高遷移率族蛋白B1單抗對(duì)大鼠腦出血術(shù)后腦水腫的作用研究

曾以勒，蔡圣煜，蔡風(fēng)景

腦出血是由多種原因?qū)е履X血管破裂而引起的腦實(shí)質(zhì)出血，屬于臨床常見病、多發(fā)病[1]。而腦水腫作為腦出血后必出現(xiàn)的病理生理過程，為非獨(dú)立疾病，其臨床表現(xiàn)多變，是導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高、腦疝、腦循環(huán)障礙、神經(jīng)元壞死等腦出血后二次腦損傷的最重要原因[2-3]。有研究指出，腦出血術(shù)中清除血腫、減少血腫的占位效應(yīng)對(duì)改善顱內(nèi)壓具有重要意義，但術(shù)后血腫周圍組織存在明顯水腫，而血腫周圍組織水腫及其繼發(fā)性神經(jīng)元損傷可嚴(yán)重威脅患者預(yù)后，因此對(duì)腦出血術(shù)后腦水腫的多視角、全方位的研究成為近年臨床研究的熱點(diǎn)[4-5]。近年隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)在腦出血術(shù)后腦水腫中仍發(fā)揮著主導(dǎo)作用，而高遷移率族蛋白B1(HMGB1)或參與了腦卒中早期炎癥病理過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞外HMGB1在激活小膠質(zhì)細(xì)胞、促進(jìn)神經(jīng)炎癥中具有重要作用[6-7]。基于此，本研究采用HMGB1單抗處理的大鼠腦出血手術(shù)模型，用以明確HMGB1對(duì)腦出血術(shù)后炎癥水腫的抑制作用，以期為HMGB1抑制劑治療腦水腫提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康雄性成年SD大鼠40只，體質(zhì)量210～262(236±22)g，由福建醫(yī)科大學(xué)提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(閩)2020-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為(23±2)℃下，相對(duì)濕度為42%～50%，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與保護(hù)的有關(guān)規(guī)定，本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑及儀器 CT(西門子雙源CT)，酶標(biāo)儀(型號(hào)iMark，Bio-RAD公司生產(chǎn))，HMGB1 ELISA試劑盒(日本SHINO. TEST公司生產(chǎn))，白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis公司生產(chǎn))。

1.3 動(dòng)物模型建立與治療

1.3.1 腦出血術(shù)后腦血腫模型建立 將40只健康雄性成年SD大鼠進(jìn)行處理，采用改良Miller法建立腦出血術(shù)后腦血腫大鼠模型，具體步驟為：在有機(jī)玻璃容器內(nèi)使用3%異氟烷進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，麻醉成功后改用2%異氟烷0.6 L/min維持麻醉，而后以聚乙烯導(dǎo)管對(duì)大鼠右側(cè)股動(dòng)脈和靜脈進(jìn)行插管，以進(jìn)行血壓監(jiān)測(cè)，采血；使用加熱毯維持大鼠體溫為(37.0±0.2)℃，同時(shí)使用生理監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)其呼吸頻率，維持動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)為35～41 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；使用動(dòng)物立體定向儀架上固定大鼠頭部，剃毛后沿正中線切開頭皮，在冠狀縫前2 mm、右側(cè)中線旁開5 mm處右側(cè)鉆一直徑為1 mm的骨孔，在顯微鏡下借助高速牙科鉆切開硬膜，將針頭刺入腦皮質(zhì)下約5 mm，自股靜脈內(nèi)抽取不含肝素的靜脈血50 μl，用微量注射泵緩慢注入腦內(nèi)，速度50 μl/min，注射完畢后，用骨蠟封閉骨孔，持續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠血壓并觀察其呼吸情況。2 h后去除骨蠟，借助高速牙科鉆將原骨孔擴(kuò)大至5 mm，切開硬膜，沿原皮質(zhì)穿刺點(diǎn)撐開，徹底清除腦血腫，反復(fù)沖水確認(rèn)血腫腔無出血，縫合硬膜，骨孔用骨蠟封閉，縫合頭皮。術(shù)后24 h，行顱腦CT檢查，若術(shù)區(qū)無明顯高密度即為建模成功。

1.3.2 分組及處理 將40只大鼠分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各20只，分別于術(shù)后48、96、144 h對(duì)2組大鼠進(jìn)行腹腔注藥，其中實(shí)驗(yàn)組給予HMGB1單抗200 μg/只，對(duì)照組僅給予等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腦水腫體積測(cè)定 分別于術(shù)后72、120、168 h將2組大鼠麻醉制動(dòng)后進(jìn)行顱腦CT薄層三維掃描，厚度為2 mm，采用PACS系統(tǒng)三維測(cè)量方法并使用多田公式計(jì)算大鼠腦水腫體積，腦水腫體積=病灶體積-血腫體積。

1.4.2 HMGB1、IL-6、TNF-α水平測(cè)定 分別于術(shù)后72、120、168 h抽取大鼠靜脈血3 ml，3 h內(nèi)高速離心15 min，分離上清；采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平，設(shè)置酶標(biāo)板空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，依次加入50 μl/孔的樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣片液，混勻，覆膜，室溫孵育；而后棄孔內(nèi)液體，甩干，清洗反應(yīng)板。加入ANCA檢測(cè)液100 μl/孔，覆膜，常溫孵育60 min，棄液體，甩干，洗滌反應(yīng)板，加入100 μl/孔的底物溶液，遮光顯色0.5 h，加入終止液，輕彈酶標(biāo)板終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定吸光值，由高資歷的檢驗(yàn)科醫(yī)生嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.3 水通道蛋白4(AQP-4)和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)水平測(cè)定 采用斷頭法處死大鼠，平行正中線剖開大鼠腦血腫處的組織，留取血腫腔周邊腦組織做連續(xù)冠狀冰凍切片，置于4%多聚甲醛中浸泡固定，24 h后脫水處理，石蠟包埋，切成4 μm的切片，使用枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液微波修復(fù)10 min，燜30 min后室溫晾涼；使用疏水筆描繪樣品分布輪廓，將玻片置于濕盒內(nèi)，滴加適量0.3% Triton，恒溫孵育20 min，PBST重復(fù)洗滌，再滴加3% H2O2溶液于玻片上，室溫避光孵育30 min，PBST重復(fù)洗滌，再滴加3% BSA均勻覆蓋組織，37 ℃環(huán)境下封閉30 min，輕甩封閉液(勿洗)，于玻片上滴加一抗(Aqp4∶PBS為1∶200)，平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育2 d(保濕盒內(nèi)加少量水，防止抗體蒸發(fā))，PBST重復(fù)洗滌，滴加二抗[Fluorescein(FITC)-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)∶PBS為1∶200]，37 ℃環(huán)境下避光孵育60 min,PBST重復(fù)洗滌，晾干，抗熒光衰減封片劑封片。(1)AQP-4表達(dá)水平測(cè)定：取大鼠待測(cè)血腫周邊組織切片，采用免疫組化染色二步法測(cè)定AQP-4表達(dá)水平，具體步驟：常規(guī)脫蠟水化，3% H2O2室溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉非特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，滴加兔抗大鼠AQP-4抗體(濃度為1∶100)，室溫濕盒孵育1.5 h，陰性對(duì)照組滴加PBS，其余步驟同前。生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液，室溫孵育30 min；DAB顯色5 min，顯色后光鏡觀察。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(北京麥克奧迪圖像技術(shù)有限公司生產(chǎn))對(duì)染色深淺程度進(jìn)行定量分析，以細(xì)胞平均吸光度(A)值表示AQP-4陽性表達(dá)的強(qiáng)弱。(2)MMP-9表達(dá)水平測(cè)定：取大鼠待測(cè)血腫周邊組織切片，利用免疫組化SABC法測(cè)定MMP-9表達(dá)水平，具體步驟：將石蠟切片脫水、PBS漂洗、3% H2O2與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原、修復(fù)、PBS漂洗后，加入一抗，常溫孵育2 h，PBS漂洗5 min，加入二抗，常溫孵育40 min，PBS漂洗5 min，DAB室溫顯色20～30 min，清洗、封片，光鏡下觀察細(xì)胞中MMP-9表達(dá)情況。采用DAKO公司的試劑盒進(jìn)行操作。采用Kontron IBAS 2.5全自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)觀察MMP-9陽性反應(yīng)產(chǎn)物灰度級(jí)和面積、測(cè)試區(qū)域的灰度級(jí)和背景面積。

2 結(jié) 果

2.1 腦水腫體積比較 術(shù)后72 h對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠腦水腫體積比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后120、168 h，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦水腫體積小于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)腦水腫體積比較

2.2 血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平比較 術(shù)后72 h對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后120、168 h，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平均低于對(duì)照組(P<0.01)，見表2。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組術(shù)后不同時(shí)間血清HMGB1、IL-6、TNF-α水平比較

2.3 腦組織AQP-4、MMP-9表達(dá)水平比較 術(shù)后72、120、168 h，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織AQP-4、MMP-9表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.01)，見表3。

表3 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后不同時(shí)間腦組織AQP-4、MMP-9表達(dá)水平比較

3 討 論

腦水腫是不同致病因素共同作用促使腦組織中水分異常增多的病理狀態(tài)，血—腦脊液屏障受損、缺血缺氧、血腫分解釋放出多種有毒活性物質(zhì)、炎性因子等均參與了腦水腫的形成[8-9]。手術(shù)作為血腫清除的有效手段，可有效解決因血腫機(jī)械性壓迫及后期血腫液化吸收所產(chǎn)生的損傷，由此認(rèn)定血—腦脊液屏障受損及炎性反應(yīng)在腦出血術(shù)后腦水腫演變過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用[10]。

研究指出，腦出血發(fā)病早期，血腫周圍存在活化小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤及大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，通過釋放多種炎性因子引發(fā)炎性反應(yīng)[11]。炎性因子在炎性反應(yīng)中具有重要作用，而核因子κB通路參與多個(gè)炎性因子的表達(dá)，腦出血后聚集的炎性因子，如腫瘤壞死因子及白介素可誘導(dǎo)核因子κB活化，通過調(diào)控、活化核因子κB轉(zhuǎn)錄，而增加炎性因子產(chǎn)生及釋放增多，致使炎癥加重，從而介導(dǎo)腦損傷[12-13]。研究指出，另外各類炎性因子間存在線性依存關(guān)系，相互反應(yīng)、促進(jìn)，對(duì)誘導(dǎo)炎癥發(fā)生、加重腦損傷具有促進(jìn)作用[14]。相關(guān)研究證實(shí)，IL-6、TNF-α在腦水腫患者中存在異常表達(dá)，通過藥物干預(yù)可有效降低其水平，減輕腦水腫損傷[15]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)腦出血術(shù)后腦水腫大鼠給予HMGB1單抗處理的實(shí)驗(yàn)組血清TNF-α、IL-6水平低于僅給予0.9%氯化鈉溶液處理的對(duì)照組，術(shù)后120、168 h實(shí)驗(yàn)組大鼠腦水腫體積小于對(duì)照組，證實(shí)HMGB1單抗可通過降低炎性因子水平而減輕腦出血大鼠術(shù)后腦水腫損傷。

本研究通過分析AQP-4、MMP-9在腦出血術(shù)后腦水腫演變過程中存在異常表達(dá)，推測(cè)AQP-4、MMP-9在腦出血術(shù)后腦水腫演變過程中的作用機(jī)制。研究指出，AQP-4是大腦水代謝及中樞神經(jīng)系統(tǒng)水平衡的重要調(diào)節(jié)因子，其作為一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外水轉(zhuǎn)運(yùn)的膜蛋白，在星形膠質(zhì)細(xì)胞表面呈高表達(dá)，與腦水腫形成及消除存在密切關(guān)聯(lián)；而MMP-9在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用，當(dāng)腦出血發(fā)生后血—腦脊液屏障功能受損，誘發(fā)腦水腫[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，AQP-4降低后，大鼠腦水腫得以改善，而MMP-9的激活及高表達(dá)則會(huì)對(duì)血管結(jié)構(gòu)的完整性造成破壞，加重血管源性水腫，甚至引發(fā)再出血[17]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠腦組織AQP-4、MMP-9表達(dá)水平低于對(duì)照組，提示HMGB1單抗對(duì)調(diào)節(jié)AQP-4、MMP-9表達(dá)，穩(wěn)定血—腦脊液屏障結(jié)構(gòu)，減輕繼發(fā)性腦損傷具有重要意義，是腦出血后防治血管源性水腫發(fā)生發(fā)展的一個(gè)新的潛在治療靶點(diǎn)。

綜上所述，HMGB1單抗可有效控制腦出血術(shù)后大鼠腦水腫，抑制機(jī)體炎性反應(yīng)，調(diào)控AQP-4、MMP-9表達(dá)，進(jìn)而減輕腦損傷，進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1在腦出血后腦水腫發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，通過降低其表達(dá)水平、抑制其功能或有效抑制腦水腫進(jìn)展，可有效減輕炎癥水腫所致的二次腦損傷，改善預(yù)后。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。