMP2）表達(dá)水平與臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，為三陰性乳腺癌的發(fā)生機(jī)制、預(yù)后評(píng)估及精準(zhǔn)治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2015 年1 月-2017 年1 月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行乳腺癌根治術(shù)的104例TNBC 患者臨床及病理資料，對(duì)照組采用同一患者距腫瘤邊緣＞5 cm 的癌旁組織。104 例TNBC 患者均為女性，年齡35-72 歲，中位年齡54歲，Ⅰ期18 例，Ⅱ期55 例，Ⅲ期31 例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合TNBC 診斷標(biāo)準(zhǔn)的女性患者；②所有組織標(biāo)本均在離體2 min 內(nèi)在液氮及-80 ℃冷藏；③術(shù)后病理結(jié)果為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌；④術(shù)前未接受化療、放療、內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非原發(fā)性腫瘤；②伴有其他部位的惡性腫瘤；③臨床資料缺失或失訪。本研究得到了新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 方法 收取104 對(duì)癌組織和癌旁組織，嚴(yán)格按照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，在冰上配制溶液和研磨組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液進(jìn)行裂解，12 000 g/min 離心20 min，留取上清制備蛋白溶液。按照BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)平配制、稀釋和檢測(cè)完成蛋白濃度的測(cè)定，按照5×緩沖液:提取蛋白=1:4 加入緩沖液，在100 ℃下煮10 min 變性。按照BCA 測(cè)定結(jié)果加入SDS-PAGE 凝膠，恒流電泳,電泳完成后轉(zhuǎn)移到NC 膜上，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h,一抗孵育過(guò)夜，TBST 清洗3 次,每次10 min，一抗孵育結(jié)束后，與特定濃度的二抗進(jìn)行孵育結(jié)合。二抗帶HRP 或AP 標(biāo)記。二抗回收用PBST 洗滌5min×5 次化學(xué)發(fā)光顯影，曝光/成像。純水洗滌5-7次，膜上滴加顯影液放置2-3min，曝光成像獲取圖片。Image J 分析蛋白的相對(duì)濃度后GraphPad Prism 8繪圖。

1.3 隨訪 采用定期門(mén)診復(fù)查、電話(huà)隨訪、入院復(fù)查記錄的方式進(jìn)行隨訪，隨訪起始時(shí)間為患者術(shù)后出院時(shí)間，終止時(shí)間為死亡日期，截至2022年1月，中位隨訪時(shí)間為66 個(gè)月，所有患者均獲得有效隨訪資料。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism8.0 輔助作圖。連續(xù)性變量用中位數(shù)及四分位間距表示，組間差異采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。分類(lèi)變量以各類(lèi)別的例數(shù)和百分比表示，組間差異采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存分析，兩組間生存率的比較采用Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 LAMP2 蛋白的表達(dá)在TNBC 患者癌組織、癌旁組織中的表達(dá)水平 使用Western-Blot 檢測(cè)采集的104對(duì)凍存組織樣本中LAMP2的表達(dá)水平，癌組織中LAMP2 的相對(duì)表達(dá)水平(1.581±0.412)高于癌旁組織(0.705±0.305)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.935，P＜0.05，圖1、圖2)。

圖1 LAMP2在4對(duì)腫瘤-癌旁組織中的表達(dá)（T,TNBC組織；N,癌旁組織；GAPDH 為內(nèi)參；4例代表性樣本）

圖2 104例TNBC組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中LAMP2 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 LAMP2 表達(dá)水平與TNBC 患者臨床病理特征的關(guān)系 將104例TNBC患者按LAMP2相對(duì)表達(dá)水平分組，以LAMP2 在癌組織中相對(duì)表達(dá)水平均數(shù)1.581為界限值，高于均數(shù)的患者納入高表達(dá)組，低于均數(shù)為低表達(dá)組。TNBC組織中LAMP2高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.669，P=0.031)、組織學(xué)分級(jí)(χ2=8.847，P=0.003)、TNM分期(χ2=11.158，P=0.004)相關(guān)，LAMP2與患者年齡、月經(jīng)狀態(tài)無(wú)相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1 TNBC組織中LAMP2蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 LAMP2 表達(dá)與TNBC 患者預(yù)后的關(guān)系 104例TNBC 患者中死亡32 例，5 年生存率為69.5%。其中，LAMP2 高表達(dá)組52 例，死亡21 例，5 年生存率為61.0%；低表達(dá)組52 例，死亡6 例，5 年生存率為89.9%，兩組間生存率存在顯著差異(P＜0.05，圖3)。Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型單因素分析顯示：腫瘤分期(P＝0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＝0.005)、LAMP2 表達(dá)水平(P＝0.005)與TNBC 患者OS顯著相關(guān)。多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分期(HR:2.408；95%CI：1.323～4.382；P=0.004)、LAMP2表達(dá)(HR: 2.851；95%CI:1.311～6.200；P=0.008)是TNBC 患者OS 的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(表2)。

表2 三陰性乳腺癌患者總生存單因素分析

圖3 LAMP2高表達(dá)組和低表達(dá)組TNBC患者的生存分析曲線

表3 三陰性乳腺癌患者總生存多因素Cox回歸分析

3 討論

LAMP2是LAMP家族中的一員，屬于真核酸性細(xì)胞器溶酶體合成的蛋白，它最初被定義為參與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外大分子降解的小分子蛋白，近期文獻(xiàn)報(bào)道，認(rèn)為它是維持細(xì)胞穩(wěn)定的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并且有越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)它參與很多疾病的產(chǎn)生與發(fā)展，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病以及癌癥[8,9]。

多項(xiàng)研究表明，大多數(shù)LAMP2 蛋白存在于細(xì)胞核周的溶酶體和晚期核內(nèi)體中，而一小部分LAMP2 蛋白在質(zhì)膜、核內(nèi)體和溶酶體之間動(dòng)態(tài)穿梭[10-11]。然而，一些學(xué)者認(rèn)為在癌細(xì)胞中，特別是具有侵襲性表型的癌細(xì)胞中，溶酶體的分布轉(zhuǎn)變?yōu)閺暮酥芟蛲庵苣Ｊ睫D(zhuǎn)移，從而釋放溶酶體內(nèi)容物，促進(jìn)其遷移，侵襲或轉(zhuǎn)移[12-15]。在乳腺癌的表型中，TNBC 具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率、年輕化、預(yù)后差等獨(dú)特的生物學(xué)特征，本研究通過(guò)對(duì)TNBC 患者癌組織、癌旁組織進(jìn)行LAMP2 差異表達(dá)分析，并通過(guò)WB 實(shí)驗(yàn)將LAMP2 相對(duì)表達(dá)量1.581 設(shè)為界限值，將患者分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，通過(guò)患者臨床病理特征及預(yù)后分析，探討了其在TNBC 的表達(dá)對(duì)患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期和生存預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了LAMP2 在TNBC 中高表達(dá)可能代表著其更強(qiáng)的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力和更差的預(yù)后狀態(tài)。

中國(guó)的Li 和時(shí)帥等[16,17]進(jìn)行了多種惡性腫瘤LAMP2 蛋白表達(dá)的研究，與正常組織相比，LAMP2蛋白在低分化的胃腺癌、肝細(xì)胞癌、唾液腺樣囊性癌以及肺腺癌患者支氣管肺泡灌洗液中也有較高的表達(dá)，預(yù)示著LAMP2 可能成為一個(gè)新的惡性腫瘤分子標(biāo)記物。也有研究提示LAMP2 蛋白參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程[18]，該研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌和腺瘤中LAMP2 蛋白表達(dá)高于正常黏膜（P＜0.05），單因素生存分析結(jié)果為：血管浸潤(rùn)、淋巴管浸潤(rùn)、TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、、肝轉(zhuǎn)移、分化程度與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良呈現(xiàn)正相關(guān)。多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示浸潤(rùn)深度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移會(huì)縮短患者生存時(shí)間，是重要的危險(xiǎn)因素。本研究課題組前期研究在乳腺癌差異基因拷貝數(shù)[19-20]以及富集基因分析中篩選出與TNBC 生物學(xué)行為高度相關(guān)的分子蛋白，其中LAMP2 在富集基因關(guān)系網(wǎng)中處于相對(duì)集中位置，推測(cè)LAMP2可能與TNBC 的發(fā)生發(fā)展有聯(lián)系。本研究結(jié)果示：在TNBC癌組織中LAMP2蛋白高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)及腫瘤學(xué)分期相關(guān)，也進(jìn)一步佐證了LAMP2 蛋白可能參與了TNBC 的疾病發(fā)生和進(jìn)展。本研究樣本量較少，無(wú)法完全代表TNBC 中LAMP2 的表達(dá)水平，后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后繼續(xù)研究，證明LAMP2是否能成為T(mén)NBC的一個(gè)新的分子標(biāo)記物。

Ming等[21]研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中存在LAMP2高表達(dá)，其表達(dá)水平與食管癌患者生存預(yù)后相關(guān)，LAMP2 表達(dá)陽(yáng)性的食管癌患者總生存率和疾病無(wú)進(jìn)展生存率均顯著降低低表達(dá)者，提示LAMP2 與預(yù)后呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。本研究中對(duì)TNBC 患者進(jìn)行了單因素、COX 多因素預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，LAMP2 高表達(dá)是TNBC 患者OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(獨(dú)立預(yù)后因素)。在5 年的隨訪過(guò)程中104 例TNBC 患者中共死亡32例。其中，LAMP2 高表達(dá)組5 年生存率為61.0%；低表達(dá)組5 年生存率為89.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究通過(guò)對(duì)患者預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)LAMP2 表達(dá)越高可能代表著TNBC 患者預(yù)后水平更差。隨著分子特征、信號(hào)通路和機(jī)制在研究和臨床試驗(yàn)中的廣泛研究，我們期待未來(lái)能找到更多有效的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)用于TNBC患者的輔助治療。

綜上所述，LAMP2 在TNBC 癌組織中高表達(dá)，可能預(yù)示更高的腫瘤惡性度和不良預(yù)后。LAMP2有望成為T(mén)NBC 預(yù)后評(píng)估的新生物標(biāo)志物和精準(zhǔn)治療的新靶點(diǎn)。