生化湯對產(chǎn)后氣虛血瘀大鼠靜脈血栓栓塞癥的防治機(jī)制研究

何 玨，郝小白，張 燕，徐 妍，李 虹，蓋 云，婁 玉， 朱 怡

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院，上海 200137；2. 上海和睦家新城醫(yī)院，上海 201206)

靜脈血栓栓塞癥是指血液在靜脈內(nèi)不正常地凝結(jié)，使血管完全或不完全阻塞，屬靜脈回流障礙性疾病，包括深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥，其形成的基本要素為高凝狀態(tài)、血管內(nèi)皮損傷和靜脈血流淤滯。孕產(chǎn)婦靜脈血栓栓塞癥的發(fā)病率與病死率顯著高于同齡非孕產(chǎn)婦，其中產(chǎn)后靜脈血栓栓塞癥的發(fā)病率為0.08%～0.71%[1-4]，因此，產(chǎn)科靜脈血栓栓塞癥日益被重視。本病常急性發(fā)作，以下肢深靜脈血栓形成最為常見。產(chǎn)后給予低分子肝素抗凝治療是首選抗栓預(yù)防方法，但抗凝治療需長期按時皮下注射，并動態(tài)檢測部分活化凝血酶原時間(APTT)，調(diào)整藥物維持劑量，因此許多產(chǎn)婦在產(chǎn)褥期較難接受。中醫(yī)古籍雖無靜脈血栓栓塞癥相對應(yīng)病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可屬“脈痹”“瘀血流注”等范疇。明醫(yī)家王肯堂在《證治準(zhǔn)繩》中記載婦女產(chǎn)后“腰間腫，兩腿尤甚，此瘀血滯于經(jīng)絡(luò)”，瘀血“流注四肢或注股內(nèi)，痛如錐刺或兩股腫痛”，首次記錄了女子產(chǎn)后下肢深靜脈血栓形成的醫(yī)案，并以活血祛瘀為治。同期醫(yī)家張介賓也在 《景岳全書》中有“產(chǎn)后瘀血流注……氣凝血聚為患也”的類似記載。清唐容川在《血證論》中用“瘀血流注”來定義該病，描述了因?yàn)轲鲅鴮?dǎo)致肢體疼痛腫賬的特點(diǎn)，并指出“瘀血流注，亦發(fā)腫脹，乃血變水之證”，“瘀血流注，四肢疼痛腫脹，宜化去瘀血，消利腫脹”。諸醫(yī)家普遍認(rèn)為，靜脈血栓栓塞癥的病機(jī)中血瘀貫穿始終，炎癥反應(yīng)可能是啟動血瘀證變化和血栓形成的重要因素[5-6]。生化湯是經(jīng)典名方，該方除可增強(qiáng)子宮平滑肌收縮外，還具有較強(qiáng)的抗炎、抗凝作用[7-10]。因此，本研究從細(xì)胞因子角度探討了生化湯對產(chǎn)后氣虛血瘀大鼠靜脈血栓栓塞的防治效果及作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠36只，鼠齡10周，體重(200±50)g，購于中國科學(xué)院上海藥物研究所實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：20170012010215。SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，動物處置按相關(guān)倫理規(guī)定。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑、儀器 生化湯(由當(dāng)歸、川芎、炮姜、桃仁、炙甘草組成)由萬仕誠藥業(yè)有限公司提供,根據(jù)人和動物間體表面積折算的等效劑量比率表折算成臨床成人等效劑量給藥；鹽酸腎上腺素由上海禾豐制藥有限公司提供。二甲苯、乙醇均購自國藥集團(tuán)，冰醋酸購自上海試劑一廠，蘇木素、伊紅、鉀明礬和氧化汞均購自武漢拜意爾公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)檢測試劑盒、細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)檢測試劑盒和D-二聚體檢測試劑盒均購自R&D公司。石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)均購自美國Leica公司，正置熒光顯微鏡為Leica DM 4000B，圖片采集系統(tǒng)為Olympus DP71。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，參照文獻(xiàn)[11]，將雌、雄鼠以2∶1的比例合籠，次晨行陰道沖洗液涂片發(fā)現(xiàn)精子的當(dāng)天為妊娠第1天，未受孕的雌鼠次日再次合籠，最終保證每組孕鼠不少于5只。確定妊娠后,分籠喂養(yǎng)至自然分娩。隨機(jī)取產(chǎn)后正常大鼠5只作為正常組，其余大鼠根據(jù)“勞則耗氣”“寒凝血瘀”的中醫(yī)理論制備產(chǎn)后氣虛血瘀模型：從產(chǎn)后第1天開始每日9:00分批置于水槽內(nèi)(水深約45 cm，將其置于4 ℃冰水中)，以木棒撥打強(qiáng)迫其不斷游泳20 min，浸泡撈出后毛巾擦拭并電動吹風(fēng)機(jī)吹干，放回籠中，注意保溫，連續(xù)14 d。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、生化湯中劑量組、生化湯高劑量組，每組5只。每日8:00—9:00，生化湯中、高劑量組分別給予含生藥13.5 g/(kg·d)和20.25 g/(kg·d)的生化湯藥液灌胃，正常組和模型組均給予等量蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃14 d。末次灌胃30 min后，于各組大鼠背部皮下注射0.8 mL/kg鹽酸腎上腺素。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1舌象 灌胃第14天，參照中醫(yī)觀察法觀察各組大鼠舌色、舌苔和舌質(zhì)，并拍照記錄。舌色分為淡、微紅、淡紅、紅和絳5種，舌苔分為少苔、黃苔、厚白苔3種，舌質(zhì)分為紅蘊(yùn)、細(xì)嫩、干澀和濕膩4種；采用非臨床研究組織病理圖像數(shù)據(jù)自動定量分析管理系統(tǒng)對舌象圖像進(jìn)行分析，測定舌乳頭密度、菌狀乳頭密度、頂端舌苔厚度和底端舌苔厚度。

1.4.2血清TNF-α、VEGF、ICAM-1和D-二聚體水平 鹽酸腎上腺素注射后立即處死各組大鼠，腹腔靜脈采血，使用相應(yīng)的檢測試劑盒檢測TNF-α、VEGF、ICAM-1和D-二聚體水平。

1.4.3子宮組織HE染色情況 收集各組大鼠子宮，進(jìn)行石蠟包埋、切片，對切片進(jìn)行HE染色，在熒光顯微鏡下觀察和拍照。

2 結(jié) 果

2.1各組產(chǎn)后大鼠肉眼觀察舌象表現(xiàn) 正常組大鼠舌色淡，舌苔少苔，均勻鋪被，舌質(zhì)紅蘊(yùn)；模型組大鼠舌色絳色，舌苔厚白，舌質(zhì)濕膩；生化湯中劑量組大鼠舌色紅，舌苔少，舌質(zhì)細(xì)嫩；生化湯高劑量組大鼠舌色淡紅，舌苔少，舌質(zhì)細(xì)嫩。見圖1。

圖1 正常組和產(chǎn)后氣虛血瘀各組大鼠干預(yù)14 d后舌象

2.2各組產(chǎn)后大鼠鏡下觀察舌象病理情況 與正常組比較，模型組大鼠的舌乳頭密度和菌狀乳頭密度均明顯降低(P均<0.05)，頂端舌苔和底端舌苔厚度均明顯增厚(P均<0.05)；與模型組比較，生化湯中、高劑量組大鼠的舌乳頭密度和菌狀乳頭密度均明顯增高(P均<0.05)，頂端舌苔和底端舌苔厚度均明顯變薄(P均<0.05)，生化湯中劑量組與生化湯高劑量組各項(xiàng)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和產(chǎn)后氣虛血瘀各組大鼠400倍鏡下舌象病理情況

2.3各組產(chǎn)后大鼠血清TNF-α、VEGF、ICAM-1及D-二聚體水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、VEGF、ICAM-1、D-二聚體水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，生化湯中、高劑量組均明顯低于模型組(P均<0.05)，且生化湯高劑量組均明顯低于生化湯中劑量組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 正常組和產(chǎn)后氣虛血瘀各組大鼠干預(yù)14 d后血清TNF-α、VEGF、ICAM-1、D-二聚體水平

2.4各組產(chǎn)后大鼠子宮HE染色表現(xiàn) 正常組大鼠子宮切片中無靜脈血栓栓塞形成，模型組大鼠子宮切片中見靜脈血栓栓塞形成，生化湯中、高劑量組中均未見明顯靜脈血栓栓塞形成。見圖3。

圖3 正常組和產(chǎn)后氣虛血瘀各組大鼠干預(yù)14 d后子宮組織HE染色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

產(chǎn)婦分娩過程中往往伴隨麻醉鎮(zhèn)痛、剖宮產(chǎn)、產(chǎn)褥期長期臥床等因素，產(chǎn)后出現(xiàn)下肢靜脈血栓概率增加，若不及時干預(yù)，待血栓形成脫落，便危及生命。“治未病”理論最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是中醫(yī)學(xué)重要的防治思想?！拔床∠确馈薄凹炔》雷儭笔瞧浠竞诵?，強(qiáng)調(diào)通過節(jié)飲食、慎起居、暢情志及膳食、藥物等多種治療方法，調(diào)節(jié)身體氣血陰陽平衡，達(dá)到“正氣存內(nèi)，邪不可干”的目的。從臨床實(shí)踐來看，“治未病”理念體現(xiàn)在防治疾病于未生、未成、未發(fā)、未傳和未變等多個方面[12]。因此從病因入手，積極改善體質(zhì)，消除疾病誘因，可防止疾病因子對人體的侵襲，達(dá)到預(yù)防疾病的目的。

中醫(yī)理論認(rèn)為婦人產(chǎn)后處于“血不足、氣亦虛”的狀態(tài)，因產(chǎn)時耗氣、汗出，產(chǎn)傷或失血過多，產(chǎn)婦元?dú)馐軗p，氣血不足，百脈空虛；宮內(nèi)瘀血胞衣內(nèi)阻，舊血不去，新血不得歸經(jīng)。因此，產(chǎn)后病是在氣血津液虛損的基礎(chǔ)上發(fā)生的，故具有“多虛多瘀”的病理特點(diǎn)，虛為本,瘀為標(biāo)。且產(chǎn)后腠理疏松，陽氣不足，風(fēng)寒外侵，陰寒內(nèi)盛，故又見血虛寒凝，瘀血內(nèi)停，則瘀更甚，形成虛-寒-瘀的惡性循環(huán)。因此，氣虛血瘀是產(chǎn)后病的病理本質(zhì)，臨證多見面色白、少氣懶言、神疲乏力、少腹疼痛、畏風(fēng)畏寒、舌質(zhì)紫暗、苔厚膩、脈細(xì)澀等。相關(guān)研究表明，血瘀與炎癥關(guān)系密切，血瘀證的病理因素包括微循環(huán)改變、炎癥損傷、代謝障礙及組織增生等，其中炎癥損傷導(dǎo)致的滲出、變質(zhì)、增生在血瘀證的病理改變中有著重要的意義[13]。在形成血瘀證的過程中，炎癥因子可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，造成內(nèi)皮損傷，影響血管通透性，導(dǎo)致炎癥的滲出、增生，使血小板活化致血栓形成，亦可直接引起局部的多核白細(xì)胞聚集和激活釋放炎癥介質(zhì)，并通過誘導(dǎo)黏附因子、白細(xì)胞介素、前列腺素E2等的合成與釋放進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，造成局部血液循環(huán)障礙(血瘀) 程度的加重[14-15]。

明清以來，眾多醫(yī)家主張“產(chǎn)后多虛、產(chǎn)后多瘀、產(chǎn)后多寒”的病因病機(jī)，提出“宜補(bǔ)、宜化、宜溫”的治法治則，以溫養(yǎng)立論。古方生化湯具有養(yǎng)血祛瘀、溫經(jīng)止痛之功效。方中重用當(dāng)歸、桃仁補(bǔ)血活血，化瘀生新；川芎活血行氣止痛；炮姜溫經(jīng)散寒止痛；炙甘草調(diào)和諸藥。此方取義于產(chǎn)后血虛，本當(dāng)培補(bǔ)，然瘀血不去，新血不生，治宜養(yǎng)血化瘀，使新血生，瘀血化，故名“生化”，被稱為“產(chǎn)后圣藥”。胡小勤[16]實(shí)驗(yàn)研究表明，生化湯可以抑制大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)和誘生型一氧化氮合酶(iNOS)的合成，具有明顯抗血栓作用。之后的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生化湯能明顯降低大鼠的血小板黏附性，減輕血栓濕重，抑制體外血栓形成，可改善大鼠子宮微循環(huán)，具有良好的活血化瘀及抗血栓形成作用[17-18]。梁思愛等[19]研究發(fā)現(xiàn)，空氣波壓力循環(huán)治療儀聯(lián)合生化湯治療剖宮產(chǎn)后下肢深靜脈血栓的效果優(yōu)于單獨(dú)使用儀器治療。對生化湯組成成分的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸中主要成分阿魏酸鈉可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NF-kB的活化，抑制由TNF-α引起的ICAM-1含量升高[20]；川芎中主要成分川芎嗪可以抑制腦缺血再灌注后TNF-α的表達(dá)，從而抑制黏附分子和iNOS的表達(dá)[21]。

中醫(yī)診治以望、聞、問、切四診辨證施治為特色，中醫(yī)舌診在辨證用藥上至關(guān)重要。氣虛寒凝血瘀證舌象多以舌質(zhì)紫暗、瘀斑，舌底絡(luò)脈迂曲，舌苔白厚膩，邊有齒印等為特征。本實(shí)驗(yàn)肉眼觀察到，產(chǎn)后氣虛血瘀大鼠經(jīng)生化湯干預(yù)后舌質(zhì)由瘀紫轉(zhuǎn)紅潤、舌苔由厚膩轉(zhuǎn)薄白，微病理顯示舌乳頭密度和菌狀乳頭密度增高，頂端舌苔和底端舌苔厚度變薄，體現(xiàn)血瘀本質(zhì)的改善。另外生化湯中、高劑量組血清TNF-α、VEGF、ICAM-1、D-二聚體水平均明顯低于模型組，子宮切片中無明顯靜脈血栓。表明生化湯可同時抑制炎癥因子和凝血因子釋放，抑制機(jī)體“炎癥”和“凝血”兩大生理性防御系統(tǒng)的功能亢進(jìn)，從而改善產(chǎn)后瘀、虛的病理本質(zhì)，防治產(chǎn)后靜脈血栓栓塞癥。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。