沙丁胺醇治療重度哮喘急性發(fā)作療效及對(duì)患兒血清TOLL樣受體4、核轉(zhuǎn)錄因子κB通路的影響

馬立茵,李 靜

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121012；2.朝陽市第二醫(yī)院,遼寧 朝陽 122099)

支氣管哮喘(Bronchial asthma,BA)是由多種細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞)、細(xì)胞因子及各類活性炎癥介質(zhì)協(xié)同作用導(dǎo)致的一類慢性炎癥性疾病，具有高應(yīng)答性、慢性氣道炎癥及不可逆性損害等特點(diǎn)[1-2]。其主要臨床癥狀表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作性喘息、咳嗽，對(duì)患兒的生理、生長發(fā)育及心理健康均造成了嚴(yán)重的損害。當(dāng)兒童哮喘急性發(fā)作，極易造成嚴(yán)重的低氧血癥和二氧化碳潴留，病情嚴(yán)重者甚至?xí)l(fā)展為呼吸衰竭，對(duì)患兒的生命安全造成嚴(yán)重威脅。再加上兒童的中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，因哮喘發(fā)作導(dǎo)致的缺氧、二氧化碳潴留還可能會(huì)影響患兒的智力和認(rèn)知能力[3-4]。既往研究表明血清TOLL樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)的表達(dá)與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程存在密切的聯(lián)系，研究指出TLR4與氣道炎癥呈正相關(guān)，其水平高低可直接反映支氣管哮喘患者的炎癥嚴(yán)重程度[5-7]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路主要與機(jī)體的自身免疫能力相關(guān)，可維持正常的機(jī)體生理功能，在調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期及分化等方面起著重要的作用。NF-κB信號(hào)通路的自身免疫在脊椎動(dòng)物中主要表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，長期的信號(hào)通路異常會(huì)對(duì)機(jī)體的性能產(chǎn)生不利的影響。因此基于以上兩類信號(hào)通路上對(duì)哮喘患者進(jìn)行病情評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)具有現(xiàn)實(shí)意義。目前臨床上關(guān)于小兒支氣管哮喘的治療依舊以霧化吸入糖皮質(zhì)激素、β2受體激動(dòng)劑等藥物來控制炎癥、緩解哮喘癥狀為主[8]。硫酸鎂(MgSO4)是目前應(yīng)用較廣的一類哮喘治療輔助藥物，在成人患者的應(yīng)用治療中療效較好，可顯著改善哮喘加重導(dǎo)致的早期臨床癥狀，減少患者再入院概率[9]。沙丁胺醇是一類選擇性β2受體激動(dòng)劑，具有較強(qiáng)的支氣管擴(kuò)張作用，還可增強(qiáng)氣道黏液纖毛清除功能，抑制過敏介質(zhì)釋放，有效緩解氣道痙攣癥狀。目前關(guān)于沙丁胺醇應(yīng)用于兒童哮喘已有研究報(bào)道，但基于TLR4/NF-κB通路分析其療效價(jià)值仍無相關(guān)研究。因此，本文基于TLR4/NF-κB通路探討沙丁胺醇治療兒童重度哮喘急性發(fā)作的臨床療效，旨在為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年6月至2020年8月于我院治療72例重度哮喘急性發(fā)作兒童作為研究對(duì)象，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為研究組和對(duì)照組，每組36例。另選取同期于我院行健康體檢的兒童36例作為正常組。其中，研究組年齡1～5歲，體重15～31 kg；對(duì)照組年齡1～5歲；體重15～30 kg；正常組年齡1～5歲，體重16～30 kg。三組患者的性別、年齡、體重、身高等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。該研究通過我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：研究組和對(duì)照組入組患兒均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[10]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；存在哮喘癥狀急性發(fā)作、心率明顯增加、呼氣高峰流量(Peak expiratory flow，PEF)低于期望值的80%以及存在哮鳴音等任一臨床表征者；臨床資料完整，且依從性良好；不存在研究中所使用的藥物的相關(guān)過敏史；患兒及其法定代理人均充分知情同意，且自愿簽署知情同意書，愿意配合后續(xù)隨訪；病情為重度哮喘急性發(fā)作，無需急救措施。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在心、肝及腎功能異常者；排除合并惡性腫瘤、嚴(yán)重器官功能衰竭者；排除存在心理障礙及精神障礙者；合并感冒、支氣管炎等其他原因引發(fā)咳嗽癥狀者；近3個(gè)月內(nèi)存在糖皮質(zhì)激素、抗體拮抗劑類藥物治療史者。

表1 三組患兒一般資料比較

1.2 干預(yù)方法 排除誘因、全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、氧療及必要時(shí)采取機(jī)械通氣治療的基礎(chǔ)上，兩組患兒均采用面罩式一次性使用氧氣霧化吸入器(WK101-001 Ⅰ型，江蘇偉康潔婧醫(yī)療器械)治療,霧化液體積為3 ml，霧化治療時(shí)間為20 min。對(duì)照組患兒僅給予硫酸鎂注射液治療，將151 mg硫酸鎂注射液(國藥準(zhǔn)字H12020994)溶于0.9%氯化鈉溶液中制備成濃度為33%的硫酸鎂霧化液，體積3 ml。研究組給予沙丁胺醇聯(lián)合硫酸鎂進(jìn)行治療，將2.5 mg沙丁胺醇(國藥準(zhǔn)字H31022999)與151 mg硫酸鎂充分溶于0.9%氯化鈉溶液液中制成3 ml霧化液，兩組均治療3個(gè)月。正常兒童不做任何藥物處理，僅在3個(gè)月治療期內(nèi)完善治療前后的相關(guān)檢查。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床療效評(píng)價(jià)：參照《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》中哮喘急性發(fā)作治療評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)制定本研究療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。顯效，F(xiàn)EV1或PEF指標(biāo)數(shù)值高于預(yù)期值的60%；有效，F(xiàn)EV1或PEF指標(biāo)數(shù)值處于預(yù)期值40%～60%之間；無效，F(xiàn)EV1或PEF指標(biāo)數(shù)值低于預(yù)期值的40%。記錄兩組患兒肺內(nèi)哮鳴音、咳嗽、氣促等臨床癥狀體征消失時(shí)間及哮喘復(fù)發(fā)時(shí)間。

1.3.2 肺功能監(jiān)測(cè)：應(yīng)用哮喘電子檢測(cè)儀(NK360)分別檢測(cè)三組治療前后的肺功能相關(guān)指標(biāo)，包括第1秒用力呼氣量(Forced expiratory volume in the first second，F(xiàn)EV1)、PEF、用力肺活量(Forced vital capacity，F(xiàn)VC)、用力呼出50%肺活量時(shí)的瞬間呼氣流量(Forced expiratory flow at 50% of FVC，F(xiàn)EF50%)，計(jì)算FEV1/FVC值。

1.3.3 血清炎癥因子檢測(cè)：三組均于治療前后在空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘靜脈血，經(jīng)抗凝、離心處理后，保留血清并凍存于-80 ℃環(huán)境中，待統(tǒng)一檢測(cè)。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-4(Interleukin-6，IL-4)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)水平。試劑盒均由美國R&D公司生產(chǎn)，所有操作均嚴(yán)格按照說明書的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，控制批內(nèi)差異<10%，批間差異<15%。

1.3.4 TLR4、NF-κB mRNA檢測(cè)：應(yīng)用Q-PCR法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá)水平，結(jié)合文獻(xiàn)并參照美國Invitrogen 公司提供的mRNA序列，通過Primer 5軟件設(shè)計(jì)并分析引物,mRNA檢測(cè)步驟RT反應(yīng)嚴(yán)格參照說明書執(zhí)行操作。采用相對(duì)表達(dá)量分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，指標(biāo)為2-△△Ct。

1.3.5 不良反應(yīng)：觀察治療期間兩組患兒不良反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒臨床療效比較 研究組治療有效率為94.44%顯著高于對(duì)照組66.67%(χ2=8.867，P<0.05)。研究組氣促、咳嗽、肺內(nèi)哮鳴音消失時(shí)間均明顯短于對(duì)照組，研究組哮喘復(fù)發(fā)時(shí)間明顯長于對(duì)照組(均P<0.05)。見表2、3。

表2 兩組患兒臨床療效比較[例(%)]

2.2 三組患兒肺功能比較 治療前，研究組和對(duì)照組患兒FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%肺功能指標(biāo)水平均明顯低于正常組(均P<0.05)；治療后，研究組和對(duì)照組患兒FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%指標(biāo)水平均顯著提升(均P<0.05)，其中研究組肺功能改善情況明顯優(yōu)于對(duì)照組(均P<0.05)。見表4。

表3 兩組患兒癥狀體征消失時(shí)間和哮喘復(fù)發(fā)時(shí)間比較

表4 三組患兒肺功能指標(biāo)比較

2.3 三組患兒血清炎癥因子水平比較 治療前，研究組和對(duì)照組患兒IL-1β、IL-4及TNF-α等炎癥因子水平均高于正常組，IFN-γ水平低于正常組(均P<0.05)；治療后，研究組和對(duì)照組患兒IL-1β、IL-4及TNF-α表達(dá)水平均顯著下降，IFN-γ水平明顯提升(均P<0.05)，其中研究組IL-1β、IL-4及TNF-α水平降幅明顯大于對(duì)照組，IFN-γ水平增幅大于對(duì)照組(均P<0.05)。見表5。

表5 三組患兒血清炎癥因子水平比較(ng/L)

2.4 三組患兒TLR4、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因變化比較 治療前，研究組和對(duì)照組患兒TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達(dá)水平均高于正常組(均P<0.05)；治療后，研究組和對(duì)照組患兒TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達(dá)水平均顯著下降(均P<0.05)，其中研究組TLR4 mRNA水平高于對(duì)照組，NF-κB mRNA基因表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)。見表6。

表6 三組患兒TLR4、NF-κB信號(hào)通路相關(guān)基因變化比較

2.5 兩組患兒不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 兩組患兒在治療期間均未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，停藥后均得到明顯緩解，研究組不良反應(yīng)總發(fā)生率為19.44%高于對(duì)照組11.11%，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.966，P>0.05)，見表7。

表7 兩組患兒不良反應(yīng)發(fā)生情況比較[例(%)]

3 討 論

隨著社會(huì)的迅猛發(fā)展，人們的生活水平和生活環(huán)境也發(fā)生了極大的變化，兒童哮喘的誘因也在不斷發(fā)生變化。我國哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國城市兒童哮喘患病率在近20年間顯著增長，從1990年的0.11%～2.03%到2010年的0.42%～5.73%，發(fā)病率幾近翻番，分析數(shù)據(jù)不難發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患兒及其家長對(duì)哮喘的危險(xiǎn)因素認(rèn)知不足，致使患兒用藥不規(guī)范、未進(jìn)行系統(tǒng)化規(guī)范化的治療等現(xiàn)象較為普遍[11-12]。支氣管哮喘急性發(fā)作是兒科臨床的常見急癥，其中重度急性發(fā)作通常表現(xiàn)為心率顯著增加和三凹征、奇脈、滿肺哮鳴音，情節(jié)嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)低氧血癥及意識(shí)障礙，甚至可能危及生命。

硫酸鎂是一類臨床常用的解痙藥物，對(duì)平滑肌具有良好的擴(kuò)張作用，且安全性較好，可用作哮喘治療的輔助藥物。相關(guān)報(bào)道顯示，硫酸鎂霧化治療應(yīng)用于成人哮喘患者的療效顯著，可有效改善其因哮喘加重引發(fā)的早期臨床表現(xiàn)，減少其住院治療的幾率。針對(duì)吸入支氣管擴(kuò)張劑沒有良好反應(yīng)的急性重癥哮喘成人或兒童，采用硫酸鎂靜脈滴注治療有效且其安全性較高。但關(guān)于硫酸鎂霧化應(yīng)用于哮喘患者治療的研究結(jié)論尚未完全統(tǒng)一說法[13]。短效β受體激動(dòng)劑(Short acting beta agonists，SABA)是用于緩解哮喘急性發(fā)作的常用藥，其臨床療效確切且應(yīng)用較廣，但對(duì)于中-重度哮喘急性發(fā)作的患兒的癥狀控制效果并不理想。沙丁胺醇是一種選擇性的β2受體激動(dòng)劑，對(duì)支氣管有著較強(qiáng)的擴(kuò)張作用，可興奮氣道平滑肌和肥大細(xì)胞膜表面的β受體，舒張氣道平滑肌，抑制肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞脫粒顆粒和過敏介質(zhì)的釋放、降低微血管通透性、增強(qiáng)氣道上皮纖毛擺動(dòng)等來有效緩解氣道高反應(yīng)[14]。

目前臨床有大量研究證實(shí)硫酸鎂與沙丁胺醇聯(lián)用對(duì)兒童支氣管哮喘急性發(fā)作的治療效果十分顯著。本研究結(jié)果顯示，在治療前，硫酸鎂聯(lián)合沙丁胺醇吸入治療的研究組患兒和單純硫酸鎂治療的對(duì)照組患兒的肺功能指標(biāo)、炎癥因子水平、TLR4 mRNA及NF-κB mRA基因表達(dá)情況均與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明以上指標(biāo)的選擇均具有較好的臨床意義。其中研究組治療有效率為94.44%顯著高于對(duì)照組66.67%；研究組氣促、咳嗽、肺內(nèi)哮鳴音消失時(shí)間均明顯短于對(duì)照組，研究組哮喘復(fù)發(fā)時(shí)間明顯長于對(duì)照組。兩組患兒肺功能均得到明顯改善，但聯(lián)合治療的臨床獲益更佳，研究組FEV1、FEV1/FVC、PEF及FEF50%指標(biāo)水平均明顯高于對(duì)照組。進(jìn)一步比較兩組炎癥因子水平發(fā)現(xiàn)研究組患兒的IL-1β、IL-4及TNF-α水平降幅明顯大于對(duì)照組，IFN-γ水平增幅大于對(duì)照組。提示硫酸鎂聯(lián)合沙丁胺醇霧化吸入治療可有效抑制哮喘兒童急性發(fā)作期炎癥因子的釋放，有效抑制氣道的過敏反應(yīng)，進(jìn)而改善其臨床癥狀和呼吸功能，有效降低其復(fù)發(fā)率。分析認(rèn)為長期反復(fù)應(yīng)用β2受體激動(dòng)劑進(jìn)行治療會(huì)導(dǎo)致支氣管細(xì)胞膜上β受體對(duì)激動(dòng)的敏感性降低，再加上急性重度發(fā)作哮喘兒童自身β2受體功能較差，對(duì)腺苷酸環(huán)化酶的激活不足，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞cMAP濃度偏低。而硫酸鎂中的鎂離子可激活腎上腺能β受體功能，增強(qiáng)β受體與激動(dòng)劑之間的親和力，且可對(duì)β2受體起到一定的調(diào)節(jié)作用，從而增強(qiáng)β受體激動(dòng)劑的支氣管擴(kuò)張效果。硫酸鎂對(duì)腺苷酸環(huán)化酶有著激活作用，使得三磷酸腺苷生成環(huán)磷酸腺苷，進(jìn)而提高cAMP/cGMP的比值，抑制肥大細(xì)胞介質(zhì)的釋放，同時(shí)可活化蛋白酶系統(tǒng)、降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，促使氣管內(nèi)平滑肌松弛，降低氣道阻力，有效解除氣管痙攣，改善肺循環(huán)功能，消除支氣管黏膜水腫，保障氣道通暢，發(fā)揮擴(kuò)張支氣管的作用[15-16]。兩者作用機(jī)制不同，聯(lián)用能夠產(chǎn)生協(xié)同作用提高療效。此外，兩組患兒在治療期間均未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，停藥后均得到明顯緩解，研究組不良反應(yīng)總發(fā)生率為19.44%高于對(duì)照組11.11%，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明沙丁胺醇不會(huì)增加不良反應(yīng)，安全性較高。翁蔚琪等[17]研究證明，硫酸鎂聯(lián)合硫酸沙丁胺醇霧化吸入治療小兒中-重度支氣管哮喘發(fā)作的療效較好，可顯著改善患兒肺功能，縮短住院時(shí)間，降低ICU留治率，與本研究結(jié)論基本一致。

NF-κB信號(hào)通路與機(jī)體的自身免疫相關(guān)，此通路可維持正常的機(jī)體功能。TLR4細(xì)胞內(nèi)的TOLL/IL-1受體結(jié)構(gòu)域可與MyD88的羧基端相互結(jié)合，結(jié)合體與IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1 receptor associatedkinase，IRAK)的氨基端再度結(jié)合，激活I(lǐng)RAK。被激活后的IRAK再激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF Receptor-associated factors 6，TRAF-6)，活化后的TRAF-6進(jìn)而激活NF-κB抑制物的激酶(Inhibitor of NF-κB kinases，IKKs)復(fù)合物。金平飛等[18]研究指出，IKKs復(fù)合物可促進(jìn)NF-κB抑制物磷酸化和降解，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB的有效激活，繼而誘導(dǎo)特定基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)并表達(dá)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。研究顯示，TLR/NF-κB信號(hào)通路若長期處于活化的狀態(tài)下，則會(huì)持續(xù)引發(fā)嚴(yán)重反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺部功能出現(xiàn)病理性改變[19-20]。姚雪紅[21]以60例住院患兒為研究對(duì)象，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各30例,另設(shè)30例健康兒童作為正常組。治療組采用咳喘平顆粒治療,對(duì)照組采用孟魯司特鈉顆粒治療,結(jié)果顯示，相關(guān)治療藥物可通過抑制IRAK磷酸化,來對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，使其處于活化狀態(tài),改善氣道炎性反應(yīng),從而改善喘息性支氣管炎(寒性哮喘)患兒的臨床癥狀。本研究中顯示，治療后，研究組和對(duì)照組患兒TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達(dá)水平均顯著下降，且研究組NF-κB mRNA顯著低于對(duì)照組。提示沙丁胺醇可顯著降低IL-1受體相關(guān)激酶的水平，TLR4可結(jié)合的受體濃度降低，對(duì)IRAK的激活能力降低，進(jìn)而使得患兒血清內(nèi)的TRAF-6因子水平降低，使得后續(xù)一系列鏈化反應(yīng)無法繼續(xù)發(fā)生，進(jìn)而顯著下調(diào)NF-κB mRNA、TLR4 mRNA表達(dá)水平。這與本研究組患兒的IL-1β、IL-4及TNF-α水平顯著低于對(duì)照組結(jié)論相互照應(yīng)。

綜上所述，沙丁胺醇霧化吸入治療可有效改善重度哮喘急性發(fā)作兒童的臨床癥狀，延長其哮喘復(fù)發(fā)時(shí)間，顯著改善患兒的肺功能，降低血清炎性因子表達(dá)水平，減輕炎癥損傷，降低TLR4 mRNA、NF-κB mRNA基因表達(dá)水平，且安全性較好。本研究為單中心、小樣本研究，所得結(jié)論存在一定的局限性，有待擴(kuò)大化的多中心試驗(yàn)證實(shí)。