水心病菠蘿果肉組織石蠟切片顯微觀察與分析

姚艷麗 吳嚴 李明偉 付瓊 劉勝輝 朱祝英 張秀梅

摘??要：水心病是一種菠蘿果實生理性病害，導致菠蘿果肉組織的細胞間隙充滿細胞液而呈現(xiàn)出水漬狀，嚴重影響果實的食用價值和商品價值。水心病已困擾菠蘿產業(yè)發(fā)展多年，但其發(fā)生機制尚不清楚。為了探討菠蘿水心病的發(fā)病機理，本研究以菠蘿主栽品種巴厘為材料，采用石蠟切片的方法對菠蘿果實水心病發(fā)生過程及正常果和水心病果不同組織部位（花托、心皮、果序軸）進行顯微觀察。結果顯示：菠蘿果肉細胞結構與水心病密切相關：正常果實果肉細胞結構完整，細胞間隙明顯，維管束形態(tài)結構完整，韌皮部細胞排列緊密整齊，木質部導管排列規(guī)則；而水心病果實果肉細胞受擠壓變形，細胞壁破裂導致細胞結構不完整，維管束形態(tài)結構破壞，韌皮部擠壓變形，木質部導管破壞形成一個空腔，隨著水心病的發(fā)病進程加深，木質部空腔越大。通過對正常果實和水心病果實不同組織部位的形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)不同組織部位水心病導致的細胞結構變化基本一致，不同組織部位維管束形態(tài)結構存在明顯差異，果序軸和花托部位的維管束符合單子葉植物維管束的典型特征，在每個維管束的外圍，有厚壁機械組織組成的維管束鞘所包圍。而在維管束兩端，厚壁細胞更多。維管束鞘的里面為初生韌皮部和初生木質部，無束中形成層。而心皮部位的維管束結構則為非典型結構，大多數(shù)維管束外圍無維管束鞘包圍。不同組織部位以果序軸的維管組織最發(fā)達，其次是花托，心皮的維管束組織最不發(fā)達。此結果揭示了菠蘿水心病發(fā)生過程中的組織形態(tài)變化，可為水心病發(fā)生機理的深入研究提供參考。

關鍵詞：菠蘿；水心病；細胞結構；石蠟切片；維管束中圖分類號：S667.9??????文獻標識碼：A

Analysis?and?Microscopic?Observation?of?Paraffin?Sections?of?Pineapple?Pulp?in?Watercore

YAO?Yanli1，2，3，4，?WU?Yan1，2，3，?LI?Mingwei1，2，3，?FU?Qiong1，2，3，?LIU?Shenghui1，2，3，?ZHU?Zhuying1，2，3，?ZHANG?Xiumei1，2，3*

1.?South?Subtropical?Crop?Research?Institute，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China;?2.?Key?Laboratory?of?Tropical?Fruit?Biology，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China;?3.?Key?Laboratory?of?Hainan?Province?for?Postharvest?Physiology?and?Technology?of?Tropical?Horticultural?Products，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China;?4.?Zhanjiang?Experimental?Station，?Chinese?Academy?of?Tropical?Agricultural?Sciences，?Zhanjiang，?Guangdong?524013，?China

Abstract：?Watercore?is?a?kind?of?physiological?disease?of?pineapple?fruit，?which?causes?the?intercellular?space?of?pineapple?pulp?tissue?to?be?filled?with?cell?fluid?and?appear?as?water-soaked，?which?seriously?affects?the?edible?value?and?commercial?value?of?the?fruit.?Watercore?has?troubled?the?development?of?pineapple?industry?for?many?years，?but?its?mechanism?is?not?clear.?In?order?to?explore?the?pathogenesis?of?watercore?in?pineapple，?this?study?took?the?main?pineapple?cultivar?Comte?de?paris?as?the?material，?the?paraffin?section?method?was?used?to?observe?the?process?of?watercore?in?pineapple?fruit?and?the?different?tissue?parts?of?normal?and?watercore?fruit?（flower?stock，?carpel，?fruit?sequence?axis）.?The?results?showed?that?the?cell?structure?of?pineapple?pulp?was?closely?related?to?watercore：?the?cell?structure?of?normal?fruit?pulp?was?complete，?the?cell?space?was?obvious，?the?vascular?bundle?was?intact，?the?phloem?cells?were?arranged?tightly?and?neatly，?and?the?xylem?ducts?were?arranged?regularly.?However，?fruit?flesh?cells?in?watercore?are?squeezed?and?deformed，?and?the?cell?wall?rupture?results?in?incomplete?cell?structure，?destruction?of?vascular?bundle?morphology，?extrusion?and?deformation?of?phloem，?and?destruction?of?xylem?ducts?to?form?a?cavity.?With?the?deepening?of?the?onset?process?of?watercore，?the?xylem?cavity?becomes?larger.?Through?the?morphological?observation?of?different?tissue?parts?of?normal?fruits?and?fruit?with?watercore，?it?was?found?that?the?changes?of?cell?structure?caused?by?watercore?in?different?tissue?parts?were?basically?the?same.?There?were?obvious?differences?in?vascular?bundle?morphology?and?structure?in?different?tissue?parts.?The?vascular?bundles?in?the?fruit?sequence?axis?and?receptacle?were?in?accordance?with?the?typical?characteristics?of?vascular?bundles?in?monocotyledons.?The?vascular?bundles?were?surrounded?by?a?sheath?composed?of?thick-walled?mechanical?tissue?at?the?periphery?of?each?vascular?bundle.?On?the?other?hand，?there?were?more?sachmatous?cells?at?both?ends?of?the?vascular?bundle.?The?inner?part?of?the?vascular?bundle?sheath?contains?primary?phloem?and?primary?xylem?without?the?middle?bundle?cambium.?The?vascular?bundle?structure?of?the?carpel?was?atypical，?and?most?of?the?vascular?bundles?were?not?surrounded?by?vascular?sheath.?Vascular?tissues?in?the?fruit?sequence?axis?were?the?most?developed，?followed?by?receptacle，?and?vascular?tissues?in?the?carpel?were?the?least?developed.?These?results?revealed?the?morphological?changes?of?pineapple?watercore?during?its?occurrence?and?provided?reference?for?further?research?on?the?mechanism?of?watercore.

Keywords：?pineapple;?watercore;?cell?structure;?paraffin?section;?vascular?bundle

DOI：?10.3969/j.issn.1000-2561.2023.12.017

菠蘿（Ananas?comosus）是熱帶和亞熱帶地區(qū)最重要的經(jīng)濟作物之一。菠蘿水心病是菠蘿采前普遍發(fā)生的一種生理性病害，主要表現(xiàn)為果肉細胞間隙充滿液體而呈現(xiàn)水浸狀，嚴重時會散發(fā)出酒糟味和惡臭味，導致品質劣變，失去食用價值，嚴重地影響了果實的商品價值。水心病已成為決定菠蘿果實品質的主要限制因子，也是影響我國菠蘿產業(yè)健康發(fā)展的重要因素。目前，對菠蘿水心病發(fā)生機制的研究主要集中在水心病的誘導因素及生理生化特征變化上，總的來說，導致水心病發(fā)生的主要因素有5個：（1）異常溫度。菠蘿采前2～4周高溫或低溫脅迫，水心病顯著增加[1-2]。（2）植物激素。在菠蘿生產中，赤霉素（GA3）被廣泛用于增大果實大小。然而，外源施用GA3可使菠蘿水心病的發(fā)生率增加。（3）礦物質營養(yǎng)缺乏。果實鈣含量低被認為是造成水心病的重要原因?；ê髧娛┾}、硅肥可降低水心病的發(fā)生[3]。（4）糖代謝。在菠蘿果實發(fā)育后期，果肉中細胞壁蔗糖酶高活性增加卸載至果肉非原生質體中的蔗糖，從而導致非原生質體溶質濃度增加（溶質勢降低），水滲透進非原生質體而導致水心病的發(fā)生[4]。（5）冠芽。菠蘿采收前1～2個月去除冠芽，水心病發(fā)病率增加；冠芽越大，水心病越低[5]。但也有研究表明，去除冠芽對水心病的發(fā)生無顯著影響[6]。現(xiàn)有研究表明，溫度、鈣、冠芽及糖積累與糖代謝酶活性與水心病的發(fā)生相關，類似的因素也已被證明與蘋果和梨的水心病發(fā)生有關[7-9]，但尚未得出統(tǒng)一認識，使得菠蘿水心病仍未得到有效控制，在很大程度上降低了菠蘿果實的商品價值。所以，探明菠蘿水心病發(fā)生的機制對于預測和防止水心病的發(fā)生具有重要理論和實際意義。本文對菠蘿水心病果實不同組織及其發(fā)病過程的細胞組織結構特征進行研究，以期明確水心病果實不同組織及發(fā)病過程中細胞結構的變化規(guī)律，為菠蘿水心病發(fā)生機理研究及有效防治提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1??材料

以菠蘿主栽品種巴厘為試驗材料，于2022年3—5月在中國熱帶農業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所菠蘿種質資源鑒定圃采集。于謝花后60?d開始取樣，每7?d取樣1次，至果實成熟。挑選無機械損傷、大小基本一致、無病蟲害的菠蘿果實9個，立即帶回實驗室處理。

1.2??方法

沿果實縱徑切開后觀察水心病的發(fā)病情況，分別選取胎座、花托和果芯3個部位（圖1），切成0.5?cm左右的小塊，立即用70%?FAA固定液固定（不少于組織10倍體積）。石蠟切片制作步驟如下：

（1）脫水。采用趙俊等[10]的方法并有所改進，將固定好的果實樣品用梯度乙醇（50%、70%、80%、95%、100%）進行脫水，每個梯度30?min。

（2）透明。脫水后的樣品采用二甲苯進行透明處理，乙醇與二甲苯（體積比分別為3∶1，1∶1，1∶3）各級時間均為1.5?h→二甲苯（2次），每次1?h。

（3）浸蠟。二甲苯與石蠟（體積比1∶1）42?℃?1～2?d→二甲苯與石蠟（體積比1∶1）48?℃?2?h→二甲苯與石蠟（體積比1∶3）50?℃?2?h→石蠟（2次），60?℃，每次1?h。

（4）包埋。將浸蠟透明的果肉組織置于組織包埋機（Arcadia）中進行包埋，包埋后材料自然冷卻。

（5）切片。將石蠟包埋好的果肉組織塊用Kd1508冷凍石蠟二用切片機連續(xù)切片，切片厚度為10?μm。

（6）脫蠟。采用二甲苯和乙醇的梯度溶液對切片進行脫蠟處理。二甲苯2次（每次20?min）→乙醇和二甲苯（體積比1∶1）（2?min）→100%乙醇2次（每次2?min）→95%乙醇（1?min）→80%乙醇（1?min）→70%乙醇（1?min）→50%乙醇（1?min）→30%乙醇（1?min）→15%乙醇（1?min）→蒸餾水漂洗2次（每次1?min）。

（7）染色。脫蠟完成后，將載玻片放入0.5%甲苯胺藍溶液中染色0.5～1?h，然后反順序進行脫蠟步驟即可。

（8）封片。采用加拿大樹膠封片，37～40?℃恒溫箱種過夜烘干。

（9）觀察。采用蔡司NIKON?80i生物顯微鏡對切片進行觀察拍照，分析細胞顯微結構變化。其中，P表示薄壁細胞，S表示厚壁細胞，Xy表示木質部，Xd表示木質部導管，Xc表示原生木質部空腔，Ph表示韌皮部。

2??結果與分析

2.1??菠蘿水心病發(fā)病過程顯微觀察

石蠟切片觀察菠蘿果實花托部位細胞顯微結構，結果顯示，花托組織中維管束排列稀疏，在每個維管束的外圍，有厚壁機械組織組成的維管束鞘所包圍。而在維管束兩端，厚壁細胞更多。維管束鞘的里面為初生韌皮部和初生木質部，無束中形成層，菠蘿果肉細胞的這種維管束特征屬于有限維管束，并符合單子葉植物維管束的典型特征。

如圖2所示，謝花后60?d果實發(fā)育正常，維管束形態(tài)結構完整，木質部導管排列整齊，導管壁清晰可見，其周圍薄壁細胞細胞壁較平滑，細胞偏圓形，細胞間隙明顯（圖2A、圖2B）。謝花后67?d果實水心病發(fā)生在中部小果的果腔壁上（主要由心皮發(fā)育而來），花托部位無水心病發(fā)生，維管束形態(tài)結構完整，周圍薄壁細胞呈長圓形，細胞間隙不明顯（圖2C、圖2D）。謝花后74?d果實水心病進一步加深，整個果實小果的果腔壁上均有水心病的發(fā)生，花托部位有輕度水心病發(fā)生，維管束中木質部導管遭到破壞，其四周的薄壁細胞互相分離，形成了一個氣隙或稱原生木質部空腔（圖2E、圖2F）。謝花后81?d果實水心病進一步加重，整個果肉均有水心病發(fā)生，維管束結構破壞嚴重，木質部腔隙增大，其周圍薄壁細胞中大部分細胞的細胞壁降解，細胞結構不完整（圖2G、圖2H）。

2.2??水心病對菠蘿花托組織的細胞顯微結構影響

分別選取正常果和水心病果同一位置的花托組織進行切片觀察，結果顯示，正常果實花托組織細胞結構完整，細胞間隙明顯，維管束形態(tài)結構完整，韌皮部細胞排列緊密整齊，僅在木質部外側有分布，木質部導管排列規(guī)則（圖3A、圖3B）。水心病果實花托組織果肉細胞變形，細胞壁出現(xiàn)解體，細胞自溶形成空洞。維管束形態(tài)結構破壞，木質部形成一個空腔（圖3C、圖3D）。

2.3??水心病對菠蘿心皮組織的細胞顯微結構影響

石蠟切片觀察菠蘿正常果實和水心病果實同一位置心皮組織顯微結構，結果表明，水心病果實心皮組織與正常果實心皮組織的薄壁細胞形態(tài)基本一致，但正常組織中的薄壁細胞細胞間隙明顯，而水心病心皮組織中細胞間隙不明顯，這是由于細胞壁降解物質在間隙暫時積累的緣故。正常果實中維管束形態(tài)結構完整，木質部導管排列整齊，韌皮部在木質部兩側均有分布，形成雙韌維管束（圖4A、圖4B）。水心病果實中維管束類型同正常果實中的一樣，也為雙韌維管束，但其韌皮部斷裂分散，木質部具有空腔（圖4C、圖4D）。

2.4??水心病對菠蘿果序軸組織的細胞顯微結構影響

石蠟切片觀察菠蘿正常果實和水心病果實果序軸組織顯微結構，如圖5顯示，正常果實果序軸組織薄壁細胞結構完整，細胞壁平滑偏圓形，而水心病果實中薄壁細胞細胞壁幾乎全部解體，細胞自溶形成大片空洞。與花托和心皮組織中維管束相比，果序軸中的維管束發(fā)達且數(shù)量多。正常果實中維管束形態(tài)結構完整，韌皮部細胞排列緊密整齊，僅在木質部外側有分布，木質部導管排列規(guī)則，與花托組織中維管束形態(tài)基本一致（圖5A、圖5B）。水心病果實中韌皮部被擠壓變形，木質部導管排列紊亂具有空腔，與花托和心皮中的結構特征相似（圖5C、圖5D）。

3??討論

現(xiàn)有研究認為水心病是一種由不利環(huán)境條件引發(fā)的生理失調，而不是由病原菌引起，但發(fā)病機理尚不清楚[11]。INOMATA等[12]研究表明，水心病的發(fā)生與果實成熟和成熟過程有很大關系，并伴隨糖積累和細胞壁成分的改變，例如果膠多糖，在許多水果的成熟和軟化過程中，已經(jīng)觀察到果膠多糖的溶解和解聚作用[13-15]。CHUN等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在日本梨水心病嚴重組織中CDTA-可溶性果膠和4%?KOH可溶性半纖維素多糖的分子質量降解和細胞壁結構破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，水心病菠蘿果實果肉細胞細胞壁降解，導致細胞溶液漏入細胞間隙，細胞結構遭到破壞，而正常果實果肉細胞結構完整，與在日本梨上的研究結果基本一致。

果實內物質積累與其水分運輸密切相關，水分循環(huán)帶動著果實內碳水化合物、礦質元素等的積累。維管束是果實水分和營養(yǎng)物質運輸?shù)闹饕ǖ?，其形態(tài)結構直接影響著物質的運輸與積累，從而影響果實的發(fā)育和品質形成[17]。有研究表明，果實維管束中木質部結構和功能的喪失導致木質部運輸速率下降[18]。對桃果實縫合線軟化與維管束形態(tài)結構的關系研究表明，隨著桃果炭的發(fā)育，腺腔（空腔）不斷擴大，腺腔內含物含量也逐漸增多，且認為腺腔可能起著多糖積累點的作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)菠蘿正常果實維管束形態(tài)結構保持完整，無原生木質部空腔，而水心病菠蘿果實中維管束形態(tài)結構遭到破壞，木質部導管解體而形成一個空腔，且隨著水心病發(fā)病程度的加深而增大，表明果實中輸導組織的改變導致物質運輸能力的改變，細胞代謝紊亂，從而導致水心病的發(fā)生。

4??結論

石蠟切片顯微結構觀察表明，菠蘿水心病的發(fā)生與果肉細胞細胞壁破裂和維管束形態(tài)結構的破壞密切相關。

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