不同品種來源枸杞子多糖及甜菜堿含量測定和比較分析△

胡穎，徐鑫，a，張春陽，劉賽，徐常青，王占林，朱金忠，敖冬梅*，徐榮，4*

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；

2.北京城市學(xué)院，北京 100093；

3.寧夏中寧縣杞鑫枸杞種業(yè)有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100；

4.中國中藥協(xié)會 藥食同源物質(zhì)評價和利用專業(yè)委員會，北京 100061

枸杞子在中國的藥用和食用歷史已有2000 多年，現(xiàn)存最早藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中對其有“久服輕身不老”的評價[1]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥廣泛應(yīng)用的枸杞屬植物為多年生落葉灌木，主要有寧夏枸杞Lycium barbarumL.和中華枸杞L.chinenseMill（僅以根入藥）。寧夏枸杞的果實為中藥枸杞子的唯一來源，主要分布于我國寧夏、內(nèi)蒙古、青海、甘肅等干旱、半干旱地帶[1]。目前我國大部分的枸杞子栽培品種都來自寧夏地區(qū)培育的寧杞系列品種[2]。隨著寧杞系列品種的增加，需要對其進行全面比較，找到適宜不同用途的優(yōu)良品種。由于枸杞子果實陸續(xù)成熟，采收時間不同可能影響其成分的含量[3]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，枸杞子的加工方法除了傳統(tǒng)晾曬法，烘干、微波、凍干等方法也開始不斷應(yīng)用于枸杞子的產(chǎn)地加工。因此，不同品種枸杞適宜的采收期和加工方法同樣值得關(guān)注。

枸杞子除了作為傳統(tǒng)飲片，還是經(jīng)典方劑杞菊地黃丸、山東阿膠膏、定坤丹等的主要組分?！吨腥A人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020 年版中收錄的以枸杞子作為主要組分的方劑有近80 種[4]。近年來，隨著保健行業(yè)蓬勃發(fā)展及人民健康觀念的日益提高，枸杞子因其較高的營養(yǎng)價值和顯著的藥用功效、保健作用更加受到重視[5]，成為原衛(wèi)生部最早頒布的藥食同源品種之一。還可將枸杞子泡在酒里制作成藥酒或者泡在茶里飲用，具有養(yǎng)肝明目、降血糖、抗疲勞等作用[7]?？傊坭阶幼鳛樗幨惩粗兴幵絹碓绞艿角嗖A，已成為大多數(shù)人所認(rèn)可的高質(zhì)量營養(yǎng)保健品。多糖和甜菜堿是枸杞子的主要有效成分，并且作為《中國藥典》2020年版規(guī)定的含量測定項[6]，具有廣泛的藥理作用。多糖及甜菜堿含量是評價枸杞子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，對于枸杞子藥食同源的產(chǎn)品開發(fā)具有重要作用。因此，本研究比較分析了寧夏地區(qū)種植的不同品種枸杞子在2 種采收時間、加工方式下多糖及甜菜堿含量的變化。研究結(jié)果可為藥食同源品種篩選及適宜采收期和加工方式的選擇提供參考，同時可用于指導(dǎo)枸杞子質(zhì)量控制和不同品種枸杞子的合理采收及產(chǎn)地加工。

1 材料

1.1 試藥

無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號：S21J12Ⅰ138537，純度：98.0%）、對照品甜菜堿（批號：ML210215-03，純度：99.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；甜菜堿含量檢測試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，試劑盒中的試劑一為提取液、試劑二為乙醚、試劑三為丙酮、試劑四為活性炭）；苯酚、濃硫酸、石油醚、無水乙醇、無水甲醇、鹽酸、乙醚（北京化工廠，分析純）；水為純凈水。

枸杞子樣品均于2021年購自寧夏中寧縣杞鑫種業(yè)有限公司，經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所徐常青研究員鑒定為寧夏枸杞Lycium barbarumL.。具體品種、加工方式、采收時間見表1。其中自然晾曬干燥的枸杞子樣品晾曬于寧夏杞鑫種業(yè)有限公司（位于寧夏中寧縣），晾曬時間約為7 d，白天溫度為30～40 ℃，夜間溫度為20～30 ℃。烘干的枸杞子樣品進行鼓風(fēng)梯度干燥，第一階段35～45 ℃，第二階段50～55 ℃，第三階段55～60 ℃，烘干時間約為48 h。

表1 枸杞子品種、加工方式、采收時間

1.2 儀器

TD5A 型臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；BL6-180C 型超聲波清洗儀（北京佩萊生物技術(shù)有限公司）；DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；M1000型酶標(biāo)儀（帝肯實驗器材有限公司）；BJ-150 型粉碎機（慈溪市豪邁電器有限公司）；JOANLAB 型水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器設(shè)備廠）；十萬分之一分析天平（Mettler-Toledo公司）；Research plus型Eppendorf移液槍（艾本德中國有限公司）。

2 方法

2.1 多糖的含量測定

2.1.1對照品溶液制備 精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，加入適量水溶解，置于100 mL 量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1葡萄糖對照品溶液[3]。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確量取葡萄糖對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別至于具塞試管中，加入蒸餾水至2.0 mL。再加入5%苯酚試劑1 mL搖勻，再加入濃硫酸5 mL，搖勻，放置10 min后，置40 ℃水溫水浴中15 min，取出后迅速冷卻至室溫[8]。并使用酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=5.288 7X+0.104 9（r=0.995 3）。

2.1.3供試品溶液制備 隨機抽取1 組樣品，每份稱取100 mg，共9 份，置于離心管中。先加入石油醚5 mL，脫脂30 min，重復(fù)2 次，濾過，陰涼處揮去石油醚[9]。后加入95%乙醇5 mL，在65 ℃下超聲30 min，重復(fù)2次，置于80 ℃的水浴鍋中揮干[9]，按L9（34）正交設(shè)計進行超聲提取，因素水平見表2。5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為16 cm），分離上清液，所得濾渣重復(fù)上述操作。將2次所得上清液合并，濾過，定容至25 mL，吸取上述溶液1 mL定容至10 mL，得到對照品溶液。取待測多糖溶液1.0 mL于干凈試管中，按2.1.2項下方法處理后，在490 nm波長處測定吸光度值[9]，計算葡萄糖質(zhì)量濃度，并根據(jù)公式（1）計算樣品中多糖的含量。根據(jù)正交設(shè)計結(jié)果確定最佳提取工藝[9]。

表2 枸杞中多糖提取工藝的L9（34）因素水平

式中C為葡萄糖的質(zhì)量濃度，D為樣品稀釋倍數(shù)，V為樣品溶液總體積，m為樣品總質(zhì)量，f為校正因子。

2.1.4樣品測定方法 根據(jù)2.1.2、2.1.3項下方法測定樣品枸杞子中多糖含量。

2.1.5重復(fù)性試驗 同一供試品溶液，測定6 份平行樣品中的多糖含量，計算多糖含量平均值和RSD，確定該方法重復(fù)性是否良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗 同一供試品溶液，在180 min內(nèi)每隔30 min測定1次吸光度值，考察其穩(wěn)定性。

2.1.7精密度試驗 同一供試品溶液重復(fù)測定6次，測得吸光度值，計算RSD[10]，考察其精密度。

2.1.8加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的枸杞子樣品9 份，分別加入相應(yīng)對照品溶液，按2.1.2、

2.1.3項下方法，測定吸光度值，計算加樣回收率和RSD。

2.2 枸杞子中甜菜堿含量測定

2.2.1樣品測定方法 使用甜菜堿檢測試劑盒對枸杞子樣品進行甜菜堿含量的測定。測定原理為甜菜堿在強酸條件下和硫氰酸鉻銨（雷氏鹽）發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，沉淀用丙酮溶解形成紅色溶液，在525 nm 處有特征吸收峰，測定525 nm處的吸光度值，可計算樣品中甜菜堿含量。按照試劑盒操作說明，取枸杞子樣品200 mg 加入提取液1 mL（80%甲醇），提取溫度60 ℃、提取時間30 min進行超聲提取。加入試劑四后充分振蕩，離心后取上清液，在約70 ℃的金屬浴上揮至約0.2 mL，蒸餾水定容至1 mL。配制成質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的甜菜堿對照品溶液，依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為9、8、7、6、5、4、3、2 mg·mL-1的對照品系列溶液，以甜菜堿質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y=0.059 1X-0.127 8（r=0.995 4）。

在供試品溶液、對照品溶液、空白溶液（蒸餾水）試管中分別加入配制好的試劑一（雷氏鹽，臨用前配制，加入蒸餾水15 mL，用濃硫酸調(diào)節(jié)pH為1，攪拌45 min，濾過后定容至20 mL），充分混勻后冷藏于4 ℃中反應(yīng)120 min，離心后棄去上清液；再分別加入試劑二0.3 mL，離心后棄去上清液，通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)干凈后加入試劑三0.3 mL。點樣于96 孔板后，使用酶標(biāo)儀在525 nm 波長處進行測定。

2.2.2重復(fù)性試驗 同一供試品溶液，測定6 份平行樣品中的甜菜堿含量，計算甜菜堿含量平均值和RSD，確定該方法準(zhǔn)確性是否良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗 同一供試品溶液，在180 min內(nèi)每隔30 min測定1次吸光度值，考察其穩(wěn)定性。

2.2.4精密度試驗 同一供試品溶液重復(fù)測定6次，測得吸光度值，計算RSD[10]，考察其精密度。

2.2.5加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的枸杞子樣品9份，分別加入相應(yīng)對照品溶液，按2.2.1項下方法測定，測定吸光度值，計算加樣回收率和RSD。

2.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 2003 進行數(shù)據(jù)分析，再用SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)方差分析，對測得的枸杞子中多糖和甜菜堿含量數(shù)據(jù)進行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 多糖供試品溶液提取工藝考察結(jié)果

按照提取溫度、提取時間、料液比L9（34）正交設(shè)計方案進行提取，以多糖含量為評價指標(biāo)，優(yōu)化多糖供試品溶液制備方法（表3～4）。

表3 枸杞子中多糖超聲提取工藝正交試驗方案

表4 枸杞子中多糖提取工藝正交試驗方差分析

由正交試驗結(jié)果的極差分析可知，三因素對多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響程度為料液比＞提取溫度＞提取時間，其最佳組合為A2B1C3。

結(jié)合極差分析，綜合考慮實際提取情況，最佳組合仍然與極差分析結(jié)果一致為A2B1C3，即以提取溫度65 ℃、提取時間40 min、料液比1∶60。

3.2 多糖供試品溶液制備方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1精密度試驗 測得的吸光度值RSD 為0.15%，表明儀器的精密度良好。

3.2.2穩(wěn)定性試驗 結(jié)果所示，供試品溶液在180 min 內(nèi)吸光度值無明顯變化，RSD 為0.08%，表明溶液在180 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.3重復(fù)性試驗 同一批枸杞子樣品的RSD 為0.14%，表明方法重復(fù)性良好。

3.2.4加樣回收率試驗 結(jié)果見表5。

表5 枸杞子中多糖加樣回收率試驗結(jié)果

3.3 2種采收期不同品種的枸杞子中多糖含量比較

由圖1 可知，不同采收時間不同品種之間的多糖含量均存在差異，但規(guī)律不同，僅“寧杞10 號”品種2 個采收時間的多糖含量P為0.037，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，均為6 月20 日多糖含量更高，因此這個品種的采收時間宜選擇6 月份，避免因為采收時間不當(dāng)導(dǎo)致多糖含量降低，影響藥效。而“寧杞1 號”“寧杞4 號”“寧杞5 號”“寧杞7 號”則是以7 月20日樣品中多糖含量較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可以根據(jù)實際情況選擇采收時間。造成大多數(shù)品種以7 月20 日采收的多糖含量更高的原因，可能是7 月20 日在大暑節(jié)氣前后，這個時段日照時間長、降雨多，因而枸杞子中多糖含量相對較高。

圖1 2種采收期不同品種枸杞子的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（,n=5）

7 月20 日采集的不同品種的枸杞子多糖含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中“寧杞5 號”多糖含量最高，“寧杞10 號”多糖含量最低，與“寧杞4 號”“寧杞7 號”“寧杞5 號”差異有統(tǒng)計學(xué)意義。6 月20 日采集的不同品種的枸杞子多糖含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此未進行討論。

3.4 2 種加工方式下不同品種枸杞子多糖含量的差異比較

由圖2 可知，不同加工方式的枸杞子的多糖含量具有一定的差異，這與相關(guān)報道的干燥方式、干燥溫度及干燥時間對多糖含量變化影響顯著的研究結(jié)果基本一致[10-12]。其中，“寧杞1 號”“寧杞4 號”“寧杞5 號”不同加工方式的多糖含量差異相對較大，且都是以烘干方式的多糖含量較高。而“寧杞7 號”“寧杞0909 號”和“寧杞10 號”的不同加工方式的多糖含量以曬干的較多。但經(jīng)過SPSS 26.0數(shù)據(jù)比較后發(fā)現(xiàn)只有“寧杞1 號”和“寧杞4 號”的2 種加工方式多糖含量差異比較的P值分別為0.047 和0，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，因此“寧杞1 號”“寧杞4 號”和“寧杞5 號”宜選用烘干方式，其他品種可以根據(jù)實際情況選擇加工方式。造成該差異的原因可能是不同加工方式的枸杞子采用自然晾曬方式得到的樣品的加工時間為7 d，干燥速度較慢、時間較長，而采用烘干方式得到的樣品的加工時間為3 d，干燥速度較快，導(dǎo)致多糖轉(zhuǎn)化為其他單糖或其他成分的時間較少，因此多糖含量更高。

圖2 2種加工方式不同品種的枸杞子多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（,n=5）

烘干方式加工不同品種的枸杞子多糖含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中“寧杞4 號”多糖含量最高，“寧杞10號”多糖含量最低，且這2個品種的枸杞子均與其他品種差異有統(tǒng)計學(xué)意義。曬干方式加工不同品種的枸杞子多糖含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此未進行討論。

3.5 甜菜堿供試品溶液制備方法學(xué)考察結(jié)果

3.5.1精密度試驗 測得的吸光度值RSD 為0.23%，表明儀器的精密度良好。

3.5.2穩(wěn)定性試驗 樣品溶液在180 min 內(nèi)吸光度值無變化，RSD為0.13%，表明溶液在180 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.5.3重復(fù)性試驗 同一批枸杞子樣品的RSD 為0.21%，表明方法重復(fù)性良好。

3.5.4加樣回收率試驗 甜菜堿的加樣回收率為98.73%～102.71%，平均回收率為 100.60%，RSD為1.53%，見表6。

表6 甜菜堿加樣回收率試驗結(jié)果

3.6 2 個采收期不同品種枸杞子甜菜堿含量的差異比較分析

由圖3 可知，不同采收期的枸杞子甜菜堿含量具有一定差異，其中“寧杞1號”“寧杞4號”“寧杞5 號”“寧杞10 號”6 月20 日采收的樣品甜菜堿含量均高于7 月20 日采收的，這與王雪媛等[11]研究的肉蓯蓉中甜菜堿含量春季顯著高于秋季的變化趨勢一致。結(jié)果表明，不同采收期采集的“寧杞1 號”“寧杞4 號”的甜菜堿含量差異P值分別為0.02、0.035，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其他品種含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以甜菜堿含量為指標(biāo)比較不同采收期之間的差異，發(fā)現(xiàn)6 月20 日和7 月20 日采收的寧夏枸杞子中甜菜堿含量均是“寧杞10 號”含量最高。甜菜堿是抗性成分，說明“寧杞10 號”的環(huán)境適應(yīng)力最優(yōu)。

圖3 2個采收期不同品種的枸杞子的甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（,n=5）

7 月20 日采集的不同品種的枸杞子甜菜堿含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中“寧杞10 號”甜菜堿含量最高，“寧杞1 號”甜菜堿含量最低，“寧杞10 號”分別與“寧杞4 號”“寧杞5 號”“寧杞7 號”“寧杞0909 號”“寧杞1 號”差異有統(tǒng)計學(xué)意義。6 月20 日采集的不同品種的枸杞子甜菜堿含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故未進行討論。

3.7 2 種加工方式不同品種枸杞子甜菜堿含量的差異比較

由圖4 可知，不同加工方式的枸杞子甜菜堿含量具有一定差異，其中“寧杞4 號”烘干與曬干甜菜堿含量基本持平，“寧杞7號”“寧杞0909號”“寧杞10 號”曬干樣品甜菜堿含量均高于烘干樣品，這與王海等[12]研究的枸杞子在自然曬干條件下比燃煤烘干房烘干條件下甜菜堿含量高的結(jié)果一致。表明甜菜堿的含量受烘干方式影響較大，可能也與甜菜堿是一種堿性物質(zhì)，具有強烈的吸濕性能有關(guān)。

圖4 2種加工方式不同品種枸杞子的甜菜堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較（,n=5）

分析結(jié)果表明，“寧杞1號”“寧杞5號”和“寧杞0909號”在烘干和曬干2種方式下甜菜堿含量差異的P值分別為0.07、0.08、0.09，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其他品種差異無統(tǒng)計學(xué)意義。以甜菜堿含量為指標(biāo)比較不同加工方式之間的差異，發(fā)現(xiàn)烘干加工方式的枸杞子“寧杞5號”含量最高，自然晾曬干采收的枸杞子“寧杞10號”含量最高。與不同采收期結(jié)果相比，加工方式對樣品中的甜菜堿含量的影響更顯著。

烘干方式加工不同品種的枸杞子甜菜堿含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中“寧杞5 號”甜菜堿含量最高，“寧杞0909號”甜菜堿含量最低，且與“寧杞1號”“寧杞5號”和“寧杞10號”差異有統(tǒng)計學(xué)意義。曬干方式加工不同品種的枸杞子甜菜堿含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故不進行討論。

4 討論

多糖和甜菜堿是評價枸杞子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，同時對于枸杞子的食用口感有著至關(guān)重要的作用，在藥物與保健食品研發(fā)上的發(fā)展前景巨大。多糖含量高有利于藥食同源的產(chǎn)品開發(fā)，對于藥食同源產(chǎn)品的開發(fā)，選擇作為藥用的枸杞子其有效成分含量應(yīng)該更高，而食用枸杞的有效成分含量可以相對較低。不同品種和采收、加工方式均會影響多糖的含量。枸杞子的品種對枸杞子藥材品質(zhì)有一定的影響，但目前研究主要關(guān)注的是采收期、加工方式對枸杞子有效成分含量的影響，而對于品種的研究較少。但如今枸杞子藥材品種較多，除了“寧杞1 號”“寧杞5號”“寧杞7號”這些常用的品種，還有新選育出的“寧杞0909號”和“寧杞10號”等，值得投入時間對其品種間的含量變化及品質(zhì)差異進行深入研究，選出更適合不同用途的品種來滿足市場需求。

不同采收時間的枸杞子多糖及甜菜堿含量總體差異較小，僅“寧杞10 號”的多糖含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而“寧杞1號”“寧杞4號”的甜菜堿含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，均宜選用6月20日作為采收時間。不同加工方式枸杞子，多糖及甜菜堿含量均有一定差異，其中“寧杞4號”“寧杞1號”的多糖含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而“寧杞1 號”“寧杞5 號”和“寧杞0909 號”的甜菜堿含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義，除“寧杞0909號”以外，均宜選用烘干方式。結(jié)果顯示，7月份采收及烘干方式加工的“寧杞10 號”多糖含量均顯著低于“寧杞4 號”“寧杞7 號”“寧杞5 號”，“寧杞1號”和“寧杞4號”多糖含量最高，食用效果較佳。7 月份采收以及烘干方式加工的“寧杞1 號”及“寧杞4號”甜菜堿含量均顯著低于“寧杞10號”“寧杞7號”和“寧杞5號”，“寧杞10號”及“寧杞5號”甜菜堿含量最高，藥用效果較佳。

綜上所述，本研究比較不同品種、加工方式、采收時間的枸杞子中多糖及甜菜堿含量的變化情況，為枸杞子不同用途適宜品種及其采收期和加工方式的選擇提供了參考。