貓傳染性腹膜炎診斷方法研究進展

魏衍全，韋文娟，何 苗，王芳萍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

貓傳染性腹膜炎(Feline Infectious Peritonitis, FIP)是由貓冠狀病毒(Feline Coronavirus, FCoV)引起的一種常見的慢性致死性疾病。一旦貓科動物患上FIP，死亡率極高，而且迄今為止無有效的疫苗可以預(yù)防該病，所以及時診斷和對癥治療是非常有必要的。有些動物醫(yī)院僅使用糞便來檢測有無冠狀病毒的存在就判斷是否患FIP，導(dǎo)致許多貓被誤診。從臨床癥狀上分析，多數(shù)患病貓表現(xiàn)為食欲不振、反復(fù)發(fā)熱、自愈性腹瀉和眼部炎癥，其中濕型FIP占比較高，主要的特征是腹腔積液或者胸腔積液，而干型FIP占比較低，主要的特征表現(xiàn)是神經(jīng)癥狀和血管炎。FIP的診斷非常具有挑戰(zhàn)性，目前還沒有特異性的臨床癥狀或?qū)嶒炇覚z測方法，診斷時要綜合考慮貓的品種、生活史、病史、體格檢查、臨床癥狀、影像學(xué)檢查、血常規(guī)檢查、RT-PCR檢測以及組織病理學(xué)檢查，其中組織病理學(xué)檢查可作為FIP診斷的“金標準”。本文就近年來關(guān)于FIP的診斷以及S基因的突變分析等研究進展進行綜述，通過比較不同診斷方法的特異性和敏感性，總結(jié)這些診斷方法的優(yōu)缺點，為在實際診療中采用準確、高效的方法提供參考。

1 貓傳染性腹膜炎簡況

貓傳染性腹膜炎最早報道于1963年，多數(shù)學(xué)者認為貓傳染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus, FIPV)是FCoV的一種生物學(xué)表型，而另一表型為貓腸道冠狀病毒(Feline Enteric Coronavirus, FECV)。FIPV和FECV都屬于α冠狀病毒，且很難通過外形、基因組來區(qū)分，“體內(nèi)突變”假說認為，F(xiàn)IPV是由FECV在胃腸道中發(fā)生突變而產(chǎn)生，并可引起系統(tǒng)性傳播，是本研究領(lǐng)域廣泛接受的假說，另外一些學(xué)者認為不論是哪種FCoV都可引起貓傳染性腹膜炎。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在單貓環(huán)境中冠狀病毒血清陽性率為12%～16%，在多貓環(huán)境中為24%～87%，在這其中5%～12%感染FCoV的貓將患上FIP，F(xiàn)IP可以在貓的任何年齡段發(fā)病，其中以公貓和純種貓多發(fā)，多數(shù)為兩歲以下發(fā)病。

FIP主要病理特征是化膿性肉芽腫和血管炎，隨著疾病的發(fā)展，臨床表現(xiàn)型可分為濕型FIP(滲出型)和干型FIP(非滲出型)兩種，常見的病變部位有肝臟、脾臟、腎臟、漿膜、腸系膜淋巴結(jié)、腦部、肺臟、眼睛等。臨床顯著癥狀包括呼吸困難、腹水、黃疸、葡萄膜炎，其他癥狀有頑固性發(fā)熱、厭食、嗜睡、共濟失調(diào)和體重減輕。FCoV感染在貓群中非常常見，但是目前通過檢測明確區(qū)分FIPV和FECV是很困難的，特別是干型FIP的確診更加具有挑戰(zhàn)性。鑒于現(xiàn)在還沒有有效的方法治療FIP，所以能夠快速確診FIP顯得至關(guān)重要。

2 貓傳染性腹膜炎的臨床診斷方法

2.1 眼部檢查

患FIP貓的中樞神經(jīng)肉芽腫會引起貓的瞳孔變形、伴有神經(jīng)癥狀、前房渾濁并且有纖維素性滲出物沉積，故眼睛出現(xiàn)葡萄膜炎和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎等視網(wǎng)膜病變。因為房水中存在感染FIPV的巨噬細胞，因此利用免疫細胞化學(xué)技術(shù)可在眼中的巨噬細胞中檢測到FIPV抗原。但是貓眼呈現(xiàn)葡萄膜炎在其他非FIPV病例中也很常見，因此僅以眼睛癥狀不能作為確診FIP的依據(jù)。

2.2 血常規(guī)和生化檢測

血常規(guī)和生化檢測多用于寵物醫(yī)院，F(xiàn)IP患病貓檢測后會發(fā)現(xiàn)其血液學(xué)和生化指標異常，大多數(shù)病例檢查結(jié)果為再生性貧血、淋巴細胞減少和高蛋白血癥，這些結(jié)果只能提示貓患有感染性疾病，但不能確診為FIP，所以僅算作一個FIP診斷佐證。有學(xué)者指出白蛋白(Albumin)與球蛋白(Globulin)的比值(A:G)可用于評估單個病例中FIP的可能性，當A：G比值<0.4時很可能患有FIP，而A：G比值>0.8時不太可能患FIP。關(guān)于A：G比值在FIP診斷中的有效閾值，不同學(xué)者觀點不盡相同。另一項針對FIP低流行率的貓群調(diào)查發(fā)現(xiàn)，A：G比值>0.6可排除FIP，但比值<0.6時無法確診患有FIP，而需要其他診斷依據(jù)來確定是否患有FIP。因此筆者認為A:G比值越低，貓患FIP的概率越大。

2.3 影像學(xué)檢查

采用超聲診斷是否有胸腔或腹腔積液，在一項研究中發(fā)現(xiàn)32%的FIP患病貓(47/146)經(jīng)過超聲檢查發(fā)現(xiàn)腎部顯示髓質(zhì)緣征，14%的FIP患病貓(21/146)經(jīng)過超聲檢查腹部發(fā)現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)腫大。通過影像學(xué)檢查不能最終確診，陰性結(jié)果也不能排除FIP，因此還需進一步的診斷。

2.4 Rivalta實驗方法

本方法可以區(qū)分腹水為漏出液還是滲出液。將8 mL無菌水與50 μL乙酸混勻后再將新鮮的貓腹水小心地滴加到上述混合液中，若腹水附著在液體表面，保持其形狀或緩慢漂浮到底部，則為陽性，若腹水形狀消失并與混合液融合則提示為陰性。如果這個試驗結(jié)果為陰性，那么貓患FIP的可能性不大；如果該試驗結(jié)果為陽性，也并不代表貓一定患上FIP，這時需要結(jié)合其他診斷方法的結(jié)果進行綜合判斷。

3 貓傳染性腹膜炎的實驗室檢測方法

3.1 RT-PCR檢測

利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)可以檢測貓冠狀病毒RNA，但是這種方法只能作為診斷的輔助方法之一，并不能確診，因為RT-PCR一般是利用引物對FCoV基因組高度保守的3’-非翻譯區(qū)進行擴增，以檢測樣本中的貓冠狀病毒，不能區(qū)分FECV和FIPV。

如果RT-PCR能夠量化病毒含量，這對于診斷是非常有幫助的，因為感染FIPV的樣本不僅更容易檢測到FCoV，而且比感染FECV的病毒含量明顯更高。因此，一個RT-PCR陽性且病毒含量很高的結(jié)果提示貓可能患上FIP。Pedersen N C等通過研究發(fā)現(xiàn)，用RT-PCR方法分析大網(wǎng)膜、腸系膜淋巴結(jié)和脾臟樣品是很好的靶標，因為它們的病毒含量特別高。對血液樣本進行RT-PCR分析時，病毒含量很低導(dǎo)致敏感性也偏低，而且檢測血液中的病毒RNA并不能確診為FIP，特異性也不高，所以不建議使用RT-PCR分析血液樣本。DoengesS.J.等研究發(fā)現(xiàn)，與血液相比，使用RT-PCR檢測外周血單個核細胞的敏感性更高。在許多研究中，積液中的病毒含量特別高，特異性很高，而且陽性的RT-PCR結(jié)果會更懷疑是FIP，但是感染了FECV的貓也能檢測到少量的病毒RNA，即使沒有發(fā)生FIP，當炎癥發(fā)生時，F(xiàn)ECV可能會從血液中進入積液中，特別是在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，在沒有患FIP的貓滲出液中檢測到FCoV RNA。利用RT-PCR方法檢測腦脊液中FCoV RNA的特異性為100%，這些研究樣本為經(jīng)過免疫組化等多種檢測確診的貓，至今還沒有報道出有假陽性的結(jié)果。

FCoV復(fù)制和其他RNA病毒一樣也容易出錯，在病毒復(fù)制周期中會發(fā)生堿基突變。通過檢測FCoV的基因突變可能有助于闡明FIP的發(fā)病機制，對FCoV幾種不同基因進行分析，找出可能引起基因突變的關(guān)鍵位點。開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)3abc編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3a、3b和3c，對已患FIP貓和健康貓的FCoV進行測序比較，從患FIP貓的樣本中發(fā)現(xiàn)FIPV含有一個截斷的3c蛋白，而從健康貓的糞便中發(fā)現(xiàn)的FECV通常含有一個完整的3c蛋白。FCoV刺突蛋白(S蛋白)介導(dǎo)病毒進入細胞，它包括一個受體結(jié)合亞基(S1蛋白)和一個介導(dǎo)膜融合亞基(S2蛋白)。有研究認為FCoV S基因的突變可能是引起病毒的細胞趨向性改變的原因，所以闡明S基因中哪些突變導(dǎo)致FECV轉(zhuǎn)變?yōu)镕IPV具有重要的意義。

對健康貓的糞便、患FIP的組織或者腹水中的大量FCoV的S基因進行測序發(fā)現(xiàn)，患FIP貓的病毒基因組第23531和23537位置存在變異，前者變異導(dǎo)致S蛋白的1058位蛋氨酸被亮氨酸(M1058L)所取代，在23537位核苷酸的變異導(dǎo)致S蛋白第1060位的絲氨酸被丙氨酸(S1060A)取代。2013年也有類似的研究報道，F(xiàn)IPV和FECV的S蛋白在弗林蛋白酶裂解位點有差異?？傊?，檢測各個基因的突變?yōu)殍b別FIPV和FECV提供了新的方向，有利于進一步的診斷。

3.2 RT-LAMP檢測

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)是一種新型的分子檢測方法，具有快速、簡便等優(yōu)點。Stranieri A等建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法檢測FCoV，對27只貓的32個樣本進行病毒RNA提取和常規(guī)RT-PCR，并在RT-PCR擴增片段內(nèi)設(shè)計6個RT-LAMP引物，在63 ℃、1 h的條件下篩選最佳引物。結(jié)果顯示，建立的新方法總體特異性為100%，但羥基萘酚藍和瓊脂糖凝膠的靈敏度僅達到為54.5%和50%。所以RT-LAMP適合確診病毒含量高的樣品，但不適于排除病毒含量低的樣品。但這項技術(shù)不需要PCR儀等變溫設(shè)備，操作簡單，特異性強，出結(jié)果快速，但存在靈敏度低的缺點。

3.3 組織病理和免疫組化檢測

對于難以確診的病例可以采取侵襲性、創(chuàng)傷性的方法采集樣本，然后進行組織病理和免疫組化實驗，這是目前國際上公認的FIP診斷的金標準，用于顯示受損組織中是否存在病毒，但是檢測所需要的時間較長，只能在專業(yè)的實驗室進行，有時候還會加重病情。有學(xué)者將腸系膜淋巴結(jié)等組織樣品固定后切片，通過免疫細胞化學(xué)對組織樣品進行染色，再利用病毒抗原與酶標抗體的特異性反應(yīng)，最后加入底物經(jīng)過顏色變化來判定結(jié)果，但這種方法存在檢測靈敏度低的缺點。針對FIP引起的巨噬細胞浸潤等組織病理變化做免疫組化試驗，敏感性可達到97%～100%。

4 展望

FIP診斷不能僅僅依靠單一方法的診斷結(jié)果，重要的是要考慮疑似病例的體征、病史、臨床癥狀和臨床病理變化，應(yīng)根據(jù)臨床情況結(jié)合其他檢測結(jié)果，特別是能夠直接檢測病毒RNA的結(jié)果。檢測貓冠狀病毒的抗體對診斷沒有幫助，如果發(fā)現(xiàn)積液應(yīng)該做進一步檢測分析，對于有神經(jīng)癥狀的貓，應(yīng)該對腦脊液進行分析。

對于有積液的貓應(yīng)進行實驗室分析，通過RT-PCR檢測積液有助于確診，特別是在病毒含量很高的情況下。對于沒有明顯積液的貓，應(yīng)該將不同類型的樣本合并分析，超聲引導(dǎo)穿刺腸系膜淋巴結(jié)、脾臟、肝臟等不同器官，并作為RT-PCR的樣本材料。如果基因突變在RT-PCR陽性樣本中檢測到，并且病毒拷貝數(shù)很高，那么高度懷疑為FIP。在RT-PCR陰性或缺乏S基因突變的病例中，基于臨床癥狀和其他實驗室檢測結(jié)果FIP的懷疑度仍很高，則必須考慮組織病理切片和免疫組化實驗，以便對組織樣本做出最終診斷。