不同中性鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗光合作用和抗氧化酶系統(tǒng)的影響

蔡琪琪 王 堽 董寅壯 於麗華 王宇光 耿 貴,

（1黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱；2黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱）

鹽漬化是影響全球生態(tài)環(huán)境的重要限制因素之一[1]。全球大約有 1×109hm2的鹽堿地，其中含NaCl和Na2SO4等中性鹽的鹽土約占23%[2]。NaCl和 Na2SO4等中性鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有影響，且 NaCl和 Na2SO4對(duì)不同植物的影響有差異。研究[3]發(fā)現(xiàn)，NaCl和 Na2SO42種中性鹽脅迫對(duì)苦豆子種子萌發(fā)均有抑制作用，且 Na2SO4脅迫的影響比 NaCl弱。對(duì)四翅濱藜的研究[4]也發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫抑制效果比Na2SO4脅迫強(qiáng)。而對(duì)韃靼濱藜的研究[5]表明，Na2SO4脅迫的毒害程度高于NaCl脅迫。

甜菜（Beta vulgaris L.）是世界及中國(guó)北方主要糖料作物之一，具有良好的耐鹽性，在我國(guó)新疆、內(nèi)蒙古和黑龍江等鹽堿地區(qū)種植較多[6]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甜菜的耐鹽性均有研究，但至今仍未完全了解其耐鹽機(jī)制。為進(jìn)一步揭示甜菜耐鹽機(jī)制，本試驗(yàn)選用中性鹽NaCl和Na2SO4對(duì)甜菜進(jìn)行脅迫，以期通過(guò)對(duì)比2種鹽對(duì)甜菜影響的差異，了解其耐鹽機(jī)制。植物受到鹽脅迫后，光合作用往往受到抑制，同時(shí)抗氧化酶系統(tǒng)被激活來(lái)抵抗逆境，因此，本研究通過(guò)分析不同中性鹽脅迫對(duì)甜菜苗期光合作用及抗氧化酶系統(tǒng)影響的差異，為甜菜在不同鹽堿地的篩選種植及生產(chǎn)布局提供依據(jù)，并為后期進(jìn)一步研究甜菜對(duì)NaCl和Na2SO4的耐受機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)方法

以實(shí)驗(yàn)室保留的甜菜品種‘KWS1176’的丸?；N子為材料。采用蛭石培養(yǎng)進(jìn)行催苗，在25℃條件下催苗 5d，挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗進(jìn)行移栽，用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液在光照培養(yǎng)室進(jìn)行水培，光照有效輻射 460±15[μmol/(m3·s)]，光照時(shí)間 6:00-20:00，晝夜溫度分別為(25±2)℃和(20±2)℃，相對(duì)濕度65%～70%。

如表1，水培8d后對(duì)甜菜分別進(jìn)行NaCl、Na2SO4及其混合鹽脅迫處理，每種中性鹽處理設(shè)置 2個(gè)Na+水平脅迫（中度脅迫LS：140mmol/L Na+；重度脅迫 HS：280mmol/L Na+），另外設(shè)置不加鹽對(duì)照（CK）。其中，混合鹽為NaCl與Na2SO4按相同Na+占比混合而成，其陰離子所帶電荷量也相同，即NaCl與Na2SO4的摩爾比為2:1。所用化學(xué)試劑均為分析純。培養(yǎng)過(guò)程中不間斷向營(yíng)養(yǎng)液中通入空氣。每5d更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至18d時(shí)收獲并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

表1 不同處理NaCl和Na2SO4添加量Table 1 The amount of NaCl and Na2SO4 added in different treatments mmol/L

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 甜菜幼苗生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo) 將收獲的甜菜幼苗整株放入烘箱內(nèi)，105℃殺青 35min，然后調(diào)至75℃烘干至恒重，使用分析天平稱(chēng)重，即為甜菜干重。將甜菜葉片完整剪下，并平鋪在掃描儀上掃描，用 WINRHIZO Reg 2003b分析軟件對(duì)掃描后的圖片進(jìn)行分析，計(jì)算甜菜的葉面積[7]。

1.2.2 甜菜光合作用相關(guān)指標(biāo) 利用 95%乙醇研磨提取法測(cè)定甜菜葉片的葉綠素a（Chl a）、葉綠素 b（Chl b）、總?cè)~綠素（Chl）及類(lèi)胡蘿卜素（Caro）含量[8]。用CI-340手持式光合儀（CID公司，美國(guó)）測(cè)定甜菜第2對(duì)真葉凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和細(xì)胞間CO2濃度（Ci）。

1.2.3 甜菜葉片中抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo) 采用抽濾法測(cè)定葉片相對(duì)電導(dǎo)率；采用硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)法測(cè)定丙二醛（MDA）含量；采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用乙二胺四乙酸法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性；采用聚乙烯吡咯烷酮法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性[9-10]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Office Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及繪圖；用SPSS分析軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗生長(zhǎng)的影響

鹽脅迫影響植物生長(zhǎng)發(fā)育，首先表現(xiàn)在對(duì)其生物量的累積上。如圖1a所示，甜菜幼苗在不同中性鹽處理下，其單株干重均有所下降。在 140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的甜菜單株干重與 CK相比分別下降了 12.14%、38.53%和17.93%；280mmol/L Na+濃度下，3個(gè)處理分別下降了52.57%、68.94%和57.34%。說(shuō)明Na2SO4處理對(duì)甜菜生物量累積的影響最大，NaCl處理最小。葉面積是重要的形態(tài)指標(biāo)。如圖1b所示，在各組中性鹽處理下，甜菜的葉面積均有所下降。在相同Na+濃度下，NaCl處理的甜菜葉面積較CK下降較少，混合鹽處理次之，Na2SO4處理下降最多，140mmol/L Na+濃度下分別下降了 13.88%、39.31%和 35.07%，280mmol/L Na+濃度下分別下降了54.39%、72.11%和65.01%。

圖1 不同中性鹽處理對(duì)甜菜幼苗單株干重和葉面積的影響Fig.1 The effects of different neutral salt treatments on the dry weight per plant and leaf area of sugar beet seedlings

2.2 鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗葉片光合生理的影響

2.2.1 不同鹽脅迫對(duì)甜菜光合色素含量的影響

植物在鹽脅迫下，其體內(nèi)光合色素會(huì)趨向分解。如圖2所示，在不同中性鹽脅迫下，甜菜葉片的光合色素含量較CK均有所下降。首先，Chl含量可以直觀地反映NaCl、Na2SO4和混合鹽3種處理對(duì)甜菜葉綠素影響的差異。在相同Na+濃度下，NaCl處理的甜菜葉片Chl含量下降最少，混合鹽處理次之，Na2SO4處理下降最多：在140mmol/L Na+濃度下，3個(gè)處理分別下降了16.28%、24.15%和35.46%；在 280mmol/L Na+濃度下，分別下降了 39.82%、44.09%和 62.08%。在相同 Na+濃度下，混合鹽和NaCl處理對(duì)甜菜Chl a含量的影響差異不顯著，說(shuō)明二者對(duì)甜菜葉片Chl a含量的影響沒(méi)有差異。而Na2SO4與混合鹽和 NaCl處理的差異顯著，說(shuō)明Na2SO4對(duì)甜菜的影響較大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在中性鹽處理下，Chl b下降幅度大于Chl a，在140mmol/L Na+濃度下，NaCl處理的Chl a含量下降了4.38%，而Chl b含量下降了31.68%，說(shuō)明Chl b對(duì)中度鹽脅迫更敏感。類(lèi)胡蘿卜素作為光合色素，不僅參與光合反應(yīng)，還能有效清除葉綠體內(nèi)過(guò)剩的激發(fā)能，減少活性氧[11]。結(jié)果（圖2d）顯示，不同中性鹽處理的甜菜葉片Caro含量的變化趨勢(shì)與Chl a相似，且Na2SO4處理對(duì)甜菜Caro含量的影響更大。

圖2 不同中性鹽處理對(duì)甜菜幼苗葉片Chl、Chl a、Chl b及Caro含量的影響Fig.2 Effects of different neutral salt treatments on the contents of Chl, Chl a, Chl b and Caro of leaves of sugar beet seedlings

2.2.2 不同鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗光合參數(shù)的影響如圖3所示，不同中性鹽處理后，Pn、Tr及Gs均有所下降，而Ci有所上升，且Na2SO4脅迫影響大于NaCl。

圖3 不同中性鹽處理對(duì)甜菜幼苗Pn、Tr、Gs和Ci的影響Fig.3 Effects of different neutral salt treatments on Pn, Tr, Gs and Ci of sugar beet seedlings

其中，不同中性鹽對(duì)甜菜Pn和Tr的影響差異一致，在140mmol/L Na+濃度下，Na2SO4和混合鹽處理的甜菜Pn無(wú)顯著差異（P＜0.05），且Na2SO4和混合鹽處理的甜菜Pn下降幅度大于NaCl處理，甜菜Tr的顯著性差異與Pn表現(xiàn)一致。NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的Pn分別下降了11.90%、46.68%和48.00%，Tr分別下降了18.66%、37.79%和31.73%。與Pn和Tr的變化不同，140mmol/L Na+濃度下，混合鹽和NaCl處理的Gs無(wú)明顯差異，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理分別下降了 26.40%、53.29%和18.36%，可見(jiàn)Na2SO4處理的甜菜Gs下降幅度大于混合鹽和NaCl處理，表明Na2SO4對(duì)甜菜Gs的影響更大。同時(shí)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫使甜菜幼苗的Ci顯著升高（P＜0.05），且 Na2SO4處理的變化幅度最大，在140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理依次升高了159.25%、396.93%和276.68%。

2.3 鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

2.3.1 鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率和 MDA含量的影響 結(jié)果（圖4）顯示，隨著鹽脅迫濃度的上升，甜菜葉片相對(duì)電導(dǎo)率及MDA含量顯著提高（P＜0.05）；在相同Na+濃度的鹽脅迫下，與CK相比，Na2SO4處理的甜菜積累的MDA更多，相對(duì)電導(dǎo)率也更大，混合鹽處理次之，NaCl處理最小。

圖4 不同濃度鹽脅迫下葉片相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量變化Fig.4 Changes of relative conductivity and MDA content in leaves under salt stress of different concentrations

從圖 4a看出，在 140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的甜菜相對(duì)電導(dǎo)率較CK分別提高了209.52%、303.91%和236.68%；在280mmol/L Na+濃度下，3個(gè)處理的相對(duì)電導(dǎo)率較CK分別提高了316.19%、384.04%和348.43%?？梢钥闯?，在不同中性鹽處理下，甜菜幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率均顯著提升（P＜0.05），且Na2SO4處理的相對(duì)電導(dǎo)率提高幅度最大，即 Na2SO4處理的甜菜膜系統(tǒng)受害程度最嚴(yán)重。

從圖4b看出，甜菜葉片中MDA含量均隨鹽處理濃度的提高而顯著上升（P＜0.05），且Na2SO4處理積累的 MDA明顯較其他 2個(gè)處理多。在140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的MDA含量分別較CK提高了20.02%、29.17%和27.53%；在280mmol/L Na+濃度下，3個(gè)處理的MDA含量分別較 CK提高了 34.16%、44.22%和37.09%，即隨著鹽濃度的提高，甜菜葉片細(xì)胞脂膜過(guò)氧化程度加重，且Na2SO4處理的細(xì)胞脂膜過(guò)氧化程度最嚴(yán)重。

2.3.2 鹽脅迫對(duì)甜菜葉片抗氧化酶活性的影響

植物受到鹽脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各組分受損。結(jié)果（圖5）表明，甜菜抗氧化酶活性隨著鹽濃度的升高而升高，且 Na2SO4脅迫的甜菜抗氧化酶活性最高，混合鹽處理次之，NaCl處理最低。

SOD是生物體清除活性氧自由基的首要物質(zhì)。如圖 5a所示，在 140mmol/L Na+濃度下，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理的SOD活性分別比CK提高了2.16%、6.53%和4.10%；280mmol/L Na+濃度下分別提高7.10%、14.36%和10.18%。APX主要負(fù)責(zé)清除植物體內(nèi)的 H2O2，且其反應(yīng)生成物在清除活性氧方面也起到重要作用[11]。由圖5b所示，在140mmol/L Na+濃度下，甜菜葉片APX活性較CK顯著提高（P＜0.05），NaCl、Na2SO4和混合鹽處理分別提高了 61.11%、100.42%和 84.19%。在280mmol/L Na+濃度下，APX活性進(jìn)一步提升，NaCl、Na2SO4和混合鹽處理葉片APX活性分別提高了120.95%、139.87%和129.22%。由圖5c可見(jiàn)，CAT活性的變化在低鹽和高鹽處理下差異較大：NaCl處理在低鹽和高鹽處理下葉片 CAT活性較CK分別提高了16.78%和41.10%，Na2SO4處理的葉片CAT活性較CK分別提高了30.94%和60.93%，混合鹽處理則分別提高了27.67%和46.41%。

圖5 不同中性鹽處理甜菜SOD、APX、CAT和POD活性的變化Fig.5 The changes in SOD, APX, CAT and POD activities of sugar beet treated with different neutral salts

POD被譽(yù)為植物氧化脅迫的標(biāo)志酶，可以清除線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞液中產(chǎn)生的 H2O2[12]。如圖5d所示，在中度和重度鹽脅迫下，甜菜POD活性均表現(xiàn)為Na2SO4＞混合鹽＞NaCl。

3 討論

3.1 不同鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗生長(zhǎng)及光合生理的影響

植物幼苗干重是衡量植物生長(zhǎng)狀況的綜合指標(biāo)之一。研究[7]表明，干物質(zhì)累積量會(huì)隨著鹽害程度的增加而減少。本研究發(fā)現(xiàn)，Na2SO4處理的甜菜單株干重下降幅度最大，說(shuō)明Na2SO4對(duì)甜菜的毒害作用最強(qiáng)。甜菜作為草本植物，地上部分主要為葉片，且葉片是進(jìn)行光合作用的主要器官，因此葉面積既可以表現(xiàn)甜菜的生長(zhǎng)情況，又可以反映其光合作用的效率。本研究中，鹽處理的甜菜葉面積較CK均呈下降趨勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)甜菜的生長(zhǎng)在鹽脅迫下受到抑制，且Na2SO4對(duì)甜菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響大于NaCl和混合鹽。

光合作用能將光能轉(zhuǎn)化為有機(jī)物并放出能量，維持植物生長(zhǎng)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。分析光合作用各項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下甜菜光合作用受到抑制，且 Na2SO4處理受抑制程度最大，光合色素含量表現(xiàn)為 Na2SO4＜混合鹽＜NaCl。光合色素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)，其主要作用為吸收光能，并將光能轉(zhuǎn)化為電能，因此，其含量可以衡量植株對(duì)光能的利用率[13]。對(duì)甜菜的研究[14]發(fā)現(xiàn)，隨著鹽脅迫程度的加深，其葉片光合色素含量逐漸降低，即鹽脅迫對(duì)甜菜的毒害作用越強(qiáng)，光合色素含量下降幅度越大。

另外，根據(jù)Chl a、Chl b和Caro含量變化可以發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對(duì)Chl b含量的影響最大，表明Chl b對(duì)鹽脅迫更敏感，這可能與甜菜的耐鹽生理機(jī)制有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。而甜菜Chl a和Caro在鹽脅迫下的變化趨勢(shì)相近，表明Chl a和Caro對(duì)不同中性鹽的響應(yīng)變化一致。

光合作用限制酶主要受到CO2濃度的調(diào)控，因此氣孔是重要的光合限制因子之一。本試驗(yàn)中，不同中性鹽處理的甜菜葉片 Gs均表現(xiàn)為下降，表明鹽脅迫會(huì)引起氣孔關(guān)閉。鹽脅迫引起氣孔關(guān)閉的原因分為氣孔限制和非氣孔限制，前者是鹽脅迫引起葉片含水量降低，使氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致Ci下降，進(jìn)而引起光合速率的降低，即光合速率的降低是植物生理調(diào)節(jié)引起的；后者是由于鹽脅迫降低了光合速率，引起Ci升高，進(jìn)而引起氣孔的關(guān)閉，即鹽脅迫直接影響了光合作用[15]。本研究中，Pn、Tr及Gs下降的同時(shí)，Ci有所上升，表明光合速率降低的主要原因是非氣孔限制。

3.2 不同鹽脅迫對(duì)甜菜幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

植物在逆境中，由于代謝紊亂會(huì)產(chǎn)生過(guò)量活性氧，造成氧化脅迫。體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)不足以抵消生成的活性氧便會(huì)引起細(xì)胞膜氧化損傷[15]，通常用相對(duì)電導(dǎo)率和 MDA含量來(lái)衡量細(xì)胞膜受損的程度[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，葡萄幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量呈上升趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同中性鹽脅迫下甜菜的MDA含量及相對(duì)電導(dǎo)率均顯著高于 CK（P＜0.05），表明不同中性鹽處理甜菜幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性均遭到破壞。同時(shí)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在相同Na+濃度下，Na2SO4處理的MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率變化均較大，混合鹽處理次之，NaCl處理最小。說(shuō)明Na2SO4處理的甜菜細(xì)胞質(zhì)膜受到鹽脅迫損傷較嚴(yán)重，細(xì)胞膜透性大大提高，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞中的MDA含量增加[18]。

為有效抵御氧化脅迫，植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套抗氧化系統(tǒng)，以防御活性氧和自由基對(duì)膜脂的傷害，并有利于維持膜結(jié)構(gòu)的完整性。其中SOD、POD、CAT和APX在抗氧化代謝中起著關(guān)鍵作用[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同中性鹽處理的甜菜幼苗的SOD、APX、CAT和POD活性均明顯高于CK，這與前人的研究[19]結(jié)果相同，說(shuō)明甜菜在鹽脅迫下，能夠通過(guò)累積抗氧化酶來(lái)減輕對(duì)膜系統(tǒng)的過(guò)氧化傷害[20]。抗氧化酶活性隨著鹽濃度的增高而增加，說(shuō)明隨著鹽害程度的加重，植物需要累積更多的抗氧化物酶來(lái)清除過(guò)多的活性氧，從而降低細(xì)胞受到的損害，較大程度地維持植物正常生長(zhǎng)。而對(duì)比相同Na+濃度下3個(gè)中性鹽處理的SOD、APX、CAT及POD活性發(fā)現(xiàn)，Na2SO4脅迫的甜菜各類(lèi)抗氧化酶活性均高于其他二者，說(shuō)明 Na2SO4脅迫對(duì)甜菜幼苗的傷害大于其他處理。

從光合作用和抗氧化酶系統(tǒng)2個(gè)方面的分析發(fā)現(xiàn)，甜菜對(duì)相同Na+濃度條件下NaCl和Na2SO42種中性鹽的耐受程度不同，由此推測(cè)甜菜對(duì) Cl-和SO42-2種陰離子的適應(yīng)機(jī)制可能存在差異。后續(xù)可以針對(duì)這一情況進(jìn)行分子水平的研究，探索甜菜對(duì)2種離子的適應(yīng)機(jī)制，并進(jìn)一步揭開(kāi)植物耐鹽機(jī)制。此外，本研究使用水培方式進(jìn)行培養(yǎng)，而在實(shí)際生產(chǎn)中，甜菜栽培主要在土壤中進(jìn)行，土壤成分更加復(fù)雜，SO42-容易與其他物質(zhì)結(jié)合沉淀，進(jìn)而出現(xiàn)與水培不同的生長(zhǎng)情況，因此接下來(lái)將采取土培方式對(duì)其進(jìn)行研究，以期為不同鹽堿地選擇甜菜栽培品種提供更詳盡的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

不同種類(lèi)中性鹽對(duì)甜菜幼苗的影響存在差異。在水培條件下，Na2SO4脅迫對(duì)甜菜幼苗的影響大于NaCl脅迫。對(duì)光合作用和抗氧化系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析，Na2SO4脅迫對(duì)甜菜光合作用抑制及氧化損傷更嚴(yán)重，混合鹽次之，NaCl較輕。