血清外泌體miR-17-92a表達(dá)水平與行結(jié)直腸癌根治術(shù)中注射5-氟尿嘧啶治療的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系

唐 斌 丁 俊 蔣葉平 周聯(lián)明

(1 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院普外科，上海市 201499；2 上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院普外科，上海市 201499)

結(jié)直腸癌是臨床上較為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來，我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)[1-2]。目前臨床上治療結(jié)直腸癌主要以根治性手術(shù)為主，患者術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是影響治療效果的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[3]。有研究表明，結(jié)直腸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)與手術(shù)過程中癌細(xì)胞未被完全清除有關(guān)，手術(shù)中采用抗腫瘤藥物干預(yù)可有效改善患者的預(yù)后[4]。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是臨床上廣泛使用的抗腫瘤藥物，手術(shù)中將5-Fu直接注射在淋巴結(jié)、瘤床、癌細(xì)胞易脫落種植部位及血管周圍等處，可起到抑制腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移、延緩病情復(fù)發(fā)的作用。miR-17-92a是體內(nèi)重要的miRNA，其在多種腫瘤患者血清中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，但miR-17-92a與結(jié)直腸癌的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究探討了血清外泌體miR-17-92a表達(dá)水平與結(jié)直腸癌根治術(shù)中注射5-Fu的結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年1月至2018年1月期間，在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院行腹腔鏡下行結(jié)直腸癌根治術(shù)治療的93例患者作為觀察組，其中男性52例、女性41例，年齡37～65(57.91±7.28)歲；腫瘤分化程度為低分化48例、高分化45例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國(guó)結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2015年版)》[5]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；(3)患者意識(shí)清晰，可正常配合交流溝通；(4)年齡18～65歲；(5)本次治療前未接受過其他治療；(6)知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在手術(shù)禁忌證者；(2)腫瘤下緣距肛緣5 cm以內(nèi)者；(3)對(duì)5-Fu過敏者；(4)合并嚴(yán)重心、腎、肝臟器疾病者；(5)合并其他腫瘤者；(6)臨床資料或隨訪資料缺失者。選擇同期在上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院進(jìn)行體檢的50例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性26例、女性24例，年齡36～65(55.12±8.89)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)意識(shí)清晰，可正常交流溝通；(2)年齡18～65歲；(3)知情同意并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病或腫瘤者；(2)臨床資料缺失。兩組研究對(duì)象的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審議并批準(zhǔn)。

1.2 治療方法 所有觀察組患者均采用腹腔鏡下結(jié)直腸癌根治術(shù)+5-Fu方案治療：采用全身麻醉，嚴(yán)格遵照《普通外科腹腔鏡手術(shù)操作規(guī)范與指南》[6]中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)操作，手術(shù)中切除腫瘤近端腸管10～15 cm，遠(yuǎn)端腸管2.5 cm以上，并徹底清掃淋巴結(jié)，根據(jù)TNM原則切除直腸系膜，取標(biāo)本送至病理科進(jìn)行病理檢查。然后使用生理鹽水沖洗腹腔，取600 mg 5-Fu緩釋劑(蕪湖先聲中人藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20030345)，在鄰近的正常組織器官表面注射150 mg，腸系膜血管根部注射250 mg，腫瘤剝離表面注射200 mg，之后進(jìn)行常規(guī)關(guān)腹。術(shù)后均給予患者抗生素預(yù)防感染及營(yíng)養(yǎng)支持治療。

1.3 資料收集 收集患者的年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤病理類型、腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等資料。術(shù)后隨訪3年，記錄患者的術(shù)后生存期。

1.4 外泌體miR-17-92a提取與檢測(cè) 采集觀察組患者術(shù)前空腹靜脈血5 mL，采集對(duì)照組研究對(duì)象體檢時(shí)空腹靜脈血5 mL，室溫下以2 500 r/min離心10 min后收集血清，采用0.22 μm濾膜過濾，取0.5 mL血清至30 kDa超濾管， 4℃下以10 000 r/min離心30 min濾至剩余100 μL，采用杜氏磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，5 min/次，收集截留物并采用透射電鏡觀察提取物中的外泌體。取外泌體樣品50 μL，使用TRIzol試劑提取總RNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度，采用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：MT0006)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)兩組血清外泌體中miR-17-92a的相對(duì)表達(dá)水平(miR-17-92a正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGACTGCAGTGAAGGCAC-3′，反向引物5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內(nèi)參U6正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)。PCR反應(yīng)總體系共20 μL，正向和反向引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL，cDNA 2.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s，66 ℃退火15 s，52 ℃延伸5 s，重復(fù)循環(huán)45次。以對(duì)照組的miR-17-92a/U6比值平均值的1.25倍作為標(biāo)準(zhǔn)，大于此數(shù)值即為miR-17-92a陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用(x±s)表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法繪制不同miR-17-92a表達(dá)情況患者的生存曲線。以P<0.05為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組研究對(duì)象血清外泌體miR-17-92a表達(dá)水平的比較 觀察組血清外泌體的miR-17-92a表達(dá)水平為3.27±0.84，高于對(duì)照組的0.87±0.22(t=25.948，P<0.001)。

2.2 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者血清外泌體miR-17-92a表達(dá)水平的比較 不同年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤(rùn)深度的結(jié)直腸癌患者血清外泌體的miR-17-92a表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；相比于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期及存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的血清外泌體miR-17-92a表達(dá)水平更高(均P<0.05)，見表1。

表1 不同臨床病理特征結(jié)直腸癌患者血清外泌體miR-17-92a相對(duì)表達(dá)水平的比較

2.3 不同miR-17-92a水平患者的生存期比較 本研究中，觀察組患者血清外泌體miR-17-92a表達(dá)陽(yáng)性66例、陰性27例；血清外泌體miR-17-92a表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者術(shù)后中位生存時(shí)間為31.2個(gè)月，血清外泌體miR-17-92a表達(dá)陰性的結(jié)直腸癌患者術(shù)后中位生存時(shí)間為33.7個(gè)月，血清外泌體miR-17-92a表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者術(shù)后中位生存時(shí)間短于表達(dá)陰性者(χ2=12.384，P<0.05)。見圖1。

圖1 不同miR-17-92a表達(dá)水平患者的生存曲線

3 討 論

腹腔鏡下腫瘤根治術(shù)是目前臨床上治療結(jié)直腸癌的主要方法，該治療方法具有療效確切，可有效阻滯病情進(jìn)展的優(yōu)點(diǎn)[7]。但也有學(xué)者指出，結(jié)直腸癌患者在接受腹腔鏡手術(shù)治療過程中存在遺漏微小轉(zhuǎn)移病灶的缺點(diǎn)，在手術(shù)過程中亦可出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞異常脫落并在其他部位定植的情況，導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[8]。有學(xué)者在手術(shù)期內(nèi)對(duì)患者采用化療方案干預(yù)，發(fā)現(xiàn)這一方案可顯著改善患者的預(yù)后，在術(shù)后腹膜播散高?；颊咧芯哂袠O高的臨床應(yīng)用價(jià)值[9]。

5-Fu緩釋劑是近年來臨床中應(yīng)用廣泛的抗腫瘤類藥物，其可抑制脫氧胸甘酸合成酶活性，干擾蛋白質(zhì)、RNA的合成[10]。5-Fu緩釋劑是化療藥物氟尿嘧啶經(jīng)高分子聚合物包裹而成的，注射5-Fu緩釋劑后，體液逐漸滲入藥粒，使微囊間的藥物釋放速度得到控制，在注射區(qū)域內(nèi)實(shí)現(xiàn)藥物的持續(xù)釋放和濃度累積[11]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在腫瘤周圍注射5-Fu緩釋劑可使5-Fu持續(xù)、緩慢、恒速、穩(wěn)定、均勻地釋放，對(duì)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞起到高效的殺滅作用[12]。研究表明，胃癌和乳腺癌患者采用5-Fu緩釋劑治療可降低腹腔相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生率，且藥物的毒副作用輕，臨床治療效果更好[13]。

外泌體是細(xì)胞外小囊泡，由肽、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸等組成，其直徑在30～100 nm左右，屬于細(xì)胞外細(xì)胞器，含有大量細(xì)胞生物分子，對(duì)細(xì)胞的分化、增殖、免疫反應(yīng)和死亡起到重要作用[14]。有研究表明，精液、唾液、尿液、血液、膽汁和母乳等多數(shù)體液中均可含有外泌體[15]。miRNA屬于經(jīng)典的非編碼RNA，非編碼RNA不具有蛋白質(zhì)編碼功能，但在多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中，miRNA表達(dá)明顯異常，提示其與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。miRNA近年來已成為腫瘤的研究熱點(diǎn)，其可作為評(píng)估和治療結(jié)直腸癌的重要靶標(biāo)[17]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者血清中miR-17-92a呈異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期及分化程度密切相關(guān)[18]。還有研究表明，胃癌患者總體生存率與miR-17-92a高表達(dá)呈顯著相關(guān)，miR-17-92a可作為評(píng)估胃癌患者預(yù)后質(zhì)量、病理進(jìn)展及化療效果的生物學(xué)指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者血清外泌體的miR-17-92a表達(dá)水平高于健康對(duì)照人群(P<0.05)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，相比于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的血清外泌體miR-17-92a表達(dá)水平更高(均P<0.05)，且血清外泌體miR-17-92a表達(dá)陽(yáng)性的結(jié)直腸癌患者術(shù)后中位生存期短于表達(dá)陰性者(P<0.05)。以上結(jié)果表明血清外泌體miR-17-92a異常升高與結(jié)直腸癌患者接受結(jié)直腸癌根治術(shù)聯(lián)合術(shù)中注射5-Fu治療后的預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者血清外泌體miR-17-92a mRNA表達(dá)水平異常升高，血清外泌體miR-17-92a表達(dá)陽(yáng)性的患者接受結(jié)直腸癌根治術(shù)聯(lián)合術(shù)中注射5-Fu治療后的預(yù)后較差。但本研究臨床樣本量較小，且并未對(duì)患者行長(zhǎng)期隨訪和追蹤，其結(jié)論還有待進(jìn)一步研究。