雙季板栗果實壞死病病原菌的生物學(xué)特性及鑒定

孫萬霞潘曉芳韋繼光楊來安

(1．廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2．廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

板栗Castanea mollissima屬于殼斗科Fagaceae栗屬Castanea多年生落葉喬木，被稱為世界四大干果之一[1]，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。目前我國板栗的栽培面積排在世界首位，品種約有300多個，且栽培歷史悠久。目前，廣西隆安縣板栗總面積達1．07萬hm2，年產(chǎn)板栗2 250 t，面積和產(chǎn)量均位于廣西首位，具有“板栗之鄉(xiāng)”的美稱，主要在喬建、古潭、城廂、那桐和南圩等全縣10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植，分別有“九家種”“處署紅”“隆安26號”“油栗”和“大毛栗”等5個主栽品種[2]，近幾年新引進“日本8號”早熟品種等。隨著雙季板栗種植面積擴大，雙季板栗果實病害發(fā)生也日益嚴重，甚至導(dǎo)致雙季板栗采前果實腐爛脫落，嚴重影響雙季板栗產(chǎn)量，因此，對雙季板栗果實病害進行深入調(diào)查及防治方法研究迫在眉睫[3]。侯保林 等研究板栗種仁斑點類病害發(fā)現(xiàn)，主要病原菌是盤長孢狀刺盤孢Colletotrichum gloeosporioidesPenz、鏈格孢Alteruaria alternata、腐皮鐮孢菌Fusarium solani、串珠鐮孢菌Fusarium moniliforme、三線鐮孢菌Fusarium tricinctum和擴展青霉Penicillium expansum[4]；殷莉研究發(fā)現(xiàn)，板栗貯藏期間病害的病原有很多種，均屬于半知菌類，叢梗孢目[5]。

目前雙季板栗已報道的研究多為種植或栽培等方面，病害方面也只是對其葉、枝方面發(fā)生病害的研究，對其果實病害方面研究報道較少，缺乏針對其病害調(diào)查及防治等方面的研究。為明確廣西隆安縣雙季板栗果實病害的發(fā)生情況，在隆安縣定軍村種植區(qū)開展雙季板栗病害種類調(diào)查，對其病原菌進行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，及致病性驗證，并對雙季板栗果實病害進行藥劑防治室內(nèi)篩選及毒力測定，以期為雙季板栗果實病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 雙季板栗林地概況

廣西隆安縣，屬南亞熱帶季風氣候，年平均氣溫21．7℃，最熱月和最冷月平均氣溫分別為28．2℃和12．9℃；年平均降水量1 310．1 mm，年均蒸發(fā)量1 652．5 mm，空氣相對濕度80%，其中4—10月降水量占全年的87．5%。該縣日照充足，四季差異較小，按平均溫度統(tǒng)計，該地區(qū)屬于春秋相連，夏長無冬或基本無冬，四季皆適宜耕作。調(diào)查地在隆安縣定軍村雙季板栗種植區(qū)。

1．2 試驗儀器

恒溫光照培養(yǎng)箱DHP－9162，太倉市科教器材廠；干燥自動排氣立式高壓蒸汽滅菌鍋LDZF－75KB，上海申安器械廠；生物光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CX21，日本東京奧林巴斯公司；DNA電泳槽DYCP－31DN、穩(wěn)壓電泳儀DYY－5，北京六一儀器廠；電熱恒溫水槽DK－8D，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀FR980，上海復(fù)日科技儀器有限公司；PCR 儀2720 thermal cycler、測序儀3730XL，Applied Biosystems；冷凍高速離心機HC－2518R，BBI生物科學(xué)；Surf系列精密單道可調(diào)移液器SP10－1000，生工生物(上海)有限公司。

1．3 病害田間調(diào)查方法

2016年5月—2018年9月，采用線路踏查法對雙季板栗種植區(qū)進行果實病害種類調(diào)查。在同一林分行間逐一觀察植株，記錄病害發(fā)生的種類、癥狀、嚴重程度，分析癥狀類型、發(fā)生規(guī)律，觀察記錄病果數(shù)量，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。病果采集應(yīng)在晴天中午進行，采集帶有典型癥狀的病果樣本，分別按類型裝袋、掛好標簽，將樣本帶回實驗室，待分離純化和鑒定。雙季板栗病情分級標準參照方中達所著的?植病研究方法(第三版)?[6]，病害分級如表1所示，果實、葉部及枝條類病害都按此分級標準分類。

表1 病害嚴重度分級標準Tab.1 Grading standards of different disease severity

1．4 病原菌分離純化及鑒定

1．4．1 分離純化

對病果各危害部位組織分離[7]。將漂洗過的病果置于提前放有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，吸去表面水分后，用高壓滅菌手術(shù)刀切取果實病部塊狀組織長寬各約5 mm，接種于滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)皿內(nèi)放置組織塊4～5個，每個果實病部重復(fù)做5～6個培養(yǎng)皿，編號后放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察記錄。

待菌絲長出后，用滅菌接種針從菌落邊緣挑取新鮮菌絲接種到PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，如此反復(fù)培養(yǎng)，直至得到單一菌株。對所得菌株編號，將純化后菌株接種至PDA培養(yǎng)基試管中，置于4℃冰箱備用。

1．4．2 致病性測定

接種前，挑取菌落邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化。5 d后將已活化的病原菌，在平展邊緣處取長寬各為5 mm大小一致的菌絲塊，分別進行活體接種和離體接種。設(shè)置針刺傷法和無傷接種法2種處理，每處理接種果苞數(shù)量30個，并以同等大小空白PDA培養(yǎng)基處理作為空白對照。每處理設(shè)3次重復(fù)。對于雙季板栗果實的離體接種，根據(jù)其組織面積大小接種不同數(shù)量菌絲塊，使用吸滿無菌水的濾紙放入一定大小的無菌培養(yǎng)皿中，并定期噴灑無菌水保濕；野外活體接種，使用無菌保鮮袋進行保濕，保濕時間為3～5 d，并用芭蕉葉覆蓋防止曬傷。此后每天觀察并記錄發(fā)病情況，待出現(xiàn)病狀后，對發(fā)病部位再分離，若仍能得到相同菌株，即確定為病原菌。

1．4．3 病原菌鑒定

1．4．3．1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化好的病原菌菌種在適宜溫度條件下進行活化培養(yǎng)并逐日觀察記錄病原菌的培養(yǎng)性狀，如菌落大小、顏色、形狀和致病程度等。采用插片法在光學(xué)顯微鏡下觀測病原菌的菌絲、產(chǎn)孢梗和孢子的大小及形態(tài)特征[8]。光學(xué)顯微鏡下，觀察病原菌孢子形態(tài)特征[9]。

1．4．3．2 病原菌分子生物學(xué)鑒定 提取活化后的病原菌菌絲，通過ITS－PCR方法對雙季板栗果實壞死病病菌進行鑒定。PCR反應(yīng)總體積25 μL，內(nèi)含 10 × Buffer 2．5 μL， Template 0．5 μL， dNTP 1 μL，Taq 酶 0．2 μL，引物 (10 μmol/L)各0．5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性 45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物的純化和序列測定委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。對測定結(jié)果，在美國國立生物信息中心NCBI網(wǎng)頁上進行Blast比對分析，利用MAGA7．0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹進行分析并與真菌的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特征相互驗證。

1．5 病原菌生物學(xué)特性研究

取出4℃斜面保存的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，置于28℃培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)6 d后備用。

1．5．1 不同溫度對病原菌菌絲生長的影響

將活化后的菌株于菌落邊緣處取新鮮菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中，按菌株類型編號，并放置于10，16，22，25，28，34，40 ℃等 7 個不同溫度環(huán)境培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每個溫度處理重復(fù)3次。培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑。

1．5．2 pH對病原菌菌絲生長影響

PDA培養(yǎng)基降至50℃以下時，在無菌操作臺加入配制好的1 mol/L HCL與1 mol/L NaOH溶液，混合均勻，將培養(yǎng)基 pH 值調(diào)至 2，3，4，5，6，7，8，9，10。在菌落邊緣平展處取長寬各5 mm菌絲塊，接種至不同pH值培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)，設(shè)置3次重復(fù)。培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑。

1．5．3 不同光照對病原菌菌絲生長影響

在邊緣平展處取長寬各5 mm菌絲塊，接種至PDA培養(yǎng)基中央。接種后分別放置于全黑暗(6 d)、全光照(6 d)、光暗交替培養(yǎng)(先光照3 d，再黑暗3 d)的28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑。

2 結(jié)果與分析

2．1 雙季板栗果實病害癥狀

通過對果頂變黑、果頂開裂并感染和其他部位變黑3種果實病害類型(圖1)的病果部位進行分離培養(yǎng)、純化及致病性試驗，根據(jù)菌落顏色、形狀、疏密程度、生長速度和生長狀況等，獲得3種菌株，分別編號 ZH －1，Hei－2，F(xiàn)en－3。

圖1 果實病害癥狀Fig.1 Symptom of fruit necrosis

2．2 病原菌致病性試驗

接種病原菌3～4 d后，刺傷果實接種的雙季板栗果實表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，果苞表面產(chǎn)生一層白色菌絲，不斷向外擴張。接種7 d后，刺傷接種果實周圍產(chǎn)生大量菌絲，近傷口處呈灰黑色，果實外部果苞果刺變黃、開裂，直至果實脫落。各個處理平均發(fā)病率為29．97%，其中 ZH －1，Hei－2，F(xiàn)en－3 菌株發(fā)病率分別為 34．08%，29．17%，37．87%，為優(yōu)勢菌株，多以2種或3種同時侵染雙季板栗。

2．3 果實病原菌形態(tài)學(xué)特征

菌株ZH－1菌落生長速度慢，培養(yǎng)10 d可長滿培養(yǎng)皿，氣生菌絲體為白色至淡紫色。菌落突起絮狀，稀疏或濃密，高3～5 mm，背面呈白色、米黃色或紅紫色。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，小型分生孢子為長橢圓形或紡錘形，無色透明，少數(shù)為1隔，多數(shù)為2個隔膜，大小約為7．2 μm ×3．6 μm；大型分生孢子為鐮刀形或紡錘形，有足孢，1～4個隔膜，多為3個隔膜，大小約為38．20 μm ×4．66 μm(圖2)。

圖2 菌株ZH-1菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.2 Colony and spore morphology of ZH-1 strain

菌株Hei－2菌落生長速度很快，培養(yǎng)2 d后即長出菌絲，4 d后長滿整個培養(yǎng)皿，日生長量約4 cm。菌落整齊而平坦，氣生菌絲體絨狀或棉絮狀。菌落初期為灰白色，生長中期中間出現(xiàn)灰黑色，后期漸變?yōu)榛液稚梁谏?，背面呈黑色。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，未成熟的小型分生孢子為單孢，呈卵圓形或橢圓形，無色透明，大小約為18．29 μm ×8．82 μm(圖3)。

圖3 菌株Hei-2菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.3 Colony and spore morphology of Hei-2 strain

菌株Fen－3菌落生長速度較慢，培養(yǎng)7 d后可長滿培養(yǎng)皿。菌落生長初期為淡粉色，后期為白色棉絮狀，稀疏或濃密，背面為粉紫色。液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，小型分生孢子呈卵圓形，有時無隔或1隔膜，大小約 2．4 μm ×1．2 μm；大型分生孢子為卵圓形或橢圓形，無色透明，約1～3個隔膜，多為2隔，大小約 19．95 μm × 5．71 μm(圖4)。

圖4 菌株Fen-3菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.4 Colony and spore morphology of Fen-3 strain

2．4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

菌株ZH－1與供試菌株MF629741．1Fusarium oxysporumstrain在同一分支上，同源性達到100%；菌株Fen－3與供試菌株KJ767073．1Fusarium pro-liferatumisolate在同一分支上，同源性達到100%，并且2種菌株的遺傳距離最近，同源性達到100%，因此可以確定菌株ZH－1和菌株Fen－3是隸屬于Fusarium屬。其中，菌株ZH－1為尖孢鐮刀菌Fu-sarium oxysporum，菌株Fen－3為層出鐮刀菌Fusarium proliferatum(圖5)。

圖5 三種病原菌的ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of ITS sequences of three pathogens

菌株 Hei－2 與 MG386642．1Lasiodiplodia theobromae、MH062942．1Lasiodiplodia pseudotheobromaestrain、MF952733．2Lasiodiplodia brasiliensisisolate和 MH454031．1Lasiodiplodia theobromaestrain 在同一個分支上，其同源性達到100%，因此可以確定菌株Hei－2是隸屬于Botryodiplodia屬，為可可球毛色二孢Lasiodiplodia theobromae(圖5)。

2．5 病原菌生物學(xué)特性

2．5．1 不同溫度對菌絲生長的影響

3種菌種菌絲生長在不同溫度下具有明顯差異性。在10～34℃均可以生長，在16～34℃生長良好。培養(yǎng)6 d后，菌絲最適生長的溫度為25～28℃(表2)。

在34℃下，菌絲生長緩慢；低于10℃或高于34℃，菌絲生長明顯受到抑制。不同溫度下，同一菌株差異較大(表2)，菌絲顏色未完全變黑成型，表現(xiàn)為中間變黑，周圍新長菌絲為白色，但25℃條件下菌落全部變黑。當達到40℃時，3種菌株菌絲均不能萌發(fā)生長(表2)。

表2 不同溫度處理對菌絲生長的影響Tab.2 Effects of different temperature treatments on mycelium growth

2．5．2 不同光照對菌絲生長影響

供試菌株在全黑暗(6 d)、全光照(6 d)和光暗交替(光照3 d，黑暗3 d)等3種光照條件下，3種菌株菌絲均能生長(表3)。其中，最利于3種菌株菌絲生長的光照條件為全黑暗(6 d)，菌落直徑最大。光暗交替(光照3 d、黑暗3 d)處理最不利于3種菌株菌絲生長。

表3 不同光照處理對菌絲生長的差異性分析Tab.3 Difference analysis of mycelium growth under different light treatment

2．5．3 不同pH值對菌絲生長的影響

3種菌株的菌絲生長速度在不同pH條件下有差異。菌絲生長的酸堿范圍pH 2～10。其中，菌株Fen－3耐酸性最大，在pH值為2條件下仍能生長，菌絲長度為0．13 cm。3種菌株均為耐堿菌株，在pH值為10條件下仍能生長。其中，Hei－2耐堿性最大，在pH值為10條件下，菌絲長度為8．93 cm。3種菌株菌絲生長的最適pH值均為7，菌落直徑分別為 4．57，9．00，7．03 cm，隨著 pH 值的增大或減小，菌落直徑減小。(表4)

3 結(jié)論與討論

通過致病性試驗、病害癥狀識別、形態(tài)學(xué)鑒定以及基于rDNA－ITS片段DNA序列的分子生物學(xué)鑒定，認為危害廣西隆安縣雙季板栗采前果實壞死病害的病原菌共有尖孢鐮刀菌，可可球毛色二孢，層出鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌為最新發(fā)現(xiàn)。25～28℃，全黑暗條件，pH值為7是3種菌株最適生長條件。陶怡采集未成熟期和成熟期果實上分離得到層出鐮刀菌Fusarium proliferatum、可可球毛色二孢Lasiodiplodia theobromae，認為研究對象可能是貯藏前果實已經(jīng)感染[10]，梅汝鴻 等對采后板栗果實病害研究中發(fā)現(xiàn)病原菌有10多種，其中干枯病是一種影響采后板栗果實的重要真菌性病害，其病原菌為鐮刀菌Fusariumsp．[11]；但以上研究均未得出具體菌種，但是可以肯定的是危害板栗果實的鐮刀菌屬從南到北均有危害。

趙學(xué)平等通過對板栗貯藏期病害鑒定，得出危害板栗果實貯藏期間的病原不是一種，也是2～3種病原菌共同危害[12]，Turchetti[13]和梅汝鴻 等[11]在研究板栗貯藏期間的病害時也得出相同的結(jié)論。以上研究與本研究結(jié)果一致，可以認為雙季板栗果實病害不論在采前或者采后，貯藏期間均為多種病原共同危害的結(jié)果。趙相超[14]的研究結(jié)果顯示，菌絲生長的pH值范圍為5～12、溫度為15～35℃，與本研究所設(shè)范圍有所差異，雖然研究地點和品種不同，但其適宜范圍相同，也證明了層出鐮刀菌、可可球毛色二孢在生物學(xué)特性方面不因地域上的差異而有較大差別。