超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定新生兒血漿中氟康唑的濃度

覃冬杰 李 萍 吳 婧 梁 婧 韋艷飛 蔣永江 于橋愛 何 靜 王宏虹

1.柳州市質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心藥品科，廣西柳州 545006；2.柳州市婦幼保健院 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院藥學(xué)部，廣西柳州 545001；3.柳州市婦幼保健院 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院新生兒科，廣西柳州 545001；4.柳州市婦幼保健院 廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西柳州 545001

近年來，新生兒重癥監(jiān)護(hù)室真菌感染的發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢(shì)[1-3]，氟康唑是目前治療全身性真菌感染的首選藥物，臨床使用較為廣泛[4-7]。對(duì)于存在真菌感染高危因素的新生兒，早期給予預(yù)防性氟康唑治療可明顯降低真菌的定殖率和感染率，有效降低侵襲性真菌感染的發(fā)病率及死亡率[8-11]。常規(guī)治療藥物監(jiān)測(cè)方法有高效液相色譜法[12-14]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-17]。高效液相色譜法由于靈敏度的局限性，需較大釆血量才能達(dá)到分析要求，然而新生兒特別是早產(chǎn)兒體重較輕，釆血量過大易導(dǎo)致醫(yī)源性貧血，危及健康[18]。因此，為了新生兒氟康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)工作的順利開展，建立一種釆血量小，高效、快速、靈敏的測(cè)定方法尤為必要。本研究旨在建立一種測(cè)定新生兒血漿中氟康唑濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法，為臨床監(jiān)測(cè)其血藥濃度提供檢測(cè)手段。

1 一般材料

1.1 儀器

1290-6430 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（電化學(xué)噴霧離子源，美國(guó)安捷倫公司）；SK8200HP 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；3-3OK 臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；VIBRAX VXR 振蕩器（德國(guó)IKA 集團(tuán)）；XP26 電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司，0.01 mg）；24 UV 超純水器（德國(guó)默克密理博公司）。

1.2 藥品

氟康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100314-201605，含量99.7%）；非那西丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100095-201606，含量100%）；甲醇（美國(guó)Fisher Scientific 公司）為色譜純；水為自制超純水；其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：30℃；流速：0.3 ml/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸，流動(dòng)相B：甲醇。梯度洗脫：0～0.50 min 80%A，0.50～3.00 min 80%～20%A，3.00～4.50 min 20%A，4.50～4.51 min 20%～80%A，4.51～6.00 min 80%A；進(jìn)樣量：1 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電化學(xué)噴霧離子源，正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式采集。離子源溫度：350℃；干燥器流量：8 L/min；毛細(xì)管電壓4000 V，霧化器壓力45 psi?；衔飬?shù)分別為氟康唑：母離子質(zhì)核比（m/z）307.1，定量子離子m/z 220.0，碎裂電壓90 V，碰撞能量15 V。非那西?。耗鸽x子m/z 180.1，定量子離子m/z 110.0，碎裂電壓110 V，碰撞能量15 V。質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 氟康唑和非那西丁的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.2 對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取氟康唑?qū)φ掌?.005 mg 置于5 ml 容量瓶，加純化水溶解并定容至刻度，制成濃度為1.001 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取非那西丁對(duì)照品5.131 mg置于5 ml 容量瓶，加純化水溶解并定容至刻度，制成濃度為1.026 mg/ml 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，取儲(chǔ)備液定量稀釋制成濃度為0.5131 μg/ml 的內(nèi)標(biāo)使用液。

2.3 血漿樣品的制備及處理

2.3.1 含藥血漿樣品的制備 取空白血漿，精密加入氟康唑?qū)φ掌肥褂靡哼m量，使血漿樣品的濃度分別為：0.1001、0.5005、1.0010、5.0050、10.0100、20.0200、50.0500、60.0600 μg/ml。

2.3.2 血漿樣品的處理 取50 μl 血漿樣品，加入50 μl非那西丁內(nèi)標(biāo)使用液，加乙腈400 μl，渦旋1 min，4000 r/min 離心2 min（離心半徑為3 cm），取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，待測(cè)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 取6 份空白血漿樣品及濃度為1.0010 μg/ml 的含藥血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待測(cè)成分無干擾，專屬性高。見圖2。

圖2 血漿中氟康唑和非那西丁色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下的含藥血漿樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示：回歸方程為Y=0.5325X+0.1762（r=0.9999），氟康唑在0.1001～60.0600 μg/ml 濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。見圖3。以10 倍基線噪音時(shí)所對(duì)應(yīng)的氟康唑濃度確定定量限為0.01 μg/ml。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 精密量取含藥血漿樣品（濃度分別為0.5005、10.0100 和50.0500 μg/ml）各5 份，于5 d 內(nèi)每日按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，每份樣品分別測(cè)定1 次，考察日內(nèi)及日間精密度；將實(shí)測(cè)濃度與理論添加濃度進(jìn)行比較，考察準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度RSD 分別為3.74%、1.38%和2.59%，日間精密度RSD 分別為8.88%、1.88%和2.38%，準(zhǔn)確度分別為（86.0±3.5）%、（98.1±1.6）%和（99.0±2.2）%。

2.4.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng) 精密量取含藥血漿樣品（濃度分別為0.5005、10.0100 和50.0500 μg/ml）各5 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，每份樣品分別測(cè)定1 次，得氟康唑峰面積（A）；另取空白血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，用獲得的空白基質(zhì)液配制基質(zhì)對(duì)照品溶液，使其與前者濃度一致，測(cè)定，得氟康唑峰面積（B）；再取氟康唑?qū)φ掌啡芤海?0%乙腈配制成相同濃度的溶劑對(duì)照品溶液，測(cè)定，得氟康唑峰面積（C）。提取回收率=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C×100%。結(jié)果顯示，提取回收率分別為（103.3±5.7）%、（87.8±2.8）%和（98.7±3.7）%，基質(zhì)效應(yīng)分別為（103.6±2.5）%、（102.1±1.8）%和（101.3±1.6）%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取含藥血漿樣品（濃度分別為0.5005、10.0100 和50.0500 μg/ml）各5 份，分別于室溫放置12 h、-20℃反復(fù)凍融3 次及-20℃冷凍放置30 d 后，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，每份樣品分別測(cè)定1 次，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，室溫放置12 h 后穩(wěn)定性RSD分別為8.53%、1.35%和2.07%，-20℃反復(fù)凍融3 次后穩(wěn)定性RSD 分別為4.35%、1.54%和1.43%，-20℃冷凍放置30 d 后穩(wěn)定性RSD 分別為4.66%、2.53%和2.26%。

2.5 臨床樣品測(cè)定

選擇2020 年7 月至11 月柳州市婦幼保健院新生兒科住院患兒10 例，因預(yù)防或治療侵襲性念珠菌感染給予氟康唑，于給藥后取靜脈血0.5 ml，分離血漿，按“2.3.2”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定氟康唑血藥濃度，見表1。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書。

表1 患兒基本情況及血藥濃度測(cè)定結(jié)果

3 討論

采用內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定，可以減少由儀器系統(tǒng)或操作過程產(chǎn)生的誤差。新生患兒由于基礎(chǔ)疾病較多，會(huì)使用較多的、不同類型的藥物進(jìn)行治療，選取一種自身不含且不會(huì)應(yīng)用于新生兒的成分作為內(nèi)標(biāo)尤為重要。本研究選取非那西丁作為內(nèi)標(biāo)，并考察了它的色譜保留行為。結(jié)果顯示，氟康唑與非那西丁的保留時(shí)間相近，兩色譜峰能完全分開，且不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，說明非那西丁作為本研究的內(nèi)標(biāo)物較合適。

在血漿樣品處理時(shí)，有文獻(xiàn)報(bào)道用液液萃取法[19-20]、固相柱萃取法[21]和蛋白沉淀法[22-24]，本研究在比較甲醇和乙腈沉淀蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)乙腈作為蛋白沉淀劑時(shí)的提取效率較甲醇高，故選用乙腈作為蛋白沉淀劑。

早產(chǎn)兒是侵襲性真菌感染的高危人群，氟康唑的新生兒治療用量為3～12 mg/kg，≤2 周的患兒每隔72 h給藥1 次，預(yù)防真菌感染的用法用量尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒按3 mg/kg 給藥后氟康唑血藥濃度處于低水平維持，足月兒按6 mg/kg 給藥后個(gè)體差異較大。因此，氟康唑用于該人群的用藥劑量、有效性、安全性需進(jìn)一步研究探討。

本研究建立的方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，各項(xiàng)指標(biāo)均符合生物樣品定量分析的相關(guān)要求[25]。每個(gè)樣品僅需50 μl 即可進(jìn)行分析測(cè)定，用量較小，適用于新生兒血漿中氟康唑濃度的測(cè)定。