不同溫度下蝶豆的生理生化響應

林雪燕，侯健，金睿哲，薛秋華*

（1福建農林大學園林學院，福建福州 350002；2福建農林大學國際學院，福建福州 350002）

蝶豆（Clitoria ternatea）又名藍蝴蝶、蝴蝶花、藍花豆，為蝶形花科（Papilionaceae）蝶豆屬（Clitoria）植物，原產于印度、印度尼西亞、泰國、越南等熱帶、亞熱帶國家，在我國廣東、廣西、海南、香港、臺灣等地有栽培[1，2]。蝶豆的各個器官均可利用，具有較高的藥用、食用、觀賞和經濟價值，其為傳統(tǒng)藥用植物，其花朵提取物具有抗氧化、抗溶血、抗高血壓等藥理活性[3]，根提取物可抗抑郁和潛在治療認知功能下降[4]；蝶豆花朵含有豐富的水溶性花青素和維生素，其花瓣含有的酚類成分在不同的pH 下可使飲品、糕點調制不同的顏色，是天然的植物染料，可作為綠色功能性保健食品開發(fā)[5]；其花朵提取的香料可用于卷煙加香[6]；常作為飼料牧草種種植[7-8]；其對狗牙根、馬唐、白花鬼針草的萌發(fā)有抑制作用，可作為果園雜草防治植物[9]；作為多年生的藤蔓植物被運用在吊盆、垂直綠化上，可快速營造拱門、廊架等園林景觀。

溫度是影響植物生長的主要環(huán)境因子之一，高溫或低溫均可影響植物生長發(fā)育，在全球氣候變化的大背景下，極端天氣頻繁發(fā)生，冬春低溫寒害、夏季極端高溫熱害影響植物生長，嚴重時引起死亡，給農業(yè)生產造成損失[10-11]。植物會發(fā)生一系列生理生化變化以適應溫度變化：抗氧化防御系統(tǒng)中的SOD、POD、CAT 能夠清除活性氧自由基，減輕或者避免膜損傷；當溫度超過植物生長所能忍耐的溫度時，植物細胞產生的活性氧會加劇膜脂過氧化反應，增加的自由基破壞超氧化物酶系統(tǒng)，積累過氧化產物如MDA，植物通過滲透調節(jié)物質、光合色素含量變化來調控相關的代謝途徑從而降低或消除脅迫的影響[12]。蔡月琴等[13]利用光照培養(yǎng)箱控制溫度以研究溫度脅迫下寶蓮燈（Medinilla magnifica）生理變化，高溫下其CAT 活性、相對電導率及MDA、可溶性蛋白、Pro 含量增加，SOD、POD 活性呈下降趨勢；低溫下其MDA、Pro 含量隨溫度下降而上升，SOD、POD 活性顯著降低。蔣瑤等[14]研究表明野生湖北百合（Lilium brownii）隨著溫度升高，其MDA 含量上升，相對電導率增加，可溶性糖和Pro 含量升高，CAT 活性先升高后下降。金花茶組植物（Camellia petelotii）在溫度下降過程中其相對電導率和溫度呈負相關，其MDA、可溶性糖和Pro 含量均先上升后下降[15]。可見，不同植物的生理指標對于溫度變化的響應不一致，學者對于植物的生理變化的測量指標較為相似。

國內對蝶豆的研究主要集中在蝶豆的形態(tài)描述[7]、繁殖栽培技術[1，2，16]、蝶豆花提取的工藝[6]上，關于其對溫度變化的生理生化響應尚未見報道。本研究以盆栽蝶豆幼苗作為研究對象，利用智能光照培養(yǎng)箱控制溫度，探明蝶豆內部生理生化對溫度的響應，為蝶豆的推廣與應用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為蝶豆苗。種子于2020 年11 月采集于廣東江門香草小鎮(zhèn)。選擇大小一致、飽滿健康的種子于2021 年2 月17 日溫湯浸種催芽，種子萌發(fā)后播種至32 孔穴盤中（泥炭∶蛭石=3∶1），待長至2 片真葉時，選擇長勢一致的幼苗移栽到塑料盆（上口徑17 cm，下口徑13 cm，高16 cm），種植基質體積配比為菇渣∶園土∶蛭石=1∶1∶1。期間在福建農林大學園林學院下安實驗樓天臺進行露天栽培管理。

1.2 試驗設計

于2021 年5 月選擇長勢一致（株高為20～25 cm，莖粗3.5～4.0 mm，葉片10～15 片）、生長健壯的蝶豆轉入智能光照培養(yǎng)箱（25℃/20℃，12 h/12 h）預處理1 d 后進行溫度梯度處理，以25℃（CK）作為對照組，試驗溫度設置：2℃、5℃、10℃、15℃、30℃、35℃、40℃、45℃，溫度處理8 h 后取樣。本試驗使用光照智能培養(yǎng)箱來控制其他環(huán)境對結果的干擾，處理過程光照培養(yǎng)箱相對濕度為60%，光照強度為3000 Lux。每個處理3 個重復。

1.3 指標測定

觀察記錄蝶豆在不同溫度下的葉片形態(tài)變化。

測定植物生理生化指標：在不同溫度處理后采集植株的頂芽以下第2～5 片葉子裁剪、稱量0.2 g于自封袋，迅速放置在液氮中冷凍，并保存在-80℃冰箱中，統(tǒng)一測定生理生化指標。生理生化指標測定的方法參考《植物生理生化實驗原理和技術》[17]，所有處理指標均重復測定3 次。氮藍四唑法測定超氧化物酶（Superoxide dismutase，SOD）活性；紫外吸收法測定過氧化氫酶（Peroxidase，CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性；硫代巴比妥酸法測定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量；電導率法測定細胞膜透性（Cell membrane permeability，CMP）；蒽酮比色法測定可溶性糖（Soluble sugar，SS）含量；考馬斯亮藍G-250 法測定可溶性蛋白（Soluble protein，SP）含量；酸性茚三酮染色法測定脯氨酸（Proline，Pro）含量；乙醇浸提法測量葉綠素a（Chlorophylla，Chla）含量、葉綠素b（Chlorophyll b，Chlb）含量、葉綠素總含量（Chlorophyll content，Chla+b）、類胡蘿卜素（Carotenoid，Car）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)整理和制圖使用Excel 2016 軟件。使用SPSS 20.0 分別對蝶豆溫度梯度下不同的生理指標進行單因素方差分析（One-way ANOVA），多重比較采用Duncan 法，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 蝶豆葉片形態(tài)觀察

蝶豆在不同溫度下葉片形態(tài)有發(fā)生變化，在10～40℃時葉片形態(tài)表現(xiàn)正常，無明顯變化。低溫5℃脅迫下，頂端嫩梢下垂，葉片完好；低溫2℃下，頂端嫩梢下垂，嫩葉閉合，放置室溫環(huán)境下快速恢復。高溫45℃下，蝶豆嫩梢下垂，葉片無閉合，生長較為完好。

2.2 不同溫度梯度下蝶豆保護酶活性的變化

如圖1 所示，在低溫或高溫處理下，蝶豆SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當溫度從25℃降至15℃時，SOD 活性顯著上升（P＜0.05），15℃處理下的SOD 活性最高，為25℃的1.5 倍。溫度從25℃升高至40℃時，蝶豆的SOD 活性顯著上升（P＜0.05），40℃處理下的SOD 活性有最大值，是25℃的1.5 倍，45℃蝶豆的SOD 活性下降。各試驗組的SOD 活性均高于CK 值，且均具有顯著差異（P＜0.05）。以上結果表明，蝶豆SOD 活性的低溫、高溫抑制溫度分別為15℃和40℃。

圖1 不同溫度下蝶豆的SOD 活性

如圖2 所示，隨著溫度降低或升高，CAT 活性先下降后上升，15℃處理下的CAT 活性為CK 的42.2%，具顯著差異，15℃下降至5℃的CAT 活性變化平緩（P＞0.05），溫度從5℃降至2℃時CAT 活性顯著上升，為CK 的1.3 倍。溫度上升引起CAT酶活性變化，30℃處理下CAT 活性最小，45℃下的活性最大，為CK 的1.5 倍。

圖2 不同溫度下蝶豆的CAT 活性

如圖3 所示，隨著溫度降低，蝶豆葉片的POD活性呈先下降后上升趨勢；5℃下的POD 活性最低，為CK 值的46.6%。隨著溫度上升，POD 呈先下降后上升的趨勢，30℃下的POD 酶活性最低，為CK的60.4%。各梯度溫度處理下的蝶豆POD 活性均比CK 的低。

圖3 不同溫度下蝶豆的POD 活性

2.3 不同溫度梯度下蝶豆葉片MDA 含量和相對電導率的變化

如圖4 所示，溫度下降時MDA 含量呈現(xiàn)先升高后微下降趨勢；在5℃下MDA 含量為最大值，為CK 的1.7 倍，2℃、5℃處理無顯著差異（P＞0.05）。隨著溫度上升，MDA 含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，在40℃為最小值；當溫度從40℃變化至45℃時，MDA 含量迅速上升至CK 值的1.2倍（P＜0.05）。蝶豆生長適應為15～40℃。

圖4 不同溫度下蝶豆的MDA 含量

如圖5 所示，隨著溫度降低，細胞膜透性先降低后增加，在15℃有最小值，為CK 的76.2%；溫度從10℃降到5℃細胞膜傷害程度變化最大，增幅至CK 的1.4 倍，2℃的細胞膜透性為CK 的1.4 倍，與5℃的差異不顯著（P＞0.05）。隨著溫度升高，蝶豆葉片細胞膜透性先降低后升高，在40℃有最小值，細胞傷害最小，為CK 的63.2%；45℃有最大值，細胞傷害最大，細胞膜透性為CK 的2.4 倍。上述結果表明，低溫5℃低溫處理對蝶豆細胞膜產生顯著影響（P＜0.05），45℃高溫處理葉片膜系統(tǒng)損傷最大。

圖5 不同溫度下蝶豆的細胞膜透性

2.4 不同溫度梯度下蝶豆?jié)B透調節(jié)物質含量變化

如圖6 所示，低溫下蝶豆的可溶性糖含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在10℃達到最大值，為CK 的1.2 倍；溫度下降至5℃時，可溶性糖含量顯著下降（P＜0.05），2℃和5℃的可溶性糖含量相等，是CK值的1.1 倍。高溫下，蝶豆的可溶性糖含量變化趨勢同為先上升后下降，30℃下的可溶性糖含量是CK 的1.04 倍；35℃、40℃的可溶性糖含量比CK值高；45℃下的可溶性糖含量顯著下降至CK 值的0.7 倍。

圖6 不同溫度下蝶豆的可溶性糖含量

如圖7 所示，隨著溫度下降，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢?？扇苄缘鞍字岛吭?5℃有最大值，其含量是CK 的1.1 倍（P＞0.05），隨后下降。隨著溫度上升，可溶性蛋白呈先下降后上升趨勢，30℃可溶性蛋白含量顯著下降，隨后上升，45℃的可溶性蛋白為CK 值的1.2 倍。

圖7 不同溫度下蝶豆的可溶性蛋白含量

如圖8 所示，隨著溫度降低，蝶豆的Pro 含量先上升后下降再上升。溫度開始降低時，Pro 含量緩慢上升，10℃處理下Pro 迅速上升至CK 的2 倍含量，隨后在低溫5℃下Pro 含量降低至CK 的0.8倍，2℃又上升至CK 的1.4 倍。隨著溫度升高，Pro 含量變化趨勢與低溫下的大體一致，第一個溫度梯度下，Pro 含量上升緩慢，至35℃時，Pro 含量上升至CK 的2.3 倍，隨后在40℃Pro 含量顯著下降，45℃下Pro 含量又上升至CK 的1.5 倍。

圖8 不同溫度下蝶豆的Pro 含量

2.5 不同溫度梯度下蝶豆光合色素含量變化

如表1 所示，溫度下降時蝶豆的Chla、Chlb、Chla+b 呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，在15℃有最小值，分別與CK 相差0.16 mg/g，0.45 mg/g，0.62 mg/g；類胡蘿卜素呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在5℃有最大值，為CK 的1.4 倍。隨著溫度升高，4 個指標變化趨勢均為波浪形變化，均在30℃下降至最小值，Chla、Chlb、Chla+b 在35℃上升至最大值，隨后下降。5℃、2℃的4 種光合色素含量均較CK 的大，35℃及以上溫度的4 種光合色素總體較CK 的大。

表1 不同溫度下蝶豆的光合色素

3 討論與結論

3.1 討論

3.1.1 不同溫度梯度下蝶豆保護酶活性的變化

植物在遭受逆境時會產生活性氧，自由基含量過多會影響細胞的正常生命活動，需要通過抗氧化防御系統(tǒng)清除[18]。SOD、CAT、POD 是植物體內的抗氧化防御系統(tǒng)的主要抗氧化酶，三者之間具有協(xié)同作用，能夠有效地清除活性氧自由基，減輕或避免活性氧對脂膜的攻擊，防止膜損傷[19]。SOD是植物抗氧化的第一道防線，能夠保護細胞免受超氧化物誘導的氧化脅迫[18]，SOD 活性升高通常能夠說明植物對逆境具有耐受性。溫度降低或升高時，蝶豆通過SOD 含量升高消除超氧化物，減輕膜脂過氧化對植物的傷害，當溫度持續(xù)地降低或者升高超過了蝶豆所能承受的極限時，SOD 表達被抑制，酶活性下降[18]。低溫下蝶豆SOD 變化趨勢與桃樹（Prunus persica）[20]花朵和衛(wèi)矛屬（Euonymus）植物[12]變化趨勢一致；高溫下蝶豆SOD 變化趨勢與鹿角杜鵑（Rhododendron latoucheae）[21]研究結果一致。溫度降低或升高，蝶豆CAT 活性均呈先下降后顯著升高趨勢，可能原因是在溫度變化初期蝶豆未受到脅迫，其CAT 敏感度較低，極端溫度激發(fā)CAT 活性增強來清除過剩的活性氧，從而保護細胞，增強植物的抗逆性[22]。POD 普遍存在于植物中，是植物細胞內活性較高的適應性酶，與植物的呼吸作用、光合作用等密切相關，能夠反應植物生長發(fā)育特點、體內代謝狀況及對外界環(huán)境的適應性[18]。正常情況下隨著溫度下降或升高其變化趨勢為先升高后下降、直線下降或先下降后上升[22，23]。在28～43℃的短期高溫脅迫下，野生湖北百合的POD 活性呈現(xiàn)先下降后上升趨勢[14]，本研究中蝶豆的POD 活性在25～45℃內的趨勢與其一致。湖北野生百合在部分溫度下的POD 活性超過對照組[14]，本試驗POD 活性均弱于對照組，原因可能是由于不同植物在遭受高溫脅迫時的反應機制不一致，還需從分子生物學和遺傳學方向上解釋。

本試驗中，當試驗溫度從CK 降至15℃時，蝶豆的SOD 活性升高，CAT、POD 活性降低，此時抗氧化防御系統(tǒng)主要由SOD 參與反應；溫度從15℃降低至5℃時，SOD、POD 活性均下降，植物中心為保持代謝正常，CAT 活性升高，但是CAT活性弱于對照組，此溫度區(qū)間主要由SOD 參與調節(jié)；在5℃降低至2℃時，雖然POD 活性顯著增強（P＞0.05），但是活性依舊小于CK 值，此溫度區(qū)間主要依靠增強CAT 活性消除過氧化產物來適應低溫脅迫。在25～30℃之間，溫度升高初期SOD 主要參與抗氧化反應；在30～40℃之間，雖然三者活性均增強，但POD、CAT 活性小于對照組，此溫度區(qū)間主要依靠增強SOD 來適應溫度升高的變化；當溫度升高至45℃時，僅CAT 活性增強，CAT 主要參與極端高溫的抗氧化反應。

3.1.2 不同溫度梯度下蝶豆葉片MDA 含量和細胞膜透性的變化

植物受到溫度脅迫后，植物產生活性氧自由基進而產生過氧化產物，MDA 為過氧化產物之一。MDA 能夠與蛋白質或核酸等形成聚合物破壞細胞膜，細胞內的電解質因為細胞膜透性增大而外滲，表現(xiàn)在可測量的相對電導率上[12，23]。

研究表明，低溫下金花茶組植物[15]、紅果風鈴木（Handroanthus chrysotrichus）[24]、衛(wèi)矛屬[12]植物的MDA 含量呈先上升后下降趨勢。本研究也得出類似結果：當處理溫度從CK 降至15℃時，蝶豆MDA 含量上升，此時葉片開始有過氧化產物產生，蝶豆對降溫處于適應階段；隨著溫度下降，植物葉片細胞膜遭受了膜脂過氧化，10℃下蝶豆葉片MDA 含量顯著升高，蝶豆過氧化物開始積累，葉片質膜受損；在2℃時MDA 含量些許下降，蝶豆表現(xiàn)出一定的抗性，可能是滲透調節(jié)物質的參與保護葉片，減緩了MDA 的生成。在25～40℃之間，MDA 含量降低，說明蝶豆適應此區(qū)間溫度，能夠忍耐40℃高溫；但是這種忍耐限度也是有限的，在45℃處理下，蝶豆的MDA 含量驟升，蝶豆幼苗不能適應45℃高溫。劉敏和房玉林[25]研究葡萄‘赤霞珠’（Vitis vinifera‘Cabernet Sauvi gnon’）在25～45℃溫度下細胞膜透性呈先下降后上升趨勢，在40℃有最小值，本試驗高溫下蝶豆細胞膜透性變化趨勢與其一致。

蝶豆在不同溫度梯度下的細胞膜透性的變化趨勢與MDA 含量的變化趨勢總體一致。低溫下，10℃下MDA 含量開始積累，5℃下細胞膜透性開始增大，隨著抗寒機制的啟動，2℃下MDA 含量些許下降，蝶豆對低溫具有一定的抵抗能力。40℃下的MDA 含量和細胞膜透性都降到最小，蝶豆能夠忍耐40℃高溫，可能與蝶豆的原產地有關；蝶豆在45℃處理下的過氧化產物積累，細胞膜被破壞，細胞膜透性顯著升高。許多研究表明植物不能耐受45℃的高溫[23]，低溫脅迫對蝶豆葉片的傷害顯著強于高溫脅迫。

3.1.3 不同溫度梯度下蝶豆?jié)B透調節(jié)物質含量的變化

植物受到低溫脅迫會增加可溶性糖含量[26]，當溫度降溫至10℃，蝶豆葉片增加可溶性糖含量來適應降溫，10℃下蝶豆雖然不能通過增加可溶性糖含量來抵御降溫，但其含量能夠維持在比CK 高的水平以緩解低溫對膜系統(tǒng)的傷害；低溫下的蝶豆的可溶性糖變化趨勢與金花茶組植物的變化趨勢較為一致[15]。蝶豆通過可溶性糖積累來適應溫度升高，45℃下蝶豆的可溶性糖含量顯著下降，蝶豆不能再積累可溶性糖來降低細胞滲透勢，緩解高溫危害?？扇苄缘鞍资欠从持参锟购缘闹匾笜酥?，許多植物在低溫下的可溶性蛋白含量升高[22]，本試驗蝶豆的可溶性蛋白含量隨著溫度降低呈先上升后下降趨勢，可能是不同植物在低溫下可溶性蛋白的表達形式不一致導致的。高溫下蝶豆的可溶性蛋白呈先下降后上升趨勢，蝶豆在極端高溫高溫45℃下能夠增加可溶性蛋白含量來調節(jié)滲透平衡。Pro 在遭受逆境時會大量積累，研究人員對植物Pro 含量與溫度變化關系持有兩種觀點：一種認為Pro 含量與溫度變化無關，一種認為Pro 含量會隨著溫度降低或升高而上升[24]。溫度從CK 降低至15℃時，蝶豆Pro 無明顯變化，10℃下Pro 含量躍升，說明10℃是蝶豆低溫脅迫初始溫度。高溫35℃下Pro 含量顯著增加，蝶豆迅速積累Pro 以維持35℃下的滲透平衡，減輕逆境傷害；40℃下Pro 含量降低，由于蝶豆本身對高溫具有一定的適應能力，所以Pro 含量下降，45℃其含量上升減輕極端高溫傷害。

桃樹花朵在低溫下的可溶性糖和可溶性蛋白先升高后下降[20]，Pro 含量先上升后下降再上升，低溫下蝶豆3 種滲透調節(jié)物質的變化規(guī)律與其研究結果一致。溫度從CK 升至30℃時，可溶性糖為主要滲透調節(jié)物質；35℃下Pro 主要參與滲透調節(jié)反應；在40～45℃極端高溫下，蝶豆可溶性蛋白、Pro 含量升高來增強細胞滲透調節(jié)能力，抵抗高溫。

3.1.4 不同溫度梯度下蝶豆光合色素含量的變化

葉綠素是植物進行光合作用場所，起捕獲光能、吸收光能的作用，是葉片生理活性變化、光合機能大小有關的指標[15，26]。本研究中蝶豆的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量并無持續(xù)下降，低溫下的蝶豆通過提高葉綠素含量來提高蝶豆的代謝能力?？赡芤驗榈蜏叵碌沟娜~綠素生物合成酶不受限制。前人研究表明葉綠素含量會隨溫度下降而降低，低溫下蝶豆葉綠素變化趨勢不一致的具體原因還需從分子機制進一步研究說明。本研究4 種光合色素含量均在35℃有最大值，隨后4 種光合色素含量下降，總體較CK 的高，說明溫度升高并不減少蝶豆葉綠素合成，其光合色素會出現(xiàn)短暫的上升現(xiàn)象。

3.2 結論

蝶豆幼苗對環(huán)境中溫度變化較為敏感，能夠通過自身調節(jié)適應溫度的變化，減輕溫度脅迫造成的傷害。植物對溫度變化受多方面影響，本研究將形態(tài)觀察與生理生化指標相結合了解蝶豆對不同溫度梯度的響應，初步認定蝶豆的最適生長溫度為15～40℃，蝶豆適應短期2～5℃的低溫處理。綜合分析結論如下：短期的重度低溫和高溫均會對顯著抑制蝶豆的生長，蝶豆在低溫5℃以下會出現(xiàn)嫩梢下垂、葉片閉合現(xiàn)象，高溫45℃出現(xiàn)嫩梢下垂現(xiàn)象，蝶豆對低溫反應較高溫的敏感。溫度在5～40℃期間時，SOD 是清理超氧化物的主要抗氧化酶，低溫2℃、高溫45℃下CAT 為主要的抗氧化酶，SOD、CAT 可作為溫度變化下蝶豆的關鍵抗氧化指標。10℃開始蝶豆已有過氧化物產生，低溫5℃下蝶豆細胞膜開始受損，蝶豆能夠忍耐40℃高溫，45℃下蝶豆的細胞膜被破壞。蝶豆通過調節(jié)可溶性糖、可溶性蛋白、Pro 等共同作用，降低或消除溫度變化對自身的傷害，并增加光合色素含量來提高代謝能力。試驗中，低溫下SOD、MDA、細胞膜透性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量變化趨勢表現(xiàn)出了較好的一致性；高溫下CAT、POD、MDA、細胞膜透性、可溶性蛋白含量表現(xiàn)出了較好的一致性，試驗結果較為可靠。