大麻二酚制備的研究進展

周靜瑩 張 偉

1.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500；2.昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，云南 昆明 650503

大麻(CannabisSativa.L.)屬一年生草本植物，其莖、花、葉和種子等均具有實用價值，用途十分廣泛，大麻及其制品曾廣泛應(yīng)用于人們的生產(chǎn)生活當(dāng)中[1]。工業(yè)大麻是指毒品活性成分四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)干重含量<0.3%的大麻，THC干重含量>0.3%的則稱為藥用和毒品大麻 (marijuana & hashish)。相關(guān)法律規(guī)定，THC含量低于0.3%的大麻品種可以種植。目前，我國大麻的生產(chǎn)加工重點已經(jīng)逐步轉(zhuǎn)向從大麻植物中提取大麻素(CBD)，對產(chǎn)品進行深加工，并將其綜合開發(fā)利用[2]。

大麻二酚是從大麻屬植物中分離得到的一種單體，它與四氫大麻酚是同分異構(gòu)體。THC具有致幻成癮性，故CBD在一定程度上能抑制這種致幻成癮性，其結(jié)構(gòu)如下：

研究[3]證實，CBD可治療自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝綜合征、神經(jīng)精神疾病在內(nèi)的一系列疾病。英國GW公司已研發(fā)出以CBD為主要成分的Sativex和Epidiolex藥物，用于治療癲癇和多發(fā)性硬化癥(MS)[4]。同時，CBD具有鎮(zhèn)靜、改善睡眠質(zhì)量、抗氧化、抗炎、抗痤瘡等作用，其應(yīng)用領(lǐng)域日益廣泛，下游產(chǎn)品也不斷增加。

1 提取工藝

1.1 酶法提取 酶具有水解作用，能將植物的細(xì)胞壁進行破碎，從而使物料中的活性成分、色素等更易被溶劑萃取出來。因此，酶輔助溶劑法可以明顯提高工業(yè)大麻的提取率[5]。

吳俊鋒等[5]人研究了酶輔助溶劑萃取法工藝，分析其前處理方式、酶的種類含量以及酶解時間、液料比、萃取時間等影響因素并改良實驗條件，最終確定實驗的最佳條件為：將大麻葉在100 ℃的烘箱中加熱2 h；用復(fù)合植物水解酶(Viscozyme L)和酸性蛋白酶的復(fù)合物進行酶解，用量為物料的0.5%，酶解1 h后加入萃取劑正己烷，1000 r/min快速攪拌3 h，將上層的正己烷進行分離，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸干后去除溶劑，得油狀物。按1∶5加入甲醇，零下40 ℃放置1 h，零下6 ℃離心后取出上層清液，加入油狀物 10% 的活性炭脫色30 min，過濾，濾液旋蒸后即得富含CBD的浸膏。此條件下浸膏得率達到5.40%，CBD的含量為56.11 mg/g。

趙平嶺[6]將工業(yè)大麻葉干燥粉碎，按1∶10(g/mL)的比例加入纖維素酶和果膠酶混合液，加入的酶量為相對于工業(yè)大麻葉質(zhì)量濃度的0.5%，搖床內(nèi)水解后加入正己烷作為萃取劑，攪拌，萃??；取上層清液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸干，得到油狀物；在油狀物中油狀物/甲醇1∶5比例加入甲醇，于零下40 ℃條件下下靜置1 h，靜置完畢后離心取上清液，在上清液中加入相對油狀物10%質(zhì)量的活性炭脫色30 min，脫色后過濾，將所得濾液二次旋蒸，旋蒸后產(chǎn)物加入氯仿溶解，有機膜過濾后即可獲得CBD溶液。

曹亮等[7]通過對纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、半纖維素酶混合含量和比例的實驗及分析，得到較高的CBD的提取率。其工藝為：將工業(yè)大麻花葉部分于55～60 ℃ 條件下烘干，粉碎，過120～200目篩，得工業(yè)大麻粉。將工業(yè)大麻粉末的含水量調(diào)至18%～20%，在溫度為65～75 ℃，螺桿轉(zhuǎn)速80～120 r/min，膜孔孔徑10～30 mm條件下進行擠壓膨化，得膨化產(chǎn)物。加水溶解調(diào)節(jié)溫度至35～45℃，pH2.5～4.5，加入纖維素酶、木質(zhì)素降解酶、半纖維素酶混合酶解，其比例為5∶2∶(1-3)，總添加量為0.1%～0.25%。向酶解液中加入石油醚、乙醚、正己烷中一種或多種混合物，浸提，用三相分離機分離得到水相、殘渣及有機相。用超濾膜(0.001～0.01μm) 濃縮有機相，得到富含CBD的浸膏，CBD的提取率可達92.31%～96.96%。

張翼等[8]將火麻葉在100 ℃條件下烘干2 h，冷卻，按1 mL/g加入纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶中的一種或幾種，搖床內(nèi)水解1 h。向水解液中加入正己烷作為萃取劑，1000 r/min 攪拌均勻，分離，得上清液，蒸干得油狀物。加入其體積量為油狀物5倍的甲醇，-40 ℃靜置1 h，-6 ℃進行離心。取上清液加入活性炭脫色 30 min，過濾，取濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，蒸干，即得富含CBD的浸膏。

姚德坤等[9]使用的是內(nèi)、外切葡聚糖酶和纖維素酶。將新鮮大麻根部、莖部或葉子部位切成2～3 cm左右的小段，干燥1.5～2 h，將干燥后的小段研磨粉碎，過20～40目篩，按料液比1∶5加入酶濃度為0.5 ‰～1.5‰的內(nèi)、外切葡聚糖酶和纖維素酶，其體積比為1∶1∶1，調(diào)節(jié)pH至4.5，在40～50 ℃條件下，酶解1～2 h。以75%～95%乙醇為溶劑，200～500 W 微波提取5～10 min，過濾，濃縮得CBD粗提物。加入60%乙醇(其比例為1∶3)于高壓處理袋中，在400 MPa條件下，加壓提取20～30 min。過濾，重復(fù)提取2次，將濾液濃縮，即得膏狀物。將膏狀物上硅膠層析柱，用乙酸乙酯：氯仿 =5∶1至7∶1洗脫，收集洗脫液真空干燥后得CBD，回收率達90%以上。

1.2 超臨界流體提取法 超臨界CO2是一種介于氣體和液體中間狀態(tài)的物質(zhì)，它不僅具有液體的流動性，能萃取某些脂溶性物質(zhì)；還具有與氣體相似的擴散性，超臨界CO2萃取技術(shù)就是利用這一特性發(fā)展而來。這種萃取方法通常需要使用專門的具有三個腔室的“閉環(huán)萃取器”完成。

朱元莊[10]將火麻植物的花葉采摘后，在70～100 ℃下干燥 2～3 h，粉碎，采用亞臨界萃取裝置進行萃取，以20%～40%乙醇為夾帶劑，萃取裝置溶劑為正丁烷、乙醇或兩者不定比例的混合物，用量為花葉質(zhì)量的5～8倍，萃取溫度35～45 ℃，壓力0.4～0.6 MPa，萃取時間40～60 min。通過上述操作可得到富含大麻二酚的粗浸膏，將粗浸膏溶于乙醇溶液(乙醇用量為粗浸膏的5～10倍)后低溫冬化處理，溫度為 -10 ℃～40 ℃，時間45～60 min，將低溫處理后的溶液進行離心(4500～6000 r/min離心20～30 min)或過濾。取上清液，加入活性炭(用量為粗浸膏質(zhì)量的6%～10%)進行脫色，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，可得富含CBD 的火麻浸膏。

項偉等[11]將大麻花葉在 120 ℃條件下干燥 0.5～4 h，粉碎至50目以上，在30～55 ℃、13～30 MPa 條件下采用CO2超臨界萃取1～9 h(采用濕法，上樣前先用 1BV 的磷酸緩沖液進行柱平衡，再用 2BV 10% 的乙醇溶液進行柱平衡)，回收CO2，得大麻花葉的初提物。將初提物溶解于10倍體積的乙醇或甲醇中，精細(xì)過濾除去雜質(zhì)，蒸干溶劑后備用。再上苯乙烯大孔吸附樹脂或?qū)游龉枘z，用不同梯度濃度的乙醇洗脫(濃度分別為25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%)，收集洗脫液，蒸干后得CBD粗品。在此工藝技術(shù)條件下，不僅提高了CBD的含量，同時也降低了THC的含量。

高寶昌等[12]將漢麻成熟期的花葉在自然條件下晾干或在30～60 ℃條件下烘干1～4 h去除水分，粉碎，用超臨界CO2萃取CBD，在45 ℃，壓力30 MPa條件下萃取3 h，得到大麻二酚浸膏。將大麻二酚浸膏溶解于無水乙醇，離心處理并收集上清液，加入大孔吸附樹脂(NKA-Ⅱ、H-103、DM-130、X-5、D101 的一種或幾種)中，在25 ℃下震蕩12 h，用60%乙醇洗脫。重復(fù)以上步驟，濃縮后得大麻二酚濃縮液。將濃縮液裝入硅膠分離柱，以石油醚/乙酸乙酯比例95∶5進行洗脫，收集CBD餾分，減壓濃縮后得CBD純化液。

孫川[13]取工業(yè)大麻的花、葉子、麻糠(去除麻籽)中的一種或幾種作為原料，將其粉碎至40～100目，然后在80～160 ℃下干燥 0.5～1 h，再將粉碎原料進行超臨界CO2萃取，其萃取溫度為30～50 ℃，壓力10～30 MPa，萃取1～4 h得大麻二酚初提浸膏。將初提浸膏加熱至40～100 ℃，分子蒸餾(加熱溫度80～200 ℃，真空度1.33～1999.8 Pa)得CBD富集物。最后。以大孔樹脂或 MCI 樹脂(或 C18 硅膠)為固定相，超臨界CO2為流動相，乙醇為夾帶劑，超臨界二氧化碳和乙醇質(zhì)量比為85∶15至98∶2，分離純化，得到無THC且純度大于99%的CBD。

1.3 超聲輔助溶劑法提取 將有機溶劑作為提取溶劑加入到大麻植物原料中，在超聲條件下混合數(shù)分鐘，可以使大麻素等轉(zhuǎn)移到有機溶劑中，對大麻酚類物質(zhì)進行提取。

高寶昌等[14]為了確定超聲輔助溶劑法提取大麻二酚的最佳條件，考察了該提取方法中多種因素對提取率的影響，最終確定最優(yōu)條件為：以無水甲醇作為提取溶劑，超聲時間15 min，料液比為1∶20，提取次數(shù)為3次。該方法操作簡單且高效、提取完全。將提取物上ODS柱，以甲醇∶水=78∶22為流動相進行等度洗脫，分離出大麻二酚。

趙立寧等[15]將大麻植株干燥后粉碎后，溶于正己烷-乙酸乙酯 (v/v=9∶1) 的混合溶劑中進行超聲提取，按提取液:KOH溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%或10%)=5∶1體積比混合，萃取靜置后得到上、中、下三層分別為有機相、沉淀相和水相，上下兩層均含有CBD。將上層有機相在60 ℃條件下旋干2～3 min，下層水相在80 ℃條件下旋干10～20 min后得到固體，水洗即得CBD。該方法簡單，易于實現(xiàn)工業(yè)化，且目標(biāo)產(chǎn)物的純度可達84%～90%，富集率可達80%。

時圣巖[16]將從大麻花葉中提取的粗品溶于水或乙腈中，經(jīng)超聲、過濾后，取其濾液。將濾液泵入以十八烷基鍵合硅膠為固定相，以乙腈和水的混合溶液(乙腈和水的體積比為 20∶80至 40∶60)為流動相的動態(tài)軸向壓縮柱進行分離，利用紫外檢測器在220 nm檢測，并收集保留時間在155～240 min的餾分，該餾分就是CBD。將收集到的餾分進行減壓旋蒸濃縮，冷卻干燥后經(jīng)HPLC分析，CBD純度高達 99%。

1.4 熱回流提取法提取 將有機溶劑作為提取溶劑加入到大麻植物中，熱回流數(shù)小時，使大麻中部分成分轉(zhuǎn)移到有機溶劑中，從而對大麻植物中的活性物質(zhì)進行提取。

王昆華等[17]將大麻粉碎，用60%～70%乙醇溶液回流提取2～3次，第一次提取加樣品質(zhì)量7～8倍體積的乙醇溶液，后兩次可加5～6倍質(zhì)量體積的乙醇溶液，每次提取時間均為1.5～2.5 h，合并提取液并進行濃縮，即得流浸膏。加入流浸膏體積2～3倍的水，再用NaOH、三乙胺、氨水或三乙醇胺水溶液等堿性溶劑調(diào)pH=11～12，回流提取2～3次。棄濾渣，合并濾液，再加稀HCL調(diào)pH=7，再加入等體積的氯仿-石油醚(v/v=1∶1-1∶2)萃取3～4次，將CBD萃取到有機相中，回收有機溶劑得大麻二酚粗膏。加入20%～30%乙醇，過聚酰胺柱，依次用純凈水、40%～50%乙醇、70%～80%乙醇洗脫，收集含大麻二酚洗脫液，濃縮后得聚酰胺層析大麻二酚濃縮物。再上氧化鋁柱，依次用體積比為1∶3的氯仿-石油醚和體積比為8∶1∶1或10∶0.5∶2的氯仿-甲醇-四氫呋喃洗脫，收集含CBD的洗脫液進行濃縮得CBD粗品。甲醇溶解所得CBD粗品，過氨基鍵合硅膠柱(氰基鍵合硅膠柱或苯基鍵合硅膠柱)，加壓后進行柱層析。首先，用20%甲醇平衡、40%～50%甲醇洗脫2～3個體積柱后，用65%～70%甲醇洗脫，將收集含CBD的洗脫液濃縮。最后，濃縮物用丙酮溶解，加入冰醋酸，結(jié)晶、過濾，低溫干燥得CBD。運用此方法得到的產(chǎn)品純度高，可達98%，回收率高，可用于工業(yè)化推廣。

欒云鵬[18]以工業(yè)大麻為原料，干燥后粉碎至花葉粗粉，將粗粉加入3～10倍體積無水乙醇、95%乙醇、石油醚中的一種或幾種，60～80 ℃條件下熱回流，每次回流提取1～3 h，提取2～3次。合并提取液，濃縮，得工業(yè)大麻流浸膏。將流浸膏進行大孔樹脂層析(大孔樹脂包括D101型、AB-8型、XAD-2型等)，依次用30%～40%、60%～80%的乙醇洗脫，合并含大麻二酚部分洗脫液，濃縮后得大麻二酚富集物。將富集物進行正相硅膠柱層析，以石油醚：二氯甲烷=(4～15)∶1洗脫，合并含大麻二酚的洗脫液，減壓濃縮干燥，得大麻二酚純品。

高哲等[19]以大麻葉進行熱回流法提取CBD，并對其提取工藝進行了優(yōu)化。通過單因素試驗和正交試驗分析得出CBD熱回流法的最佳提取工藝條件為：火麻葉在60 ℃下烘干至恒重，粉碎過20目篩，以正己烷作為提取溶劑，其料液比為1∶15，在80 ℃下提取3 h，然后冷卻，抽濾，旋蒸濃縮得浸膏。優(yōu)化后此工藝浸膏得率為5.24%，浸膏中CBD的含量為46.16 mg/g。

1.5 分子蒸餾純化 普通蒸餾和精餾的原理是利用混合物物料體系沸點差來實現(xiàn)液體混合物的分離，其氣體與液體一直處于平衡狀態(tài)。而分子蒸餾是一種特殊的非平衡態(tài)蒸餾，它依賴于不同物質(zhì)平均自由程的差異，可遠離沸點操作大幅度節(jié)約能耗，同時減少熱敏物質(zhì)的熱損傷避免物質(zhì)分解或聚合。分子蒸餾相較于普通蒸餾相對揮發(fā)度更高，更容易實現(xiàn)物質(zhì)分離，在高真空度下工作時，能有效脫色并去除溶劑、有害金屬和化學(xué)殘留物，在提純物質(zhì)等方面更具優(yōu)勢。因此，采用分子蒸餾法對超臨界CO2萃取所獲得的大麻二酚粗提物進行富集和分離純化，富集大麻二酚后樣品的純度可達80%[20]。

1.6 樹脂吸附法純化 工業(yè)色譜柱是利用普通液相色譜分離原理設(shè)計工業(yè)色譜柱設(shè)備系統(tǒng)，并根據(jù)原料分離純化要求從混合物中提取純物質(zhì)，它能夠?qū)⒎肿诱麴s得到的CBD產(chǎn)品純度進一步提高。它在大口徑液相色譜柱和大流量進樣系統(tǒng)基礎(chǔ)上，采用DDS系統(tǒng)多項因素進行優(yōu)化以達到良好的分離效果，相較于傳統(tǒng)柱層析設(shè)備其自動化程度、分離效率和生產(chǎn)能力都得到了大幅提升。采用該方法對大麻二酚富集物進行分離純化時，可以通過調(diào)整其工藝參數(shù)以獲得不同品質(zhì)的CBD產(chǎn)品，也可獲得純度 99%以上的精品CBD產(chǎn)品[20]。當(dāng)然，設(shè)備目前的主要缺點在于其投資較高，不利于大規(guī)模進行生產(chǎn)。

2 化學(xué)合成

2.1 全合成法 合成大麻二酚最經(jīng)典是Mechoulam報道[21]的方法，該法的原理是在三氟化硼的催化下，用1,3-二羥基-5-戊基苯和對薄荷-2,8-二烯-1-醇縮合得到CBD，具體如下為：

此方法原料易得，反應(yīng)簡單，故而該方法一直被視作提取CBD產(chǎn)品的經(jīng)典方法并在較長一段時間內(nèi)沿用。但該反應(yīng)體系復(fù)雜，有較多異構(gòu)體和二聚體，后處理麻煩，需要柱層析純化且收率較低，不宜于放大生產(chǎn)。

陳劍戈等[22]以2,4-二羥基-6-戊烷基苯甲酸甲酯為原料，在氫氧化鉀催化下與N,N-二烷基醇胺進行酯交換后與(1S,4R)-1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-醇在Lewis酸催化下發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，經(jīng)酸堿萃取和重結(jié)晶后得到高純度關(guān)鍵中間體產(chǎn)品，最后經(jīng)過水解脫羧獲得粗品大麻二酚。該方法得到的粗品經(jīng)過一次重結(jié)晶即可得到符合原料藥質(zhì)量要求的大麻二酚，并且制得CBD純度可達99.88%～99.98%。同時此方法原料及試劑價格低廉，商業(yè)獲得方式簡單，總產(chǎn)率最高可達35%～40%，工藝明顯提高。合成路線如下：

Zachary P.Shultz等[23]以1,3-二羥基-5-戊基苯為原料，通過一系列化學(xué)反應(yīng)得到CBD，合成路線如下圖所示：

2.2 半合成法

文獻報道[24]，將食品級氧化物(如ZnO，MgO，CaO或鹽、Na2SO4)與粉狀大麻生物質(zhì)混后加熱至60 ℃至7 5℃，幾天時間大多數(shù)大麻生物質(zhì)中的CBD-A將會轉(zhuǎn)化為CBD。同時，如果將這些試劑加入到CO2大麻提取物中加熱至約50 ℃，24 h左右即可完成脫羧。如果將大麻提取物與水、MgSO4和少量苛性堿混合，該混合物75 ℃條件下加熱后可在2小時內(nèi)進行脫羧，轉(zhuǎn)化為大麻二酚。

大麻素類主要的化學(xué)形式為大麻酚和大麻酚酸，新鮮大麻組織中大麻素均以酸的形式存在；大麻植株及其提取物在干燥、陳化、加熱或焚燒后，大麻酚酸通過非酶促反應(yīng)脫羧基轉(zhuǎn)化為大麻酚[25]。

3 生物合成

我國對于大麻的種植已經(jīng)有幾千年的歷史，但至今才探索出大麻素的生物合成途徑(圖1)。大麻素的生物合成依賴于聚酮化合物[26]和脫氧木酮糖-5-磷酸/2-甲基赤蘚醇磷酸(DOXP/MEP)[27]。這種著聚酮化合物由聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)在催化條件下生成，并在生物體中廣泛存在。大麻植株中的聚酮合酶首先催化己酰輔酶A(hexanoyl-CoA)，隨后與酶活性位點結(jié)合，經(jīng)丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)的一系列脫羧縮合后聚酮鏈延長，酶中間產(chǎn)物閉環(huán)并芳構(gòu)化形成聚酮化合物——戊基二羥基苯酸(olivetolic acid, OLA)，它也是大麻素合成的起始底物。DOXP/MEP途徑產(chǎn)生的異戊烯基焦磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl diphosphate，DMAPP)在合成酶作用下生成焦磷酸香葉酯(geranyl pyrophosphate，GPP)；在異戊烯轉(zhuǎn)移酶(prenyltransferase)作用下，OLA既可以接受GPP也可接受GPP的異構(gòu)體焦磷酸橙花酯(neryl pyrophosphate,NPP)，分別形成以下兩種單萜類化合物：大麻萜酚酸(CBGA)和大麻酚酸(CBNRA)[28]。同時，由于GPP的活性遠大于NPP，因此大麻植株中CBGA含量遠大于CBNRA[29]。

圖1 大麻素的生物合成圖

CBGA是THCA、CBDA、CBCA三種合成酶的共同底物[30-33]，經(jīng)氧化還原后分別形成THCA、CBDA和CBCA(圖1)。Sirikantaramas等人[34]對THCA和CBDA兩種合成酶分別進行深入研究后，發(fā)現(xiàn)兩種酶在功能和結(jié)構(gòu)上具有很高的相似性。兩者的相似之處在于其催化反應(yīng)過程都需要在氧分子的參與下結(jié)合FAD，同時釋放H2O2。二者的區(qū)別在于質(zhì)子的轉(zhuǎn)移方法，THCA合成酶與CBDA合成酶二者分別從羥基和末端甲基上轉(zhuǎn)移1個質(zhì)子，通過空間閉合環(huán)化形成THCA和CBDA。

加州大學(xué)Jay Keasling課題組羅小舟博士等[35]闡述了CBD生物合成的相關(guān)研究。通過酵母菌進行基因改造，將植物體內(nèi)表達CBD相關(guān)的基因片段倒入酵母菌，實現(xiàn)了大麻素的生物全合成。該研究以半乳糖為起始材料，對酵母自身的甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway)進行改造，引入一條合成己酰輔酶A(hexanoyl-CoA)的代謝途徑，在多種不同的外源基因及催化酶的作用下，在酵母中完成大麻素生物合成途徑的異源重構(gòu)，實現(xiàn)了包括CBGA、THCA、CBDA等多種主要大麻素及其衍生物的生物全合成。這個代謝途徑如圖2。

圖2 CBD生物合成途徑圖

4 結(jié)語

CBD提取技術(shù)在較低成本上盡可能提高其提取率和純度，同時盡可能去除THC殘留、避免毒性有機溶劑的使用，確保產(chǎn)品的安全性和環(huán)保性。熱回流提取法的優(yōu)點是提取規(guī)模容易放大、提取過程容易控制、經(jīng)濟簡單，缺點是提取不完全；超臨界二氧化碳萃取法提取完全，但設(shè)備昂貴、不利于規(guī)模放大、且操作復(fù)雜、提取成本高。工業(yè)化生產(chǎn)一般采用熱回流提取法對CBD進行提取。目前的CBD合成方法里，化學(xué)合成面臨成本高、工藝復(fù)雜等諸多挑戰(zhàn)，生物合成報道較少，因其具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)專一、非資源依賴、環(huán)保等優(yōu)勢，是一個新的且具有前景的研究方向，值得進一步探索。