依托咪酯通過調(diào)控LncRNA CDKN2B-AS1/miR-199a-5p表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

姜崇發(fā) 王秋紅 劉建 李印玉 馬增瑞 李治松

(1周口市中心醫(yī)院麻醉科，河南 周口 466000；2牡丹江心血管病醫(yī)院麻醉科；3廣州前海人壽醫(yī)院麻醉科；4寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科；5鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科)

麻醉藥物可影響腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為，近年來，研究表明麻醉藥物可有效提高膠質(zhì)瘤治療效果〔1〕。但膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，而放化療可抑制腫瘤生長，但耐藥性與放射抵抗性可降低治療效果〔2〕。因而探索麻醉藥物對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制具有重要意義。研究表明依托咪酯可有效治療宮頸癌及其他腫瘤，并可降低老年患者心血管風(fēng)險(xiǎn)〔3,4〕。依托咪酯還可抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移〔5〕。但依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響尚未可知。長鏈非編碼RNA CDKN2B-AS1(LncRNA CDKN2B-AS1)在肝癌中高表達(dá)，敲低其表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔6〕。但關(guān)于CDKN2B-AS1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響尚未可知。starBase預(yù)測顯示微小RNA-199a-5p(miR-199a-5p)可能是CDKN2B-AS1的靶基因，研究表明miR-199a-5p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-199a-5p過表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲〔7〕。但膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中CDKN2B-AS1與miR-199a-5p是否存在靶向調(diào)控作用尚未可知。關(guān)于依托咪酯是否通過調(diào)控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲尚未可知。本研究主要探討依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，初步分析其對(duì)CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的調(diào)控作用機(jī)制及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 2017年6月至2018年10月于周口布中心醫(yī)院就診的膠質(zhì)瘤患者20例，所有患者經(jīng)病理證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤，其中男11例，女9例，年齡50～70歲，平均(65.27±5.13)歲，腫瘤組織與癌旁組織切除后置于液氮中凍存，術(shù)后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存待測。

1.2材料與試劑 依托咪酯(依托咪酯)購自上海生工生物工程股份有限公司。膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251購自美國ATCC公司。DMEM培養(yǎng)基與胰蛋白酶購自美國Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、結(jié)晶紫溶液、蛋白提取試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA) 蛋白定量檢測試劑盒購自美國Sigma公司；CDKN2B-AS1小干擾RNA(si-CDKN2B-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-199a-5p模擬物(mimics)、陰性對(duì)照(miR-NC)均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000購自上海潤成生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自武漢艾美捷科技有限公司；Transwell小室與基質(zhì)膠均購自美國BD公司；細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、p21一抗購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)處理與分組 取對(duì)數(shù)生長期膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，用不同濃度(0.5 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml)的依托咪酯處理，隨機(jī)分為Con組(未經(jīng)任何處理的細(xì)胞)、依托咪酯0.5 μg/ml組(含有終濃度為0.5 μg/ml的依托咪酯培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h)、依托咪酯1.0 μg/ml組(含有終濃度為1.0 μg/ml的依托咪酯培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h)、依托咪酯2.0 μg/ml組(含有終濃度為2.0 μg/ml的依托咪酯培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h)〔8〕。采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞抑制率，選用作用效果最好的依托咪酯劑量組進(jìn)行后續(xù)研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分別檢測抑制CDKN2B-AS1表達(dá)與miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，實(shí)驗(yàn)分組為si-NC組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-NC)、si-CDKN2B-AS1組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-CDKN2B-AS1)、miR-NC組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-199a-5p組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimics)。為證實(shí)依托咪酯可通過調(diào)控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p軸發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)分組為依托咪酯+pcDNA組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA 48 h后使用含有終濃度為40 μmol/L的依托咪酯處理24 h)、依托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1組(細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-CDKN2B-AS1 48 h后使用含有終濃度為40 μmol/L的依托咪酯處理24 h)。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中CDKN2B-AS1、miR-199a-5p表達(dá)水平 采用Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，CDKN2B-AS1正向引物：5'-TGTACTTAACCACTGGACTACCTGCC-3'，反向引物：5'-CATTCTGATTCAACAGCAGAGATCAAAG-3'；GAPDH正向引物：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，反向引物：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；miR-199a-5p正向引物：5'-TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3'，反向引物：5'-GCTGTCAACGATACGCTACGT-3'；U6正向引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，反向引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。參照試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，其中以cDNA為模板，反應(yīng)條件：95℃ 2 min(循環(huán)1次)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s(數(shù)字和攝氏度中間需要空格)(循環(huán)40次)。CDKN2B-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-199a-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CDKN2B-AS1、miR-199a-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3MTT比色法檢測細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入DMEM培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液接種于96孔板(3×104個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h，按照“1.3.1”分組處理，每孔加入質(zhì)量濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室溫孵育4 h，棄上清，加入DMSO(150 μl/孔)，勻速振蕩10 min充分混勻，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為490 nm處各孔吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=〔1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)〕×100%。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移與侵襲 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)液預(yù)先凍存，用預(yù)冷的培養(yǎng)液按照9∶1的比例稀釋基質(zhì)膠，基質(zhì)膠稀釋液平鋪于Transwell小室上室的基底面，置于37℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h。取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)；取600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液置于Transwell小室的下室，放入37℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，PBS洗滌，多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，棉簽擦掉未轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入不含胎牛血清的培養(yǎng)液制備單細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察遷移細(xì)胞數(shù)。

1.3.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測 starBase預(yù)測 CDKN2B-AS1與miR-199a-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，將結(jié)合位點(diǎn)及其突變位點(diǎn)分別插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-CDKN2B-AS1與突變型載體MUT-CDKN2B-AS1，取對(duì)數(shù)生長期U251細(xì)胞，miR-199a-5p mimics分別與WT-CDKN2B-AS1、MUT-CDKN2B-AS1共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，miR-NC分別與WT-CDKN2B-AS1、MUT-CDKN2B-AS1共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.6Western印跡檢測CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白表達(dá) 收集各組U251細(xì)胞，加入蛋白裂解液〔1 ml放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)、1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.1% 抑肽酶〕提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白上樣量加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，沸水中煮10 min蛋白變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳反應(yīng)條件：80 V 30 min，120 V 90 min(單位之間加空格)，根據(jù)marker位置切膠并應(yīng)用濕轉(zhuǎn)膜儀將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入蛋白一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育24 h，TBST洗滌，加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，滴加ECL，曝光顯影，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)及ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，Kruska-WallisH檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1LncRNA CDKN2B-AS1和miR-199a-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 與癌旁組織相比，膠質(zhì)瘤組織中CDKN2B-AS1的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，而miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 CDKN2B-AS1和miR-199a-5p在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中CDKN2B-AS1和miR-199a-5p表達(dá)的影響 與Con組相比，依托咪酯0.5 μg/ml組、依托咪酯1.0 μg/ml組、依托咪酯 2.0 μg/ml組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中CDKN2B-AS1的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，不同劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中CDKN2B-AS1和miR-199a-5p表達(dá)的影響

2.3依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的影響 與Con組相比，依托咪酯0.5 μg/ml組、依托咪酯1.0 μg/ml組、依托咪酯 2.0 μg/ml組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251抑制率顯著升高，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低，p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，隨著依托咪酯使用劑量的增加而顯著變化(均P<0.05)，其中依托咪酯2.0 μmol/L時(shí)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251抑制率顯著高于其他劑量組(P<0.05)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著少于其他劑量組(P<0.05)，因而選用依托咪酯2.0 μmol/L進(jìn)行后續(xù)研究，見圖1、表3、圖2。

表3 依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的影響

圖1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的遷移侵襲(結(jié)晶紫染色，×200)

1～4：Con組、依托咪酯0.5 μg/ml組、依托咪酯1.0 μg/ml組、依托咪酯2.0 μg/ml組圖2 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4抑制CDKN2B-AS1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的影響 與si-NC組相比，si-CD-KN2B-AS1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251抑制率顯著增加(P<0.05)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表4 抑制CDKN2B-AS1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的影響

2.5miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-199a-5p組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251抑制率顯著增加(P<0.05)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，而p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表5。

表5 miR-199a-5p過表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的影響

圖4 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6CDKN2B-AS1靶向調(diào)控miR-199a-5p的表達(dá) starBase預(yù)測顯示CDKN2B-AS1的序列中含有與miR-199a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖5。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-199a-5p組MUT-CDKN2B-AS1與miR-NC組比較，熒光素酶活性差異無顯著性；miR-199a-5p組WT-CDKN2B-AS1與miR-NC組比較熒光素酶活性差異顯著(P<0.001)，見表6。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與si-NC組(1.00±0.09)相比，si-CDKN2B-AS1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著升高(2.26±0.23，P<0.05)；與pcDNA組(1.01±0.08)相比，pcDNA-CDKN2B-AS1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著降低(0.39±0.04，P<0.05)。

圖5 CDKN2B-AS1的序列中含有與miR-199a-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.7CDKN2B-AS1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了依托咪酯(2.0 μg/ml)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的作用 與依托咪酯+pcDNA組相比，依托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1組膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251抑制率顯著降低(P<0.05)，遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，p21蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖6、表7。

1～4:Con組，依托咪酯組，依托咪酯+pcDNA組，托托咪酯+pcDNA-CDKN2B-AS1組圖6 Western印跡檢測增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表7 CDKN2B-AS1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了依托咪酯對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、遷移侵襲的作用

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤是臨床常見腦部惡性腫瘤之一，根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)可將腦膠質(zhì)瘤分為低級(jí)別與高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤，由于早期診斷準(zhǔn)確率較低導(dǎo)致患者錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，患者治療后生存期較短〔9〕。因而深入分析影響膠質(zhì)瘤遷移及侵襲的分子機(jī)制具有重要意義。LncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，研究表明其可作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)靶向結(jié)合miRNA而間接調(diào)控下游靶基因表達(dá)從而促進(jìn)或抑制膠質(zhì)瘤遷移及侵襲〔10,11〕。

依托咪酯可通過下調(diào)(PI3K/Akt)信號(hào)通路的活性而抑制垂體瘤細(xì)胞的遷移〔12〕。研究報(bào)道指出依托咪酯是一種麻醉藥物并可快速通過血腦屏障，研究表明鎮(zhèn)靜類麻醉藥物可抑制多種腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲從而發(fā)揮抗腫瘤作用〔13,14〕。但依托咪酯對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響尚未可知。本研究結(jié)果說明依托咪酯可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。研究表明CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21蛋白與細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力密切相關(guān)，其中p21可通過抑制CyclinD1與CDK形成復(fù)合物而誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，MMP-2、MMP-9屬于MMPs類，其在腫瘤中呈高表達(dá)并可增強(qiáng)細(xì)胞遷移及侵襲能力〔15,16〕。本研究結(jié)果提示依托咪酯可能通過抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)及促進(jìn)p21表達(dá)而減弱膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

CDKN2B-AS1可通過靶向miR-411-3p及調(diào)控HIF-1a/VEGF/P38途徑而促進(jìn)卵巢癌發(fā)生及發(fā)展〔17〕。干擾CDKN2B-AS1的表達(dá)可通過上調(diào)miR-181a-5p/TGFβI軸從而抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔18〕。本研究結(jié)果提示抑制CDKN2B-AS1的表達(dá)可降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)CDKN2B-AS1可負(fù)向調(diào)控miR-199a-5p的活性，研究表明miR-199a-5p可通過下調(diào)ERK5的表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲〔19〕。Zhou等〔20〕研究表明miR-199a-5p通過靶向CCR7抑制膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。與上述研究報(bào)道相似，本研究結(jié)果顯示miR-199a-5p在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平降低，miR-199a-5p過表達(dá)后可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。本研究結(jié)果提示依托咪酯可通過下調(diào)CDKN2B-AS1的表達(dá)及上調(diào)miR-199a-5p的表達(dá)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

綜上，依托咪酯可抑制膠質(zhì)瘤生長及轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制主要是通過調(diào)控CDKN2B-AS1/miR-199a-5p的表達(dá)從而發(fā)揮作用，為臨床合理用藥及研發(fā)藥物提供新方向，可為深入探討吩噻嗪類藥物對(duì)腫瘤的作用機(jī)制提供研究依據(jù)。