β-谷甾醇靶向調(diào)控PI3K3CG基因保護(hù)心肌肥厚作用研究

李鵬宇，陳夢真，冉嘉欣，劉思宇，孫輝

心力衰竭（heart failure,HF）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的心臟疾病，且發(fā)病率正逐年上升[1]。心肌肥厚是心力衰竭的重要病理生理過程之一[2]。心臟及心肌細(xì)胞增大導(dǎo)致心室壁張力降低，為保持心臟效率和輸出量致使心肌工作量增加或心臟損傷，引起器官結(jié)構(gòu)的破壞并導(dǎo)致心力衰竭[3]。因此，新的心肌肥厚的治療藥物和潛在治療靶點(diǎn)將為心血管疾病的預(yù)防和治療提供新方法。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)（Pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system,TCMS）是將生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)及靶向藥理學(xué)的方法整合成一種新的研究思路，其研究思路具有全局性和系統(tǒng)性的特點(diǎn)[4]。通心絡(luò)是由7 種不同君藥及5 種不同的臣藥制成的一種復(fù)方中藥[5]，廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，可以穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、降低血脂水平、改善內(nèi)皮功能、促進(jìn)血管擴(kuò)張、抑制炎癥和凋亡，并促進(jìn)血管生成[6]。然而，通心絡(luò)對于心肌肥厚的作用尚不清楚，尤其是通心絡(luò)中何種關(guān)鍵因子起到保護(hù)作用尚不明確。

β-谷甾醇（β-sitosterol）是青蒿屬植物的有效成分，已被用于預(yù)防三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎[7]。β-谷甾醇具有良好的抗氧化劑或營養(yǎng)添加劑[8]。一項(xiàng)研究報(bào)道了β-谷甾醇通過抗氧化及降低血糖逆轉(zhuǎn)由鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病發(fā)生[9]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法分析通心絡(luò)各成分靶點(diǎn)及藥物機(jī)理，探討β-谷甾醇在心肌肥厚中的作用。

1 材料與方法

1.1 通心絡(luò)的化學(xué)組成 本研究采用計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索通心絡(luò)中人參、赤芍、檀香、降香、乳香、酸棗仁以及冰片7 味藥的成分。

1.2 篩選閾值

1.2.1 候選化合物篩選 將中藥人參、赤芍、檀香、降香、乳香、酸棗仁、冰片的化合物口服生物利用度(OB)篩選閾值設(shè)為OB≥30%，7味中藥的類藥性(DL)閾值設(shè)為DL≥0.2及腸上皮通透性(Caco-2)閾值設(shè)為Caco-2＞-0.4，最終篩選出95個(gè)候選化合物。

1.2.2 構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫獲得通心絡(luò)小分子化合物對應(yīng)的靶點(diǎn)名稱，應(yīng)用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將靶點(diǎn)基因全稱轉(zhuǎn)化為gene ID 號，從而通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建出通心絡(luò)的高活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行通心絡(luò)藥理學(xué)作用機(jī)制深入探究。并通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建出人參這味中藥的高活性化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.3 基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將獲得的數(shù)據(jù)中的β-sitosterol 活性分子采用GO 功能和KEGG通路對靶基因進(jìn)行富集分析，以此闡明中藥化合物的靶點(diǎn)蛋白在基因功能和信號通路中的作用。

1.3 材料 異丙腎上腺素（Isoproterenol，ISO，鶴峰藥廠，上海，中國）。β-谷甾醇（阿拉丁，上海，中國）。ANP、BNP、PI3K3CG 和β-MHC 相應(yīng)引物（生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上海，中國）。

1.4 心肌細(xì)胞培養(yǎng)與處置 H9C2 心肌細(xì)胞（中國細(xì)胞庫，上海，中國），在含有10%胎牛血清（賽默飛世爾，美國）的DMEM（?？寺?，美國），其中含有100單位/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素。置于37 ℃，含有5%CO2的濕空氣恒溫孵箱中培養(yǎng)備用。待細(xì)胞對數(shù)期生長至60%～70%后，將10 μM ISO 加入心肌細(xì)胞中，誘導(dǎo)其成為心肌肥厚模型。同時(shí)，將不同濃度的β-谷甾醇加入到ISO 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中，（正常組，ISO 組，ISO+β-谷甾醇（0.01～1.0 mM）以及單獨(dú)β-谷甾醇組）24h。

1.5 心肌肥厚模型的建立 使用健康的Sprague-Dawley 的雄性大鼠（180～200 g）。動(dòng)物的住房條件（溫度21+2℃，濕度55%～75%），12 h 暗/光循環(huán)，無食物和水的限制。所有實(shí)驗(yàn)程序均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)證明（倫理號：IRB3015722）。經(jīng)過5 d 的靜態(tài)處理，經(jīng)頭頸部皮下注射ISO（每天2.5 mg/kg）或者β-谷甾醇（每天0.5 mg/kg）用于14 d。對照組注射等量的生理鹽水。

1.6 心肌細(xì)胞表面積的測定 不同組細(xì)胞采用4%多聚甲醛固定15 min，然后將H9C2 細(xì)胞通過0.4%TritonX-100 固定90 min，山羊血清室溫封閉90 min。接下來，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)染色，然后采用熒光顯微鏡（Nikon80i，日本）進(jìn)行拍照。通過Image J 數(shù)據(jù)軟件對于心肌細(xì)胞面積進(jìn)行測定。

1.7 熒光定量PCR 用TRIZOL 提取心肌細(xì)胞以及心肌組織中的總RNA。通過ABI7500 快速實(shí)時(shí)定量PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，美國）檢測心肌細(xì)胞以及心肌組織中的心鈉素（Atrial Natriuretic Peptide,ANP），B 型利鈉肽（B-type natriuretic peptide,BNP）以及β-肌球蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的表達(dá)，ANP，BNP 以及β-MHC 的序列如下：

1.8 H&E 染色 將大鼠的心臟采用0.9%的生理鹽水沖洗干凈后，固定在10%福爾馬林，待固定完成后，將心臟組織切片至7 μm，蘇木精染色及曙紅（H&E）。心肌細(xì)胞的橫斷面，在400 倍放大率下檢測心肌細(xì)胞肥大面積。細(xì)胞橫切面面積測定通過magePro-Plus4.0系統(tǒng)。

1.9 超聲心動(dòng)評價(jià)心功能 心臟功能評估是使用Vevo2100 圖像采集系統(tǒng)（Visualsonics，多倫多，加拿大）配備30 mHz 微掃描傳感器。在胸骨旁長軸和短軸上均記錄了M 型追蹤。測量QT間期和R間期，以及心率校正用Bazett 公式：QTc/QT/（RR）1/2，接受方法修正qt間期。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選活性化合物 藥物的口服生物利用度（OB）是藥理學(xué)中最重要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一，它反映所給藥物進(jìn)入人體循環(huán)的藥量比例，高OB值一般是決定生物活性分子類藥性（DL）的關(guān)鍵指標(biāo)。Caco-2細(xì)胞模型是一種人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞，結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系?？梢杂脕硌芯克幬镂盏臐摿?，藥物運(yùn)轉(zhuǎn)的機(jī)制，以及研究藥物、營養(yǎng)物質(zhì)、植物性成分的腸道代謝，目前也是一種常用的評價(jià)藥物滲透性的指標(biāo)。本研究從TCMSP網(wǎng)站下載了這些化合物的OB、DL和Caco-2指標(biāo)來共同篩選其中潛在的高活性化合物。為了使篩選的化合物具有代表性，同時(shí)要從整體上反映通心絡(luò)的藥理學(xué)特性，7 味中藥的OB、DL 和Caco-2 閾值設(shè)為OB≥30%，DL≥0.2，Caco-2＞-0.4。將通心絡(luò)的7味中藥中的化合物通過篩選，得到95個(gè)活性成分作為候選化合物。其中有21 個(gè)化合物來自人參，20個(gè)來自赤芍，2個(gè)來自檀香，37個(gè)來自降香，8個(gè)來自乳香，8個(gè)來自酸棗仁，3個(gè)來自冰片（表1）。而，β-谷甾醇作為主要成分在人參，赤芍以及降香中均有出現(xiàn)，且出現(xiàn)頻率最高。

表1 通心絡(luò)人參活性成分

2.2 化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò) 采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)共包含248個(gè)節(jié)點(diǎn)（68個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，180個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)）和1034條邊，連接化合物與靶點(diǎn)對應(yīng)的基因表示他們之間有作用關(guān)系（圖1）。由于在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中并沒有找到冰片中的活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，因?yàn)閳D1 中包含了通心絡(luò)7種成分的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

圖1 通心絡(luò)有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)不同形狀圖形代表了不同成分來源

隨后，對于通心絡(luò)的君藥“人參”的活性成分，利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，共包含125個(gè)節(jié)點(diǎn)（16個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，109個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)）。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這些活性成分中，β-谷甾醇可能是潛在的抗心肌肥厚活性成分。故，在后續(xù)的研究中，主要以β-谷甾醇為主要研究對象。

2.3 GO 富集與通路富集分析 將通心絡(luò)中名為β-谷甾醇的活性成分所對應(yīng)的靶基因映射到DAVID數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行GO 生物學(xué)功能分析和KEGG 富集分析，以FDR 校正值作閾值進(jìn)行篩選，共獲得43 個(gè)GO 條目和28 條KEGG 通路。在富集GO 條目中，與分子功能有關(guān)的條目6 個(gè)，涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)、跨膜受體的活動(dòng)、跨膜信號受體活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、底物特異性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性；與生物過程有關(guān)的條目27 個(gè)，涉及循環(huán)系統(tǒng)過程、細(xì)胞對化學(xué)刺激的反應(yīng)、對有機(jī)物的反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、藥物反應(yīng)、對含氧化合物的反應(yīng)等方面；與細(xì)胞組成有關(guān)的條目10 個(gè)，包含原生質(zhì)膜的組成、質(zhì)膜的固有成分、等離子體膜、細(xì)胞邊緣、神經(jīng)元、突觸后膜等方面。富集的KEGG 通路包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、鈣離子信號通路、膽堿能突觸信號通路、含血清素的信號通路以及cAMP信號通路等。

2.4 β-谷甾醇減弱ISO 誘導(dǎo) H9C2 細(xì)胞表面積增加 采用ISO（10 μM，48 h）誘導(dǎo)H9C2 細(xì)胞構(gòu)建體外的心肌肥厚模型，通過肌動(dòng)蛋白α 染色法檢測心肌細(xì)胞肥大。如圖2A 所示，ISO（10 μM，48 h）明顯誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積增加。β-谷甾醇0.01、0.05、0.1 和1.0 mM 作用24 h 能夠明顯抑制ISO 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積的增加。

圖2 β-谷甾醇對H9C2細(xì)胞表面積的影響

通過qRT-PCR 檢測心肌肥厚相關(guān)蛋白ANP（圖3A），BNP（圖3B）以及β-MHC（圖3C）的mRNA表達(dá)，結(jié)果表明，β-谷甾醇能夠逆轉(zhuǎn)由ISO 誘導(dǎo)的ANP，BNP以及β-MHC的表達(dá)上調(diào)。

圖3 β-谷甾醇對ISO誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中肥大標(biāo)志物的影響與對照組比較，*P＜0.05，正常組與ISO組比較，#P＜0.05，β-谷甾醇與ISO組相比。

2.5 β-谷甾醇抑制ISO 誘導(dǎo)的心肌肥大后大鼠心臟重構(gòu) 通過在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證β-谷甾醇對于心肌組織的影響。結(jié)果如圖4A 所示，與對照組比較，ISO組心臟/體重比明顯升高，而β-谷甾醇能夠降低由ISO 誘導(dǎo)的心臟/體重比升高及降低由ISO 誘導(dǎo)的左心房/體重比（圖4B）。H&E 染色結(jié)果表明β-谷甾醇能夠降低由ISO 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面顯增大（圖4C）。超聲心動(dòng)圖評價(jià)大鼠心功能不同的治療方法，如表1 所示，心動(dòng)超聲結(jié)果顯示了LVAWd 和LVPWd與對照組比較，ISO 組大鼠心臟舒張功能明顯降低（P＜0.05）。通過qRT-PCR 檢測心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志物ANP（圖5A），BNP（圖5B）及β-MHC（圖5C）的mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示ISO 組能夠明顯增加心肌組織中ANP，BNP 以及β-MHC 的表達(dá)，而β-谷甾醇能夠逆轉(zhuǎn)由ISO誘導(dǎo)的ANP,BNP及β-MHC的表達(dá)上調(diào)。2.6 β-谷甾醇通過調(diào)控PI3K3CG 逆轉(zhuǎn)ISO 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大 通過Western blot 以及qRT-PCR 方法檢測心肌組織以及H9C2 細(xì)胞中PI3K3CG 的表達(dá)，結(jié)果顯示ISO 能夠使H9C2 以及心肌組織中PI3K3CG 表達(dá)升高，而β-谷甾醇能夠降低由ISO 誘導(dǎo)的PI3K3CG表達(dá)上調(diào)（圖6 A-B）。

圖4 β-谷甾醇對心肌肥厚模型大鼠的HW/BW（A）和LVW/BW（B）的作用，每組3-6只大鼠。（C）H&E 染色（400倍放大鏡）以及不同組的橫截面積數(shù)據(jù)，n=4-5只大鼠。與對照組比較，*P＜0.05，正常組與ISO 組比較，#P＜0.05，β-谷甾醇與ISO 組相比，ISO（2.5 mg.kg-1.d-1，持續(xù)10 d）；β-谷甾醇（1.5 mg.kg-1.d-1，持續(xù)10 d）。

圖5 β-谷甾醇對ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚模型中肥大標(biāo)志物的影響

表2 大鼠心功能參數(shù)

圖6 β-谷甾醇逆轉(zhuǎn)由ISO誘導(dǎo)的心肌組織以及H9C2細(xì)胞中PI3K3CG表達(dá)

3 討論與結(jié)論

通心絡(luò)，是一種具有益氣活血，通絡(luò)止痛功效的中成藥，臨床中用于氣虛血瘀絡(luò)阻型中風(fēng)病以及心腦血管疾病的治療。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，首先構(gòu)建了通心絡(luò)主要成分的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖1）。在篩選的過程中，我們發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可能是通心絡(luò)中主要作用藥物。有文獻(xiàn)證明，β-谷甾醇可調(diào)控N-二乙基亞硝胺的表達(dá)亞硝酸鐵誘導(dǎo)的大鼠急性腎毒性有促進(jìn)作用[11-12]。β-谷甾醇還可通過誘導(dǎo)線粒體谷胱甘肽氧化還原循環(huán)過程，逆轉(zhuǎn)由四氯化碳誘導(dǎo)肝毒性[13-14]。為了進(jìn)一步探究β-谷甾醇作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過基因功能以及信號通路富集后，結(jié)果表明這些靶點(diǎn)的分子功能主要體現(xiàn)在跨膜受體活性，調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)等。而對KEGG 通路富集分析的結(jié)果說明，除了一些癌癥相關(guān)通路之外，這些靶點(diǎn)也富集到了鈣信號通路。而鈣離子通路在多種心臟相關(guān)的疾病中起著重要的作用，如細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號通路是阿托伐他汀減輕心肌肥厚的重要通路之一[15]。鈣離子信號通路參與FGF23 對于血管緊張素II 介導(dǎo)的心肌肥厚[16]?；谝陨系慕Y(jié)果證明我們前期對于下游通路的篩選是可靠的。同時(shí)，進(jìn)一步對β-谷甾醇的下游的作用靶點(diǎn)進(jìn)行深入挖掘，發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵靶點(diǎn)，如PI3K3CG。以往的報(bào)道表明，PI3K3CG作為一個(gè)抑制因子參與了心臟GSK-3的表達(dá)[17]。PI3K3CG促進(jìn)心肌梗死后的梗死面積增加并預(yù)防心肌梗死后的不良重塑[18]。結(jié)合以上結(jié)果，PI3K3CG 可能是β-谷甾醇保護(hù)心肌肥厚的重要作用靶點(diǎn)。隨后，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明β-谷甾醇能夠抑制ISO 誘導(dǎo)的心肌肥厚的發(fā)生，使ANP，BNP 以及β-MHC 的表達(dá)降低，且通過調(diào)控PI3K3CG基因?qū)崿F(xiàn)的。

綜上，我們的結(jié)果基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析通心絡(luò)的主要抗心肌肥厚活性成分，隨后分子生物方法證實(shí)β-谷甾醇是主要的有效成分，且能夠干預(yù)心肌肥厚的病理、生理過程，阻斷其惡性進(jìn)展，能夠給通心絡(luò)以及β-谷甾醇提供更好的應(yīng)用價(jià)值以及理論基礎(chǔ)。