根管治療失敗患者感染微生態(tài)研究

杜琛

（陽谷縣人民醫(yī)院口腔科，山東 聊城 252300）

慢性根尖周炎是由根管內(nèi)長期存在的感染疾病源刺激物而導(dǎo)致的局限于根尖周圍組織的慢性炎癥，嚴(yán)重影響患者身心健康[1]。根管治療為治療慢性根尖周炎的有效手段，可通過清除根管內(nèi)壞死組織、去除不良刺激，達(dá)到緩解疼痛、促進(jìn)根尖周病變愈合的目的。有研究表明，對于慢性根尖周炎患者，無論是一次性還是多次根管治療均具有較高的治療有效率，可達(dá)85%以上[2]。但有文獻(xiàn)[3]報(bào)道，經(jīng)完整且規(guī)范的根管治療后，仍有4%～15%患者可出現(xiàn)根尖周病變愈合不佳或出現(xiàn)新的根尖病變；同時(shí)，有研究表明，根管再治療2 年后的成功率僅為72%[4]。目前根管內(nèi)持續(xù)感染狀態(tài)被認(rèn)為是導(dǎo)致根管治療失敗的主要原因[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，慢性根尖周炎患者牙根尖外表面存在豐富的根管生物膜結(jié)構(gòu)，而根管治療后根管生物膜的形成有可能是導(dǎo)致根管治療失敗的主要原因[6]。目前，國內(nèi)外對根尖周病損組織中菌群構(gòu)成和優(yōu)勢菌、根尖外表面根管生物膜來源和組成研究較少?；诖?，本研究旨在觀察未治療和根管治療失敗慢性根尖周炎患者根尖周病損組織菌群構(gòu)成和根管內(nèi)壁及根外生物膜超微結(jié)構(gòu)，以期為臨床治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取 2018 年 4 月至 2019 年 4 月本院牙體牙髓科收治的未經(jīng)治療和根管治療失敗的慢性根尖周炎患者40例，分為未經(jīng)治療組和治療失敗組，各20例。未經(jīng)治療組男12例，女8例；年齡24～43 歲，平均年齡（34.14±6.43）歲；單根管14 例，雙根管6 例；患牙部位：中切牙12 例，側(cè)切牙8 例。治療失敗組男 13 例，女 7 例；年齡 25～45 歲，平均年齡（34.21±6.48）歲；單根管13 例，雙根管7 例；患牙部位：中切牙13 例，側(cè)切牙7 例。兩組患者臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 未經(jīng)治療組：年齡18～45 歲；符合牙髓感染所致慢性根尖周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；X線顯示根尖周存在骨質(zhì)破壞區(qū)；不適宜行根管治療而行拔牙術(shù)者。治療失敗組：年齡18～45 歲；符合牙髓感染所致的慢性根尖周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)根管治療后1年，X線顯示根尖周仍存在骨質(zhì)破壞區(qū)；未達(dá)到根管治療成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 探診深度≥3 mm；治療前3 個(gè)月內(nèi)使用抗生素；既往有根管、牙髓、牙體治療史；牙頸部以下牙根不完整；牙竇道形成；依從性差。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集 ①根尖周病損組織：患牙拔除后，利用無菌刮匙刮取牙窩內(nèi)根尖周病損組織，以無菌的0.9%氯化鈉溶液沖洗，置于含1 ml 的TE 緩沖液（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：T1120，pH=8.0）的EP管內(nèi)，-80 ℃保存?zhèn)溆?。②根尖片段：患牙拔除后，利用無菌的0.9%氯化鈉溶液沖洗患牙及其附著的根尖組織，置于4%中性甲醛組織固定液中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 根尖周病損組織菌群構(gòu)成 ①細(xì)菌DNA提取：取根尖周病損組織，解凍后加入無菌的0.9%氯化鈉溶液，高速混懸1 min，制成細(xì)菌混懸液，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：D1600）提取細(xì)菌DNA。②PCR擴(kuò)增：細(xì)菌通用引物序列：上游引物27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物1429R：5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇，擴(kuò)增片段長度為1 400 bp。反應(yīng)體系：細(xì)菌基因組DNA模板3 μl，上下游引物各0.5 μl，dNTP 混合液（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：SV0989）4 μl，10×EX Taq Buffer（北京麥瑞博生物科技有限公司，貨號9152A）5 μl，EXTaq酶（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，貨號RR001）0.5 μl，單蒸水36.5 μl，總體積50 μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，置于1%瓊脂糖凝膠中電泳，切取1.5 kb目的產(chǎn)物，利用膠回收/DNA純化試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號：DC301）回收和純化。③16S rDNA克隆文庫構(gòu)建：利用快速DNA連接試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號：D7002）將純化的PCR產(chǎn)物連接至pGEM-T載體（上海澤葉生物科技有限公司，貨號：ZY3600）上，連接反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2 μl，pGEM-T載體1 μl，單蒸水2 μl，Rapid T4 DNA ligase 5 μl，16 ℃反應(yīng)2 h。將連接pGEM-T載體的PCR產(chǎn)物克隆至DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化科技有限公司，貨號：CB101），置于含1.6 pg/mL X-gal、1.8 pg/ml IPTG和50 pg/ml AMP的LB平板培養(yǎng)基（北京天恩澤生物技術(shù)有限公司，貨號：130848B）中，37 ℃過夜培養(yǎng)；每個(gè)平板均采用藍(lán)白斑篩選法隨機(jī)選取80個(gè)白斑，不足80個(gè)的以平板中全部白斑計(jì)數(shù)。④細(xì)菌重組質(zhì)粒測序：由大連寶生物公司完成，引物為27F，單向測序，可疑新菌種或新基因型需加測1429R和907R引物序列；利用Sequencer 4.8軟件去除測序峰圖的雜峰序列后，截取長度為600 bp的序列，對比GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，將相似度≥98%定義為基因庫菌種相同，記錄相似性和分值最高的菌種名稱。

1.4.3 根尖片段掃描電鏡分析 取根尖片段，利用金剛砂沿牙縱軸打磨一凹槽，凹槽處利用骨鑿將牙劈為兩等份；任取其中一份，PBS 溶液沖洗3 次，每次5 min，置于1%四氧化鋨溶液中，4 ℃固定1 h；PBS溶液沖洗3次，每次5 min，分別置于50%、70%、80%、90%、100%乙醇溶液中浸泡10 min；置于六甲基二硅胺烷溶液中反復(fù)浸泡3次，每次10 min；利用全自動(dòng)臨界點(diǎn)干燥儀（德國Leica 公司，型號：EM CPD300）干燥處理，離子濺射儀（北京中科科儀股份有限公司，型號：SBC-12）噴鍍后，掃描電鏡（日本日立公司，型號：S-4800）下定位根尖孔（低倍鏡），選定根管生物膜可疑區(qū)域，觀察超微結(jié)構(gòu)（高倍鏡）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組根尖周病損組織中G+菌和G-菌構(gòu)成情況比較 兩組根尖周病損組織G-菌檢出率和克隆比均高于G+菌（P＜0.05）；兩組根尖周病損組織G+菌和G-菌檢出率和克隆比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 兩組根尖周病損組織中G+菌和G-菌構(gòu)成情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of composition of G+and G-bacteria in periapical lesions between the two groups[n(%)]

2.2 兩組根尖周病損組織中菌種檢出情況比較 未經(jīng)治療組根尖周病損組織共得到1 478個(gè)16S rDNA序列，鑒定出163個(gè)菌種，具有較高檢出率的菌種從高到低依次為具核梭桿菌（Fusobaeterium nueleatum）、隱蔽小桿菌（Dialister invisus）、纖細(xì)彎曲桿菌（Campylobacter gracilis）、輕型鏈球菌（Streptococcus mitis）；治療失敗組根尖周病損組織共得到1 476個(gè)16S rDNA序列，鑒定出103個(gè)菌種，具有較高檢出率的菌種從高到低依次為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、惰性嗜血桿菌（Haemophilus segnis）、纖細(xì)彎曲桿菌（Campylobacter gracilis）、具核梭桿菌（Fusobaeterium nueleatum）、隱蔽小桿菌（Dialister invisus），見表2。

2.3 兩組根管內(nèi)根管生物膜性狀 未經(jīng)治療組中，有4 例根尖孔周圍見骨質(zhì)陷窩，陷窩內(nèi)有根管生物膜存在，主要由球菌組成，其他16 例僅有少量牙骨質(zhì)吸收，未見根管生物膜形成。治療失敗組中牙根尖外表面均可見不同程度的牙骨質(zhì)吸收，根管內(nèi)壁有呈間斷島狀或分布連續(xù)片狀分布的根管生物膜存在，主要由球菌或桿菌組成，見圖1。

圖1 兩組根管內(nèi)根管生物膜性狀掃描電鏡分析Figure 1 Analysis of biomebrane characters by scanning electron microscope

3 討論

根管治療是治療慢性根尖周炎的有效手段之一[7]。研究表明，根管治療可使牙髓和根尖周類疾病患者獲得較好的近遠(yuǎn)期療效[8]。但有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，經(jīng)反復(fù)多次常規(guī)根管治療后，仍有4%～15%的病例無法徹底清除根尖周病變，表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性根尖周膿腫和進(jìn)行性骨質(zhì)破壞，嚴(yán)重者可致牙槽骨缺損和牙喪失，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。有研究表明，未經(jīng)治療和根管治療失敗的慢性根尖周炎根管內(nèi)細(xì)菌菌叢存在明顯差異，不同種屬細(xì)菌的聯(lián)合作用可能是導(dǎo)致根管治療失敗的主要原因[10]。生物膜是細(xì)菌生存的主要環(huán)境，不僅可為細(xì)菌生長繁殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，還可增加其致病作用[11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，根管治療后的患牙可因無血供形成根管生物膜，根管生物膜耐藥性較強(qiáng)且抵抗宿主免疫進(jìn)攻能力較好，可影響根管治療效果[12]。

研究表明，持續(xù)性根尖周炎存在根管外感染，部位包括根尖生物膜和根尖周組織[13]。本研究結(jié)果顯示，兩組根尖周病損組織G-菌檢出率和克隆比均高于G+菌，提示未經(jīng)治療和根管治療失敗患者根尖周病損組織細(xì)菌定植均以G-為主，與以往研究結(jié)果一致[14]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，兩組在優(yōu)勢菌構(gòu)成上存在一定差異，未經(jīng)治療組根尖周病損組織具有較高檢出率的菌種從高到低依次為具核梭桿菌、隱蔽小桿菌、纖細(xì)彎曲桿菌、輕型鏈球菌，與黃燕華等[10]報(bào)道的根尖周炎根管尖段細(xì)菌檢出率從高到低依次為中間普氏菌、牙髓卟啉單胞菌、具核梭桿菌和糞腸球菌的結(jié)果類似。治療失敗組根尖周病損組織具有較高檢出率的菌種從高到低依次為糞腸球菌、惰性嗜血桿菌、纖細(xì)彎曲桿菌、具核梭桿菌、隱蔽小桿菌，與黃燕華等[10]報(bào)道的根管治療失敗根管細(xì)菌以糞腸球菌為主且集中在根管尖段的結(jié)果一致，與周焱等[14]報(bào)道的嗜血桿菌屬根管治療失敗持續(xù)性感染中可能發(fā)揮重要作用的結(jié)果不一致，可能與檢測的樣本來源不同有關(guān)；同時(shí)，李瑩雪等[15]研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌在根管治療后持續(xù)或繼發(fā)性感染根管中具有較高的檢出率，與根管治療失敗密切相關(guān)。根管生物膜是附著于根管內(nèi)壁的生物膜。研究顯示，未經(jīng)治療和根管治療失敗的慢性根尖周炎患者根管壁中均能檢出根管生物膜，但結(jié)構(gòu)和組成存在一定差異[16]。本研究結(jié)果顯示，未治療和治療失敗的慢性根尖周炎患者根管壁中均能檢出根管生物膜，未經(jīng)治療樣本的牙根外表面以球菌組成的膜狀結(jié)構(gòu)為主，而治療失敗樣本的牙根外表面以球菌或桿菌組成的網(wǎng)狀或?qū)盈B裝的半封閉或完全封閉結(jié)構(gòu)為主，提示與未治療的慢性根尖周炎比較，根管治療失敗的根尖生物膜結(jié)構(gòu)多樣且致密。

綜上所述，以糞腸球菌為主的細(xì)菌定植和根尖外表面根管生物膜的形成可能是導(dǎo)致慢性根尖周炎患者根管治療失敗的主要原因。