益腸通秘湯對便秘小鼠菌群多樣性及腸道Occludin表達(dá)的影響

黃 玲,潘 姣,石鎮(zhèn)陽,林愛珍

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430065；2. 岳陽市人民醫(yī)院，湖南 岳陽 414100；3. 湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430065)

便秘主要以大便干結(jié)、排便次數(shù)減少和排便困難為主要表現(xiàn)，中老年人多發(fā)，不僅影響患者日常生活，嚴(yán)重者還可發(fā)展成結(jié)腸黑變病、結(jié)腸癌等[1]?，F(xiàn)代研究已經(jīng)證明便秘的發(fā)病受飲食、遺傳、情緒的影響，同時(shí)與腸道菌群的關(guān)系也十分密切，便秘發(fā)生時(shí)腸道菌群的多樣性破壞、促進(jìn)腸道蠕動的有益菌減少、破壞腸道屏障功能的致病菌增加[2]。因此如何改善和利用腸道菌群成為了治療便秘的新靶點(diǎn)。益腸通秘湯是湖北省中醫(yī)院肛腸科林愛珍教授從醫(yī)多年治療便秘的自擬方劑，在臨床應(yīng)用中顯示效果良好。但益腸通秘湯能否基于腸道菌群發(fā)揮緩解便秘，保護(hù)腸道屏障的作用尚未可知。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠便秘模型，針對益腸通秘湯與腸道菌群之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 8周齡Balb/c小鼠40只，體重18～21 g，由湖北省疾控中心提供，動物合格證號：SYXK2020-0002。恒溫、恒濕飼養(yǎng)。動物實(shí)驗(yàn)獲得湖北省中醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器、藥物及試劑 熒光顯微鏡(Leica DMIL顯微鏡)，烘箱(杭州藍(lán)天儀器有限公司)。益腸通秘湯組成：肉蓯蓉15 g、牛膝10 g、當(dāng)歸10 g、升麻10 g、肉桂5 g、制首烏10 g、生白術(shù)20 g、枳實(shí)10 g、麻仁15 g、黃芪10 g，由湖北省中醫(yī)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。按中藥常用煎煮要求，加蒸餾水煎汁后濃縮成濃度相當(dāng)于生藥 900 mg/mL 水煎液，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩Ｄ潮乩徸猿啥伎岛胨帢I(yè)集團(tuán)股份有限公司。免疫組化試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；緊密連接蛋白(Occludin)抗體購自Santa Cruz Biotechnology，按1∶200稀釋；活性炭和洛哌丁胺購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將40只Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常組、便秘組、益腸通秘湯組、莫沙必利組，每組10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，便秘組、益腸通秘湯組和莫沙必利組連續(xù)每日皮下注射洛哌丁胺10 mg/kg 2周建立便秘模型。第3周開始，益腸通秘湯組給予益腸通秘湯14 g/(kg·d)(按臨床常用劑量換算)灌胃，莫沙必利組給予枸櫞酸莫沙必利5 g/(kg·d)(參考文獻(xiàn)[3]確定劑量)灌胃，正常組及便秘組給予等量生理鹽水灌胃，均持續(xù)2周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1糞便數(shù)量及糞便含水量 灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，分別收集單只小鼠3 h內(nèi)新鮮糞便，計(jì)數(shù)并稱重，60 ℃干燥12 h后再次稱重，計(jì)算糞便數(shù)量及糞便含水量。

1.4.2活性炭推進(jìn)長度和腸道推進(jìn)率 末次灌胃結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5只小鼠，均灌胃0.2 mL 10%活性炭，30 min后將小鼠麻醉處死，取胃及小腸組織，測量小腸的全長及活性炭在小腸所經(jīng)過的最遠(yuǎn)距離即活性炭推進(jìn)長度，計(jì)算每只小鼠的腸道推進(jìn)率。腸道推進(jìn)率=活性炭推進(jìn)長度/小腸全長×100%。

1.4.3腸道菌群測序 收集每組剩余小鼠結(jié)腸內(nèi)容物，通過16S rDNA的V3～V4區(qū)擴(kuò)增片段進(jìn)行二代高通量核酸測序，分析腸道菌群的組成、物種豐富度、多樣性等。按照Fast DNATMSPIN Kit(MP Biomedicals)的方案提取糞便樣本的基因組DNA，用于擴(kuò)增16S rDNA基因的V3～V4高變異區(qū)，測序由北京全威基因科技有限公司在Illumina MiSeq平臺(Illumina, San Diego)上進(jìn)行。

1.4.4結(jié)腸上皮中Occludin表達(dá)情況 取每組剩余小鼠結(jié)腸組織，4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織上端，常規(guī)脫水石蠟包埋切片后進(jìn)行免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜中Occludin表達(dá)情況并拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠糞便數(shù)量及糞便含水量比較 便秘組小鼠糞便數(shù)量及糞便含水量均明顯低于正常組(P均<0.05)；益腸通秘湯組和莫沙必利組小鼠糞便數(shù)量和糞便含水量均明顯高于便秘組(P均<0.05)，且益腸通秘湯組均明顯高于莫沙必利組(P均<0.05)。見表1。

表1 正常組和便秘各組小鼠糞便數(shù)量及糞便含水量比較

2.2各組小鼠活性炭推進(jìn)長度和腸道推進(jìn)率比較 各組小鼠小腸總長比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；便秘組小鼠活性炭推進(jìn)長度和腸道推進(jìn)率均明顯低于正常組(P均<0.05)，益腸通秘湯組小鼠活性炭推進(jìn)長度、腸道推進(jìn)率及莫沙必利組小鼠腸道推進(jìn)率均明顯高于便秘組(P均<0.05)，且益腸通秘湯組小鼠腸道推進(jìn)率明顯高于莫沙必利組(P<0.05)，莫沙必利組小鼠小鼠活性炭推進(jìn)長度與便秘組及益腸通秘湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和便秘各組小鼠活性炭推進(jìn)長度和腸道推進(jìn)率比較

2.3各組小鼠腸道菌群情況

2.3.1結(jié)腸糞便中菌群α多樣性 便秘組小鼠Chao1和shannon水平均明顯低于正常組(P均<0.05)，益腸通秘湯組小鼠Chao1和shannon水平均明顯高于便秘組(P均<0.05)，莫沙必利組小鼠Chao1和shannon水平與便秘組及益腸通秘湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1。

圖1 正常組和便秘各組小鼠腸道菌群α多樣性Chao1和shannon水平

2.3.2結(jié)腸糞便菌群屬水平細(xì)菌相對豐度 便秘組小鼠結(jié)腸糞便中Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella和Akkermansia相對豐度均明顯低于正常組(P均<0.05)，Coprococcus和Clostridium相對豐度均明顯高于正常組(P均<0.05)。益腸通秘湯組小鼠結(jié)腸糞便中Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella和Akkermansia相對豐度均明顯高于便秘組(P均<0.05)，Coprococcus和Clostridium相對豐度均明顯低于便秘組(P均<0.05)；莫沙必利組結(jié)腸糞便中Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Akkermansia、Coprococcus和Clostridium相對豐度與便秘組及益腸通秘湯組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖2。

圖2 正常組和便秘各組小鼠腸道菌群屬水平代表細(xì)菌相對豐度

2.4各組小鼠結(jié)腸上皮Occludin表達(dá)情況 便秘組小鼠結(jié)腸上皮中Occludin表達(dá)較正常組少；益腸通秘湯組和莫沙必利組Occludin表達(dá)較便秘組多，但莫沙必利組略少于益腸通秘湯組。見圖3。

圖3 正常組和便秘各組小鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白Occludin表達(dá)情況(免疫熒光染色)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)將“便秘”分為虛秘和實(shí)秘?！吨嗅t(yī)內(nèi)科學(xué)》將實(shí)秘的病機(jī)歸納為胃腸積熱、氣機(jī)郁滯和陰寒積滯，而虛秘主要是由氣、血、陰、陽的虧虛引起。目前臨床多發(fā)的便秘與脾虛中氣弱而腸道推動功能不足和腎虛陽氣弱而溫煦腸道能力下降密切相關(guān)。益腸通秘湯加減方具有溫腎健脾、益腸通便的攻補(bǔ)兼施作用，臨床上對多種類型便秘均有治療作用，尤其是對脾腎陽虛型便秘效果顯著。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，脾虛型疾病多伴隨腸道菌群的多樣性減少，腸道菌群的失調(diào)會導(dǎo)致功能性便秘，便秘的發(fā)生也會引起腸道菌群紊亂[4-5]。腸道菌群中的產(chǎn)芽孢厭氧菌和雙歧桿菌能夠促進(jìn)胃腸道的蠕動，改善腸道內(nèi)免疫環(huán)境，緩解便秘[6]，乳酸桿菌、乳酸球菌、雙歧桿菌等多種細(xì)菌的減少可促進(jìn)慢性便秘的發(fā)展[7]。便秘患者菌群測序分析顯示，有益菌如Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Akkermansia相對豐度低于正常人群，而有害菌如Coprococcus和Clostridium相對豐度明顯增加[8]。丁洪匯[9]報(bào)道，加味半夏瀉心湯聯(lián)合莫沙必利能糾正便秘型腸易激綜合征和功能性消化不良重疊患者腸道微生態(tài)紊亂,重建腸道菌群平衡,改善胃腸功能。王琳琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌LPC-F可通過促進(jìn)結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)腸蠕動，緩解便秘癥狀。

本研究采用洛哌丁胺灌胃方法建立小鼠便秘模型，結(jié)果顯示益腸通秘湯和莫沙必利均能改善小鼠糞便含水量和腸道推進(jìn)率，促進(jìn)腸道菌群的多樣性恢復(fù)，增加有益菌Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Akkermansia的相對豐度，降低有害菌Coprococcus、Clostridium的相對豐度，但益腸通秘湯對小鼠糞便含水量、腸道推進(jìn)率及腸道菌群的改善作用較莫沙必利強(qiáng)。這可能由于莫沙必利是促進(jìn)胃腸動力藥物，其主要通過推進(jìn)食物殘?jiān)倪\(yùn)動、減少糞便在結(jié)腸的停留時(shí)間和水分重吸收而治療便秘；而益腸通秘湯中含有的肉蓯蓉、黃芪、火麻仁具有改善腸道菌群、增加雙歧桿菌等益生菌數(shù)量、抑制有害菌的侵害作用[11-13]，這些藥物聯(lián)合應(yīng)用使調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)菌群多樣性恢復(fù)的作用更加明顯。

Occludin與便秘關(guān)系非常密切，Occludin的降解會導(dǎo)致腸道組織緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致便秘的發(fā)生，而且這種改變只發(fā)生在蛋白水平上，mRNA水平并沒有明顯改變[14-15]。便秘發(fā)生時(shí)，Occludin不僅直接被腔內(nèi)蛋白酶降解，而且腸道菌群中有害菌的破壞作用可以直接影響Occludin的表達(dá)，增加腸腔內(nèi)益生菌的豐度可以維持腸道包括Occludin在內(nèi)的緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)腸道屏障功能[8]，而腸屏障功能與腸功能之間存在正相關(guān)的關(guān)系[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，益腸通秘湯可增加腸道中Occludin 的表達(dá)，證實(shí)了腸道菌群對腸屏障功能的保護(hù)作用。

綜上所述，益腸通秘湯可能是通過影響腸道菌群和腸道屏障功能而起到防治便秘的作用，但中藥組方的作用途徑、靶點(diǎn)復(fù)雜，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。