基于高特異性單克隆抗體的間接競爭ELISA檢測食品中胭脂紅的研究

朱 琳，陳子鍵，羅 林，王 宇，鐘玉心，，沈玉棟，孫遠明，徐振林*

（1.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.廣州市食品檢驗所，廣東 廣州 510410）

胭脂紅（Carmine），又名麗春紅4R，屬水溶性偶氮類著色劑，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。胭脂紅可用于各類食品的著色，是目前我國食品中使用最廣泛的人工色素?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T 2760-2014）中規(guī)定胭脂紅在不同食品中的最大允許添加量為0.01～0.5 g/kg［1］。

圖1 胭脂紅的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structural formula of carmine

雖然被廣泛用作食品著色劑，但研究表明，胭脂紅等偶氮類色素在人體內(nèi)可代謝生成致突變原前體——芳香胺類化合物，因而具有潛在毒性［2］。目前，已有文獻報道一定劑量的胭脂紅具有致畸性和致敏性［3-4］。近年來，違規(guī)或超量使用胭脂紅的現(xiàn)象屢見報道。2020 年在菠蘿干（廣州）［5］、冰糖姜（南昌）［6］、車?yán)遄游独罟桑ㄆ諏帲?］等多種食品中均查出胭脂紅超標(biāo)使用情況。

目前，檢測食品中胭脂紅殘留最常用的方法為高效液相色譜法（HPLC）。該法具有選擇性好、靈敏度高等特點。例如Lim 等［8］采用HPLC 檢測山楂條和雪碧樣品中的胭脂紅，方法的線性范圍為1.0～100 μg/mL，且質(zhì)量濃度與信號的線性關(guān)系良好（r2=0.99）。光譜分析技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于胭脂紅的檢測。Hu 等［9］基于熒光碳點開發(fā)了一種超靈敏分光光度法測定食品中的胭脂紅，其檢測限低至11.2 nmol/L。近年來，免疫分析技術(shù)以操作簡便快速、準(zhǔn)確性好、靈敏度高以及高通量等特點被廣泛應(yīng)用于各種食品有害物的快速檢測［10-12］。邢［13］合成了胭脂紅結(jié)構(gòu)類似物，利用戊二醛法偶聯(lián)牛血清白蛋白（BSA）作為免疫原，免疫新西蘭大白兔，成功獲得胭脂紅多克隆抗體并建立了酶聯(lián)免疫分析（ELISA）方法，該方法的半抑制濃度（IC50）為36.82 ng/mL。王興［14］基于威廉遜制醚合成胭脂紅半抗原，通過雜交瘤技術(shù)，成功獲得胭脂紅單克隆抗體并建立了ELISA方法，該方法的IC50為172.97 ng/mL，但其半抗原設(shè)計策略未考慮到胭脂紅本身易發(fā)生的醌腙異構(gòu)互變現(xiàn)象，導(dǎo)致抗體靈敏度不足。針對現(xiàn)有胭脂紅免疫檢測方法半抗原設(shè)計復(fù)雜或抗體質(zhì)量不佳導(dǎo)致靈敏度不足的問題，本研究提出了一種高效、簡便的半抗原設(shè)計合成策略，以重氮化法偶聯(lián)乳鐵蛋白（LF）作為免疫原，通過動物免疫和雜交瘤技術(shù)篩選制備了高特異性的胭脂紅單克隆抗體；并通過戊二醛法偶聯(lián)BSA 制備包被原，建立了間接競爭ELISA 方法（icELISA），用于食品樣品中胭脂紅的快速檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

NanoDrop 2000 紫外分光光度計、Multiskan MK3 酶標(biāo)儀、Wellwash MK2 洗板機、TC-2323 CO2培養(yǎng)箱均購于美國Thermo 公司；ZHJH-1122 超凈工作臺購于上海新苗醫(yī)療器械公司；CHA 倒置顯微鏡購于日本Olympus 公司；HVE-50 滅菌鍋購于日本Hirayama 公司；Vortex Genius 3 渦旋振蕩器、IKA basic 磁力攪拌器購于德國IKA 公司；HH·W21-600 電熱恒溫水溫箱購于上海悅豐儀器儀表有限公司；RS-NSY-1 樣品濃縮儀購于廣州瑞森生物科技有限公司；Unique R-10 純水儀（18.25 MΩ·cm）購于譽維生物科技儀器有限公司。

胭脂紅、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-氨基-1-萘磺酸鈉、7-氨基-1，3-萘二磺酸、莧菜紅、亮藍、檸檬黃、日落黃、洋酸紅購于上海麥克林生化科技有限公司；LF、BSA、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、單抗亞型試劑盒購于美國Sigma 公司；HAT 培養(yǎng)基、HT 培養(yǎng)基、RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基購于美國Gibco 公司；胎牛血清購于依科賽生物科技有限公司；雙抗（青霉素+鏈霉素）購于北京雷根生物技術(shù)有限公司；凍存液購于新賽美生物科技有限公司；SPF級Bal b/c小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 人工抗原的合成與鑒定

胭脂紅半抗原的合成：稱取1 mmol 4-氨基-1-萘磺酸鈉四水合物于50 mL 圓底燒瓶中，加入5 mmol鹽酸（1 mol/L），常溫避光反應(yīng)30 min。加入1 mmol NaNO2，冰浴中反應(yīng)1 h，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH 值為強酸性（pH ≤3.0），得到A 液。將1 mmol 7-氨基-1，3-萘二磺酸溶于1 mol/L 的碳酸鈉溶液中，加入A 液混合，并用1 mol/L 碳酸鈉溶液將反應(yīng)體系的pH 值調(diào)至8.0，冰浴反應(yīng)7 h。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，調(diào)節(jié)pH值至6.5～7.0。加入過量NaCl鹽析并離心（4 000 r/min，15 min），得到的液體分為3 層，由上至下依次為水層、胭脂紅半抗原產(chǎn)物層、NaCl 層。取中間層烘干即為胭脂紅半抗原，采用HPLC-MS/MS進行鑒定。

胭脂紅免疫原的合成（重氮化法）：稱取0.1 mmol 胭脂紅半抗原溶于1 mL 1 mmol/L HCl 中，加入0.1 mmol亞硝酸鈉，于4 ℃避光反應(yīng)1 h，得到B 液。稱取15 mg LF 于10 mL 離心管中，加入2 mL 硼酸緩沖溶液溶解，得到C 液。將B 液緩慢滴加至C 液中，混勻置于搖床上4 ℃避光反應(yīng)8 h。產(chǎn)物在PBS緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4，以下如未作說明，均為此濃度）中透析3 d，期間每天更換兩次透析液，得到胭脂紅免疫原。采用全波長紫外-可見光譜進行免疫原鑒定。

胭脂紅包被原的合成（戊二醛法）：稱取18.3 mg 胭脂紅半抗原溶于1 mL 硼砂緩沖溶液中，得到D液；稱取20 mg BSA于棕色反應(yīng)瓶中，加入2 mL硼砂緩沖溶液溶解，得到E液。將D、E液混合后加入0.2 mL 25%戊二醛溶液，置于磁力攪拌器上室溫反應(yīng)5 h。在PBS 緩沖液中透析3 d，期間每天更換兩次透析液，得到胭脂紅包被原。采用全波長紫外-可見光譜進行包被原鑒定。

1.3 分子表面靜電勢模擬

胭脂紅半抗原、胭脂紅及其結(jié)構(gòu)類似物的最低能量構(gòu)象由sybyl 8.1（Tripos Inc.，USA）分子模擬軟件構(gòu)建，步數(shù)為1 000 步，能量為0.001 Kcal/（mol·A），力場為Tripos 力場，電荷組為Gasteiger-Huckel。小分子的最低能量構(gòu)象構(gòu)建完畢后，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)采用該軟件MOLCAD surface 模塊的Connolly方法生成分子表面靜電勢（Electrostatic potential），顯示模式選擇為半透明。

1.4 小鼠抗血清分析與單克隆抗體制備

參照Chen等［15］的方法對6 ～8周齡的雌性Bal b/c小鼠進行免疫，在第3次免疫后一周從小鼠尾部靜脈取血10 μL，將血清置于37 ℃孵育0.5 h，12 000 r/min 離心10 min，取上清即得小鼠抗血清，通過ELISA方法檢測其效價與抑制率。融合前3 ～4 d對有效小鼠進行沖擊免疫，參照Zai等［16］的方法取出有效小鼠脾細胞與SP2/0 細胞進行融合并進行有限稀釋篩選。將篩選獲得的單克隆細胞株接種于同系小鼠腹腔內(nèi)，可誘導(dǎo)腹腔腫瘤并產(chǎn)生含抗體的腹水［17］。取出腹水并采用Protein A/G 進行純化，獲得高純度的胭脂紅單克隆抗體。

1.5 抗體親和力常數(shù)及亞型測定

將包被原用碳酸緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 9.6）稀釋至0.125 μg/mL，以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，37 ℃水浴箱靜置12 h，用洗板機洗滌2 次（300 μL 磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST，0.01 mol/L，pH 7.4）），拍干后加入120 μL/孔封閉液（5%脫脂奶粉），37 ℃孵育3 h后甩干并烘干備用。采用間接ELISA 法測定抗體親和力。以150 μg/mL 為最高抗體質(zhì)量濃度，倍比梯度稀釋，測定不同質(zhì)量濃度抗體與包被原反應(yīng)的A450nm值，以抗體質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以A450nm值為縱坐標(biāo)，取趨于平坦段A450nm值50%處所對應(yīng)的抗體質(zhì)量濃度的倒數(shù)為抗體的親和力常數(shù)Ka。

參照單抗亞型鑒定試劑盒說明書對抗體亞型進行鑒定。

1.6 免疫分析方法的建立及條件優(yōu)化

采用不同包被原濃度包被，并用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）分別將胭脂紅單克隆抗體、胭脂紅藥物稀釋至所需濃度。酶標(biāo)板加入50 μL/孔稀釋好的抗體以及50 μL/孔PBS作為效價孔，加入50 μL/孔抗體以及50 μL/孔胭脂紅藥物作抑制孔，37 ℃孵育40 min，洗板5次，拍干。每孔加100 μL 1∶5 000 稀釋的HRP-標(biāo)記羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，拍干。TMB 顯色液A 液和B 液等體積混勻后，每孔加100 μL，37 ℃反應(yīng)10 min，然后每孔加入50 μL 終止液（10%H2SO4），用酶標(biāo)儀測定450 nm 處各孔的吸光值（A450nm）。效價的定義是吸光值為1～1.5 時抗血清的稀釋倍數(shù)，抑制率（Inhibition rate）計算公式如下所示：

在上述實驗基礎(chǔ)上，利用棋盤法優(yōu)化包被原質(zhì)量濃度和抗體稀釋倍數(shù)，包被原質(zhì)量濃度設(shè)置為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μg/mL，對應(yīng)抗體質(zhì)量濃度為0.19、0.39、0.78、3.12、6.25 μg/mL（以100 μg/mL的抗體母液依次稀釋16.32、128、256、512倍得到）；利用單因素實驗優(yōu)化稀釋液條件，包括離子濃度、pH 值、吐溫20（T-20）含量，其中離子濃度設(shè)置為0.005、0.01、0.02、0.04 mol/L PBS；pH值設(shè)置為5.4、6.4、7.4、8.4；T-20添加量為0、0.05%、0.1%、0.2%。

1.7 方法特異性

在最優(yōu)條件下，測定本方法對日落黃、檸檬黃、亮藍、莧菜紅、洋紅酸等胭脂紅結(jié)構(gòu)類似物的抑制率，計算交叉反應(yīng)率（CR）。

1.8 樣品基質(zhì)效應(yīng)

胭脂紅在飲料和蜜餞中的使用情況較為普遍，因此本研究選擇雪碧和山楂條兩種樣品進行加標(biāo)回收實驗。雪碧、山楂條購自廣州某超市，經(jīng)HPLC-UV驗證不含胭脂紅。將山楂條打碎，稱取5.0 g樣品加30 mL一級水，置于60 ℃水浴攪拌至樣品完全溶解，參照Wei等［18］的方法，向樣品溶液中加入1 g聚酰胺粉混勻后抽濾，依次用甲醇-甲酸溶液洗滌、乙醇-氨水溶液解吸，將所得的液體空氣吹干后加入5 mL PBS 復(fù)溶，得到樣品提取液。將提取液用PBS 緩沖液稀釋10、20、40、60、80 倍，通過ELISA方法得到各稀釋倍數(shù)下的S型曲線，選擇與標(biāo)準(zhǔn)曲線最為接近的稀釋倍數(shù)作為消除基質(zhì)效應(yīng)所需的稀釋倍數(shù)。

1.9 加標(biāo)回收實驗及儀器驗證

向空白樣品中添加10、20、40 μg/g 的胭脂紅，經(jīng)樣品前處理后，用icELISA 方法進行檢測，得到加標(biāo)回收率：

同時，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法（GB5009.35-2016）［20］，利用HPLC-UV（254 nm）對加標(biāo)樣品進行檢測，使用0.02 mol/L乙酸銨（A）和甲醇（B）進行梯度洗脫，條件如下：0 ～3 min，5%～35%B；3 ～7 min，35%～100%B；7 ～10 min，100%B。進樣量為10 μL，流速1.0 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 半抗原設(shè)計策略與抗血清特性分析

由于分子體積和空間位阻較小［19］，小分子化合物（MW≤1 000 Da）通常沒有B 淋巴細胞表位，因而無免疫原性［20］。針對該問題，研究者將小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成完全抗原以增大半抗原分子量，刺激動物機體產(chǎn)生特異性抗體［21］。針對現(xiàn)有胭脂紅半抗原設(shè)計路線較復(fù)雜的問題，本研究設(shè)計了新型胭脂紅半抗原與完全抗原的合成路線（圖2A、B）。通過分子表面靜電勢的模擬可知（圖2C），胭脂紅分子中的兩個萘環(huán)平面互相垂直，其磺酸基帶有明顯的正電荷。而胭脂紅半抗原基本可維持與胭脂紅相同的構(gòu)象與表面靜電勢分布，表面戊二醛的引入對半抗原的電荷分布幾乎無影響，說明半抗原的設(shè)計科學(xué)合理，預(yù)測可有效刺激動物免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性抗體。

圖2 胭脂紅半抗原（A）與完全抗原（B）的合成路線圖以及分子表面靜電勢的模擬圖（C）Fig.2 Synthetic of carmine hapten（A）and complete antigen（B），and simulation of molecular surface electrostatic potential（C）

通過對胭脂紅半抗原進行改造并偶聯(lián)上載體蛋白后注射到小鼠體內(nèi)，可以引起小鼠免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體［22］。小鼠抗血清的效價是評價小鼠血清中所包含抗胭脂紅抗體濃度的指標(biāo)，可以直接反映動物免疫應(yīng)答的強弱；抗血清的抑制率則可以直接體現(xiàn)抗血清中的抗體對目標(biāo)分析物特異性識別能力的強弱［23］。本研究得到的小鼠抗血清效價和抑制如表1所示。選擇效果最好的3號小鼠進行細胞融合與單克隆篩選，獲得胭脂紅單克隆抗體7C2。由圖3 可知，本研究所制備的胭脂紅單克隆抗體亞型為Ig G2b型，抗體親和力常數(shù)為1.0×1010L/mol。

表1 小鼠第三次免疫后血清的效價與抑制率Table 1 Anti-carmine serum titer and inhibition rate after third immunizations in mice

圖3 胭脂紅單克隆抗體亞型（A）及抗體親和力常數(shù)（B）Fig.3 Antibody subtype（A）and affinity constant（B）of carmine monoclonal antibody

2.2 胭脂紅icELISA方法的建立

ELISA 工作條件對其檢測性能有顯著影響，因此需要進行工作參數(shù)優(yōu)化。在各種工作條件下，通過歸一法擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得對應(yīng)的IC50值，選擇IC50最小值所對應(yīng)的參數(shù)值為該條件下的最佳參數(shù)值。結(jié)果顯示，本方法最佳包被原質(zhì)量濃度為0.125 μg/mL、最佳抗體稀釋倍數(shù)為128、最佳稀釋液離子濃度為0.005 mol/L、最佳稀釋液pH 值為8.4、最佳稀釋液中T-20 添加量為0.2%。在最優(yōu)條件下，建立了胭脂紅藥物質(zhì)量濃度與吸光值（B/B0）之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4 所示。該方法的線性范圍為2～50 ng/mL，半抑制濃度IC50為10.1 ng/mL，檢出限（IC10）為0.98 ng/mL。

圖4 胭脂紅icELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 icELISA standard curve of carmine

2.3 方法特異性研究

測定了icELISA 對胭脂紅結(jié)構(gòu)類似物莧菜紅、洋酸紅、日落黃、檸檬黃、亮藍等的交叉反應(yīng)率，結(jié)果顯示，本方法具有很好的特異性（圖5A）。模擬表面靜電勢能圖（圖5B）顯示，胭脂紅的同分異構(gòu)體莧菜紅的兩個萘環(huán)平面相互垂直，其磺酸基也帶有明顯正電荷，化學(xué)結(jié)構(gòu)和表面靜電勢分布與胭脂紅相似。然而莧菜紅與胭脂紅的交叉反應(yīng)率很低，其原因可能在于莧菜紅的磺酸基位置與胭脂紅存在差異。胭脂紅6 號和8號位置存在磺酸基，而莧菜紅的磺酸基分別位于3 號和6 號位（圖中紅圈所示）。對于莧菜紅，其8 號位磺酸基的缺失可能導(dǎo)致與抗體的相互作用力減弱，如氫鍵、親水相互作用、靜電相互作用等，而3 號位的磺酸基可能會引起與抗體間的排斥作用，如空間位阻、靜電排斥、極性排斥等作用。

圖5 胭脂紅抗體與胭脂紅結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率（A）及胭脂紅的與莧菜紅的分子模擬表面靜電勢對比（B）Fig.5 Cross-reaction rates of carmine monoclonal antibody and carmine structural analogs（A），and comparison of simulated electrostatic potential on the molecular surface of carmine and amaranth（B）

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)分析

樣品基質(zhì)對ELISA分析存在干擾，由于本研究建立的方法靈敏度較高，因此消除基質(zhì)干擾最簡便、高效的方法是對樣品基質(zhì)進行稀釋［24］。如圖6 所示，當(dāng)實際樣品提取液稀釋40 倍時，擬合的曲線與PBS標(biāo)準(zhǔn)曲線差異最小，說明40倍稀釋可以消除樣品基質(zhì)的干擾。

圖6 山楂條（A）與雪碧（B）樣品檢測中不同稀釋倍數(shù)下標(biāo)準(zhǔn)曲線對比圖Fig.6 Comparison chart of standard curves under different sample dilution ratios in hawthorn strips（A）and sprite（B）sample testing

2.5 加標(biāo)回收實驗

選擇近年來市場檢測超標(biāo)較嚴(yán)重的蜜餞類（山楂條）和飲料類（雪碧）進行加標(biāo)回收實驗。結(jié)果顯示樣品中添加10 ～40 μg/g的胭脂紅，山楂條樣品的回收率為93.0%～113%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為9.7%～12%；雪碧樣品的回收率為93.0%～100%，RSD 為3.2%～3.9%。目前我國對蜜餞和飲料中胭脂紅的限量為50 mg/kg，因此本方法可以滿足國家限量標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 2760-2014）檢測要求。將本方法的檢測結(jié)果與國標(biāo)HPLC-UV結(jié)果進行比對（表2），結(jié)果顯示兩者準(zhǔn)確度一致。

表2 不同樣品中胭脂紅的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of carmine in different samples（n=3）

3 結(jié) 論

本研究將4-氨基-1-萘磺酸鈉四水合物與7-氨基-1，3-萘二磺酸反應(yīng)合成了新型胭脂紅半抗原，分別通過重氮化法和戊二醛法與載體蛋白進行偶聯(lián)制備人工抗原。通過免疫小鼠、細胞融合、細胞篩選、腹水制備和抗體純化等流程，制備獲得了高特異性的胭脂紅單克隆抗體，并建立了icELISA免疫分析方法。對方法的工作條件進行了優(yōu)化，得到最佳檢出限為0.98 ng/mL，半抑制濃度IC50為10.1 ng/mL，線性范圍為2 ～50 ng/mL。將方法用于雪碧和山楂條樣品中胭脂紅的檢測，加標(biāo)回收率分別為93.0% ～100%、93.0%～113%。此外，本方法特異性良好，對胭脂紅結(jié)構(gòu)類似物莧菜紅、洋酸紅、日落黃、檸檬黃、亮藍均不存在交叉反應(yīng)。本研究所建立的免疫分析方法檢測靈敏度高、操作簡便，可以用于食品中胭脂紅殘留的快速篩查。