截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h對MRSA菌株的抑菌作用及作用機(jī)制研究

孫宇豪 陳恬 林皓楠 邱詩越 范維 修思琴

(成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610500)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作為一種常見的人類共生細(xì)菌，大約三分之一人的皮膚和鼻孔黏膜上都有這種革蘭陽性細(xì)菌[1-2]。當(dāng)人體免疫力下降時，它能夠侵襲局部組織引起肺炎、骨髓炎和心內(nèi)膜炎，甚至進(jìn)入血管造成感染性休克[3]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus, MRSA)是由金黃色葡萄球菌通過基因水平轉(zhuǎn)移和自然選擇而來的一種對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有多重耐藥性的菌株。自從MRSA菌株在1961年被Jevons首次發(fā)現(xiàn)以來，其在全球范圍內(nèi)的感染率呈上升趨勢[4]，所引起的疾病目前和乙型肝炎、艾滋病一起被列為全球3大難治的感染性疾病[5-6]。

臨床上目前用于治療MRSA感染的藥物主要為萬古霉素，它可以阻斷肽聚糖合成，造成細(xì)胞壁缺陷，使菌體裂解死亡[7]。但近年來由于萬古霉素在抗感染治療中的大量應(yīng)用，MRSA對其的敏感性也逐年下降[8],并且發(fā)現(xiàn)了耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌(vancomycinresistanceStaphylococcus aureus，VRSA)[9]。因此，新型抗MRSA感染藥物的研究與開發(fā)是當(dāng)前抗生素藥物研究的重點(diǎn)。

截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h由西華大學(xué)張園園教授合成[10]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該化合物對MRSA菌株有較明顯的抑菌作用，本實(shí)驗(yàn)欲通過繪制殺菌曲線、測定細(xì)菌細(xì)胞膜通透性、細(xì)菌可溶性蛋白含量和觀察細(xì)菌外部形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步研究其抑菌作用及作用機(jī)制，為合成更有效的抗菌化合物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300購自美國典型菌種保藏中心，于-80℃保存。

1.2 藥物和試劑

截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h和截短側(cè)耳素(由西華大學(xué)張園園教授提供)；萬古霉素鹽酸鹽(上海生工生物工程股份有限公司)；MH瓊脂培養(yǎng)基和MH肉湯培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司)；考馬斯亮藍(lán)R-250(德國Biofroxx公司)；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)和彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(10～170 kD)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)菌的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

2.1.1 抑菌圈測試(DIZ)

向50℃左右的液態(tài)固體培養(yǎng)基中加入適量0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛鹊腗RSA菌株ATCC33591和ATCC43300菌液使培養(yǎng)基菌濃度為107CFU/mL，混勻后趁培養(yǎng)基未凝固倒平板。固體培養(yǎng)基冷卻凝固后用打孔器在中心打孔加入20 μL化合物ZYY-12h溶液作為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立3組復(fù)孔，以萬古霉素和截短側(cè)耳素作為陽性對照，含1% DMSO的培養(yǎng)基作為陰性對照，37℃培養(yǎng)18～20 h后，用游標(biāo)卡尺測定各組的抑菌圈直徑[11]。

2.1.2 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)

根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[12]采用微量肉湯稀釋法測定截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h對MRSA菌株ATCC33591和ATCC43300的最小抑菌濃度(MIC)，從128 μg/mL濃度開始倍比稀釋化合物，設(shè)立3個復(fù)孔，以萬古霉素和截短側(cè)耳素作為陽性對照，1%DMSO作為陰性對照，每一孔加入100 μL的105～106CFU/mL的菌液，輕微振蕩后放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h后，肉眼觀察96孔板，未見渾濁的最低藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。再從上述MIC孔及其前4孔中取出50 μL培養(yǎng)液涂布于MH平板上，37℃繼續(xù)培養(yǎng)18～20 h后，培養(yǎng)皿中無細(xì)菌生長的ZYY-12h最低濃度即為最低殺菌濃度(MBC)。

2.2 時間-殺菌曲線

在MH肉湯培養(yǎng)基中分別加入不同劑量的截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h使其終濃度分別為0、0.5×MIC、1×MIC、2×MIC和4×MIC，再加入相應(yīng)對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液(106～107CFU/mL)，放入37℃培養(yǎng)箱中，在0、2、4、6、12和24 h分別取10 μL培養(yǎng)液10×倍比稀釋后接種于MH平板，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)，繪制時間-殺菌曲線。

2.3 細(xì)胞膜通透性測試

在MH肉湯培養(yǎng)基中接種對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)為107～108CFU/mL，分別加入截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h，使ZYY-12h的濃度分別為0、1×MIC、2×MIC、4×MIC和8×MIC，在37℃恒溫?fù)u床中連續(xù)培養(yǎng)。分別在1、2、4和6 h取各組培養(yǎng)液1 mL，4000 r/min離心10 min，取上清液用微量分光光度計(jì)測定A260[13]。

2.4 MRSA菌可溶性蛋白含量測定

在MH肉湯培養(yǎng)基中加入對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)為107～108CFU/mL，分別加入截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h，使ZYY-12h的濃度分別為0、1×MIC、2×MIC和4×MIC，放入37℃恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)16h后，離心機(jī)4000 r/min離心10 min棄上清液，用PBS稀釋沉淀至A600為0.6，取等量各組菌懸液離心收集沉淀混懸于40 μL無菌水中，以1:4體積比加入上樣緩沖液，吹打混勻后沸水浴煮沸10 min，最后4000 r/min離心10 min取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色[13-14]。

2.5 細(xì)菌形態(tài)觀察

在MH肉湯培養(yǎng)基中接種對數(shù)生長期的MRSA菌株ATCC33591菌液，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)為107～108CFU/mL，分別加入截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h，使化合物的濃度分別為0、2×MIC和4×MIC，放入37℃恒溫?fù)u床連續(xù)培養(yǎng)20h后收集菌體，依次用戊二醛和梯度濃度乙醇固定脫水后送到四川大學(xué)分析測試中心用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)[15]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)。本研究中涉及到的定量資料以(x_±s)形式描述，用方差分析的方法比較組間差異，以P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)菌的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表1所示， 截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h對ATCC43300和ATCC33591兩種MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑(DIZ)分別為(24.9±1.33) mm和(24.9±0.83) mm，最小抑菌濃度(MIC)均為0.125 mg/mL，與對照組相比，MRSA菌株對ZYY-12h的敏感性明顯大于其母核截短側(cè)耳素，且ZYY-12h略優(yōu)于目前臨床針對MRSA感染最常用抗生素萬古霉素。ZYY-12的最小殺菌濃度(MBC)為0.5 mg/mL，說明在較高濃度下ZYY-12h具有殺菌作用。

表1 MRSA菌株的抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Antibiotic susceptibility test results of MRSA strain

3.2 時間-殺菌曲線

時間-殺菌曲線結(jié)果如圖2所示，正常生長曲線對照組的細(xì)菌在2 h后進(jìn)入對數(shù)生長期快速增殖，10 h后增殖速度減慢但仍在緩慢增殖。在1×MIC濃度水平，ZYY-12h和截短側(cè)耳素與對照組相比在0～10 h內(nèi)均有一定的抑菌作用，且ZYY-12h組的抑菌作用更明顯，但在兩組在24 h后均未表現(xiàn)出明顯的殺菌效果。在4×MIC濃度水平，ZYY-12h和截短側(cè)耳素均有明顯的抑菌作用，在10～24 h內(nèi)使細(xì)菌數(shù)量急劇下降并且在24 h后將細(xì)菌全部殺死。

3.3 細(xì)胞膜通透性測試

細(xì)胞膜通透性測試結(jié)果如圖3所示，未用截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h處理的陰性對照組上清液6 h內(nèi)A260未出現(xiàn)明顯變化，始終小于0.08；與對照組相比，除了1×MIC組，其他經(jīng)ZYY-12h處理后的各實(shí)驗(yàn)組上清液A260都有明顯的升高，且隨時間的增加而增加(P<0.05)。在相同的時間點(diǎn)上，ZYY-12h的濃度越高上清液在260 nm處的吸光度值也越高(P<0.05)。綜上MRSA菌株的細(xì)胞膜通透性與新截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h呈時間-效應(yīng)關(guān)系和劑量依賴關(guān)系。

3.4 MRSA菌可溶性蛋白測試結(jié)果

可溶性蛋白測試結(jié)果見圖4，與未用截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h處理過的對照組相比，用ZYY-12h處理過的3個實(shí)驗(yàn)組泳道大部分條帶顏色較淺，尤其是分子量大小在70和25 kD附近的兩個條帶幾乎消失；而55和15 kD附近的兩個條帶與對照組相比略有加深。同時隨著ZYY-12h的濃度增加，條帶顏色越淺，當(dāng)ZYY-12h濃度達(dá)到4×MIC時，幾乎觀察不到被考馬斯亮藍(lán)染色的可溶性蛋白。

3.5 細(xì)菌形態(tài)觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果如圖5所示，在10,000倍放大下可以觀察到對照組細(xì)菌外觀飽滿、形態(tài)規(guī)則、表面光滑，折光性好；經(jīng)過不同濃度ZYY-12h處理后，實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組相比，雖形態(tài)結(jié)構(gòu)大致完整，但細(xì)菌表面粗糙、皺縮，折光性下降，菌體之間出現(xiàn)黏連聚集；且4×MIC組細(xì)菌表面出現(xiàn)明顯的條索狀黏連隆起，菌體之間的黏連更加明顯。

4 討論

近年來由于抗生素的大量使用，細(xì)菌的耐藥問題越來越引起人們的重視，其中MRSA菌株引起的感染最為常見[16]。甲氧西林耐藥基因(mecA)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的特殊青霉素結(jié)合蛋白PBP2a是MRSA菌株產(chǎn)生耐藥性的主要原因，由于β-內(nèi)酰胺類抗生素與其親和力很低，所以無法有效抑制MRSA菌株的生長[17]。截短側(cè)耳素是1951年由哥倫比亞科學(xué)家Kavanagh等[18]從真菌擔(dān)子菌綱側(cè)耳屬Pleurotus mutilis和Pleurotus passeckerianus菌中分離提取所得，骨架由一個八元環(huán)、一個六元環(huán)和一個五元環(huán)組成，由于其能夠和細(xì)菌核糖體肽?；D(zhuǎn)移酶中心(PTC)發(fā)生作用，抑制菌體蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細(xì)菌的增殖[19]。目前應(yīng)用的截短側(cè)耳素衍生物主要有泰妙菌素(tiamulin)、沃尼妙林(valnemulin)和瑞塔莫林(retapamulin)。由于目前截短側(cè)耳素及其衍生物的生物利用度較低，在人體內(nèi)無法發(fā)揮有效抑菌作用，所以只有瑞塔莫林用于臨床抗感染，主要針對化膿性皮膚病[20]。但是截短側(cè)耳素具有良好的抗菌活性和特殊的抑菌機(jī)制，且耐藥緩慢，所以設(shè)計(jì)合成截短側(cè)耳素的新衍生物對解決當(dāng)前的細(xì)菌耐藥問題有十分重要的意義。

本研究測定了截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h的抑菌活性并對其抑菌機(jī)制做了初步探究。藥敏試驗(yàn)測得ZYY-12h對MRSA菌株的最小抑菌濃度(MIC)為0.125 mg/mL，最小殺菌濃度(MBC)為0.5 mg/mL，比臨床抗MRSA感染最常用的萬古霉素更加敏感。在此基礎(chǔ)上測定了時間-殺菌曲線，能夠動態(tài)地觀察不同濃度ZYY-12h在不同時間抑菌活性的變化[21]。ZYY-12h對MRSA菌株的抑制主要表現(xiàn)在細(xì)菌的對數(shù)生長期，在較低濃度(1×MIC)下短時間內(nèi)可抑制細(xì)菌快速增殖但是10 h后抑菌作用逐漸減弱；較高濃度(4×MIC)下則直接表現(xiàn)為殺菌作用，24 h內(nèi)可將細(xì)菌基本殺死，說明其抑菌機(jī)制可能是抑制某些細(xì)菌增殖所必須材料的合成或者組裝，從而使細(xì)菌無法正常增殖。蛋白質(zhì)是維持細(xì)菌生命活動的重要物質(zhì)，一旦蛋白質(zhì)的生成受到抑制，細(xì)菌就無法進(jìn)行正常的生命活動[22]。通過SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)經(jīng)ZYY-12h處理后的MRSA細(xì)菌中可溶性蛋白含量明顯減少，分子量大小接近70和25 kD蛋白，提示ZYY-12h可能與其母核截短側(cè)耳素相似，能夠與細(xì)菌核糖體50S亞基結(jié)合，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。細(xì)菌的細(xì)胞膜是細(xì)菌極其重要的結(jié)構(gòu)之一，承擔(dān)著物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、呼吸和分泌、生物合成以及參與細(xì)菌分裂等重要生理功能[23]。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變時，胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)會泄漏到胞外，所以波長260 nm處上清液吸光度值被認(rèn)為是反應(yīng)細(xì)胞膜通透性改變的一項(xiàng)重要指標(biāo)。張斌等[24]就通過測定細(xì)菌懸液離心的上清液A260發(fā)現(xiàn)地榆水提液能夠使MRSA菌株細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性改變從而抑制細(xì)菌生長。

值得注意的是本研究中經(jīng)ZYY-12h處理后的MRSA細(xì)菌上清液A260有明顯升高，提示有大量大分子物質(zhì)從細(xì)菌內(nèi)滲出， 說明改變MRSA菌株細(xì)胞膜的通透性使細(xì)菌無法維持正常的生理活動是ZYY-12h的抑菌機(jī)制之一。除此之外，本研究中經(jīng)過ZYY-12h作用后的MRSA細(xì)菌與正常MRSA細(xì)菌相比菌體表面更加粗糙且出現(xiàn)明顯皺縮，菌體之間有黏連聚集現(xiàn)象，提示ZYY-12h能夠改變MRSA菌株的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)，但未到達(dá)殺滅的程度。

綜上，ZYY-12h作為截短側(cè)耳素的衍生物其抗菌機(jī)制與其母核有相似之處，都能夠抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，但細(xì)菌細(xì)胞膜通透性和外部結(jié)構(gòu)的改變均提示ZYY-12h還能夠使MRSA菌株細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變，這可能是由于某些MRSA細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白合成被抑制，使細(xì)菌細(xì)胞膜上的通道蛋白和載體蛋白等的轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到影響，或者是細(xì)菌細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白減少，最終導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)外物質(zhì)交換失衡；也有可能是ZYY-12h直接作用于細(xì)菌表面的某些靶點(diǎn)，破壞菌體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)進(jìn)而使其通透性改變。但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

細(xì)菌耐藥是臨床上一大難題，目前大部分抗生素都被發(fā)現(xiàn)有相對應(yīng)的耐藥菌株，而新截短側(cè)耳素衍生物ZYY-12h作為一個半合成新抗生素，對MRSA具有良好的抑菌活性，有較好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。本研究旨在為以后合成更有效的截短側(cè)耳素衍生物提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。