非小細(xì)胞肺癌血漿天然CD25 抗體及FOXP3 抗體的表達(dá)變化及其作為診斷標(biāo)志物的探討

趙 歡 張 萱 李慶海 （青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院內(nèi)分泌科，青島 266071）

肺癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，也是最常見的死亡原因，其病死率在同期惡性腫瘤中高居榜首［1］。肺癌最常見的病理類型是非小細(xì)胞肺癌，約占所有肺癌病例數(shù)的85%［2-3］。雖然放療、化療及分子靶向藥物等對(duì)改善患者預(yù)后發(fā)揮了一定的積極作用，但目前肺癌的總生存率仍不超過(guò)15%［4］。約2/3 的肺癌患者在確診時(shí)已屬晚期［5］。因此，早期診斷對(duì)降低肺癌病死率至關(guān)重要。若患者在Ⅰ、Ⅱ期被診斷，五年生存率將提高至50%，若癌灶較局限時(shí)即被檢測(cè)到，五年生存率則高達(dá)80%［6］。因此，尋找一種可用于肺癌早期診斷的生物標(biāo)志物對(duì)于改善NSCLC預(yù)后具有重要的臨床意義。

天然抗體（natural antibody，NAbs）是在完全缺乏外源性抗原刺激下，無(wú)菌小鼠及健康人血清中自發(fā)產(chǎn)生的抗體［7-8］。絕大部分天然抗體由B-1細(xì)胞經(jīng)T 細(xì)胞非依賴性途徑產(chǎn)生［9-10］。天然抗體能夠識(shí)別并清除機(jī)體內(nèi)的有害分子，在維持免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。如健康人血清可表達(dá)抗氧化型低密度脂蛋白天然抗體，通過(guò)與循環(huán)中的低密度脂蛋白結(jié)合促進(jìn)其清除，從而降低心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［11-12］。天然抗體的水平隨年齡增長(zhǎng)逐漸下降。天然抗體的減少可造成體內(nèi)某些有害分子蓄積，這與老年人群中的某些疾病如腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等的高發(fā)有關(guān)［13］。提示天然抗體在作為腫瘤診斷標(biāo)志物方面具有很大的潛在價(jià)值。目前國(guó)外已有學(xué)者提出，天然抗體可用作識(shí)別免疫相關(guān)疾病（如癌癥）的生物標(biāo)志物。

調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）可促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中扮演重要角色［14］。CD25也稱為IL-2受體α 鏈，主要表達(dá)在活化的T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等表面，亦表達(dá)于Treg 細(xì)胞。FOXP3 作為轉(zhuǎn)錄因子叉頭/翅螺旋家族的一個(gè)新成員，特異性表達(dá)于Treg，且與Treg的分化及免疫抑制功能密切相關(guān)［15-16］。本研究旨在運(yùn)用抗原表位預(yù)測(cè)工具設(shè)計(jì)并合成CD25、FOXP3 線性抗原肽及自行建立的ELISA 檢測(cè)方法，通過(guò)分析NSCLC 患者血漿CD25、FOXP3 天然抗體的表達(dá)變化，明確CD25、FOXP3 天然抗體表達(dá)的臨床意義及其對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對(duì)象與分組 選取2014 年11 月至2018年8月于青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院胸外科首次確診、未經(jīng)治療的非小細(xì)胞肺癌（僅包括腺癌和鱗狀細(xì)胞癌）患者200 例，所有患者的診斷均由2 名副高級(jí)以上病理科醫(yī)師經(jīng)術(shù)后病理確定。選取同期健康志愿者190 例作為正常對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有肺部良、惡性腫瘤或其他來(lái)源的腫瘤；②惡性腫瘤家族史；③患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病者。本研究經(jīng)青島市立醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑與儀器 96 孔酶標(biāo)板（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體（英國(guó)Abcam公司）；1.0 mol/L磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖片、小牛血清白蛋白（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；顯色劑及終止液（美國(guó)Life Technologies 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio Tek公司）等。

1.2 方法

1.2.1 血漿采集 于清晨、空腹?fàn)顟B(tài)下，采集兩組研究對(duì)象外周靜脈血5 ml，2 500 r/min 離心10 min后收集上層血漿，置于-80℃保存待用。

1.2.2 抗原的設(shè)計(jì)、合成 利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及在線表位預(yù)測(cè)軟件設(shè)計(jì)抗原肽，過(guò)程簡(jiǎn)述如下：首先，逐條肽段評(píng)估其pH 值、親水性、柔性、表面可及性、抗原性等特性。之后，評(píng)估每條肽段與HLA-Ⅱ51 個(gè)等位基因分子的結(jié)合力，篩選出與HLA-Ⅱ高結(jié)合力的肽段。然后，預(yù)測(cè)肽段中潛在的B 細(xì)胞表位。最終，對(duì)滿足上述要求的肽段進(jìn)行綜合評(píng)估，結(jié)合抗原設(shè)計(jì)的一般原則進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整以實(shí)現(xiàn)抗原的優(yōu)化?；谏鲜鲞^(guò)程，最終設(shè)計(jì)并委托上海吉爾生化公司合成了3 條抗原肽，分別為CD25a、CD25b、FOXP3。3 條抗原肽序列信息如表1所示。

表1 CD25 與FOXP3抗原肽的序列信息Tab.1 Information of peptide antigens derived from CD25 and FOXP3

1.2.3 抗原的溶解與包被 67%冰乙酸溶解、稀釋抗原至工作濃度5 mg/ml。按照Thermo Fisher Scientific說(shuō)明書操作步驟包被抗原。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)抗 CD25、FOXP3 抗體 實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見之前研究［17］，現(xiàn)簡(jiǎn)述如下：0.1%PBST洗滌96孔酶標(biāo)板3次，將血漿樣本以0.5%BSA稀釋100 倍后每孔加樣50 μl，室溫孵育1.5 h。將過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG 二抗以0.5%BSA 稀釋50 000 倍后每孔加入50 μl，室溫孵育1 h。洗板3次后每孔加入顯色劑 50 μl，避光顯色 25 min 后加入 25 μl 終止液終止反應(yīng)，在450 nm標(biāo)準(zhǔn)波長(zhǎng)和620 nm參考波長(zhǎng)下讀取吸光度。每板同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、正常對(duì)照，每一樣本均設(shè)雙復(fù)孔。所有樣本均重復(fù)測(cè)定2 次，以2 次測(cè)定值的平均值代表每一樣本的OD值。以特異性結(jié)合指數(shù)（specific binding index，SBR）代表血漿 CD25、FOXP3 抗體的水平。SBR 的計(jì)算公式如下：SBR=（OD樣本-OD陰性對(duì)照）（/OD陽(yáng)性對(duì)照-OD陰性對(duì)照）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并分析數(shù)據(jù)，采用Graphpad prism 5.0軟件繪制ROC曲線，Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Student'st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。多個(gè)獨(dú)立樣本之間的兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析 CD25、FOXP3 抗體對(duì)NSCLC 的診斷效能，并計(jì)算靈敏度及特異度。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 組及對(duì)照組的基線特征比較 NSCLC組 200 例，其中男 125 例，女 75 例，中位年齡為 60 歲（38～79歲）。對(duì)照組190例，其中男101例，女89例，中位年齡為59.5歲（38～79歲）。兩組的性別、年齡、吸煙史等臨床資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 NSCLC組及對(duì)照組的基線特征［，例（%）］Tab.2 Baseline characteristics of NSCLC patients and control subjects［，n（%）］

表2 NSCLC組及對(duì)照組的基線特征［，例（%）］Tab.2 Baseline characteristics of NSCLC patients and control subjects［，n（%）］

Characteristic NSCLC/%Control/%χ2/t P Age/years Gender（n）Male Female Smoking status（n）Former smoker Never smoker Histological type Squamous cell carcinoma Adenocarcinoma TNM stage（n）58.9±8.558.8±9.1-0.170.87 125（62.5）75（37.5）101（53）89（47）3.490.06 103（51.5）97（48.5）98（51.6）92（48.4）00.98 87（43.5）113（56.5）N/A N/AⅠⅡⅢⅣ20（10.0）95（47.5）40（20.0）45（22.5）N/A N/A N/A N/A

2.2 非小細(xì)胞肺癌患者血漿CD25、FOXP3 抗體的表達(dá)水平與對(duì)照組比較 NSCLC Ⅱ～Ⅳ期患者血漿CD25a、FOXP3 抗體的表達(dá)較對(duì)照組顯著增加（P＜0.001，P＜0.05），Ⅰ期患者血漿CD25a、FOXP3 抗體的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NSCLC 患者血漿CD25b 抗體的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低，這一變化在早期即Ⅰ～Ⅱ期患者中尤為顯著（P＜0.001），晚期即Ⅳ期患者血漿CD25b 抗體的表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表3）。

2.3 不同分期NSCLC 患者血漿CD25、FOXP3 抗體的表達(dá)水平 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期NSCLC 患者血漿CD25a、FOXP3 抗體的表達(dá)水平組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。Ⅰ、Ⅱ期NSCLC 患者血漿CD25b 抗體的表達(dá)較Ⅳ期患者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間CD25b抗體的表達(dá)水平無(wú)顯著差異（均P＞0.05，表3）。

表3 各組血漿CD25、FOXP3抗體的表達(dá)水平比較（）Tab.3 Comparison of expression of CD25 and FOXP3 antibody in plasma of each groups（）

表3 各組血漿CD25、FOXP3抗體的表達(dá)水平比較（）Tab.3 Comparison of expression of CD25 and FOXP3 antibody in plasma of each groups（）

Note：1）P＜0.05 vs control group，2）P＜0.001 vs control group，3）P＜0.05 vs stage Ⅳ.

Anti-FOXP3 IgG 0.53±0.25 0.60±0.232）0.55±0.28 0.60±0.241）0.60±0.181）0.62±0.231）Groups n Control NSCLCⅠⅡⅢⅣ190 200 20 95 40 45 Anti-CD25a IgG 0.52±0.17 0.66±0.182）0.61±0.22 0.65±0.172）0.70±0.152）0.67±0.192）Anti-CD25b IgG 0.43±0.22 0.37±0.212）0.31±0.161）3）0.36±0.202）3）0.35±0.141）0.44±0.27

2.4 NSCLC 患者血漿 CD25、FOXP3 抗體的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 CD25a 抗體在不同性別、組織學(xué)類型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 患者血漿中的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而在不同年齡、有無(wú)吸煙史、不同腫瘤大小、TNM 分期NSCLC 患者中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。CD25b 抗體在不同性別、年齡、分化程度的NSCLC 患者血漿中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在不同組織學(xué)類型、腫瘤大小、TNM 分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。而FOXP3 抗體的表達(dá)僅與腫瘤的分化程度有關(guān)（P＜0.05，表4）。

表4 NSCLC患者血漿CD25抗體及FOXP3抗體的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）Tab.4 Relationship between plasma levels of antibodies against CD25 and FOXP3 and clinicopathological characteristics of patients with NSCLC（）

表4 NSCLC患者血漿CD25抗體及FOXP3抗體的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）Tab.4 Relationship between plasma levels of antibodies against CD25 and FOXP3 and clinicopathological characteristics of patients with NSCLC（）

Note：a.Squamous cell carcinoma；b.Adenocarcinma.

Characteristic Gender Male Female Age/year≥60＜60 Smoking status Former smoker Never smoker Histological type SCCa ACb Differentiation grade Well/moderate Poor pT 1～2 3～4 Lymph node metastasis Absent Present TNM stageⅠ～ⅡⅢ～Ⅳn Anti-CD25a IgG t P Anti-CD25b IgG t P Anti-FOXP3 IgG t P 125 75 0.69±0.17 0.61±0.18 3.070.0020.40±0.23 0.32±0.16 2.600.010.62±0.24 0.56±0.21 1.860.07 102 98 0.67±0.17 0.65±0.18-1.130.260.34±0.17 0.40±0.24-2.190.030.62±0.23 0.58±0.23-1.180.24 103 97 0.62±0.16 0.64±0.18 1.350.310.35±0.17 0.40±0.23 0.520.170.63±0.18 0.66±0.12 1.740.12 87 113 0.69±0.17 0.63±0.18-2.450.020.40±0.21 0.35±0.21-1.850.070.62±0.21 0.58±0.25-1.160.25 100 100 0.65±0.18 0.67±0.17 1.120.260.40±0.23 0.34±0.19 2.100.040.56±0.21 0.63±0.25 2.090.03 196 4 0.66±0.18 0.60±0.12 0.710.480.37±0.21 0.33±0.18 0.430.670.60±0.23 0.68±0.21-0.660.51 102 96 0.63±0.17 0.68±0.18-2.140.040.35±0.20 0.40±0.22-1.540.130.60±0.25 0.60±0.21-0.060.95 20 180 0.61±0.22 0.67±0.17-1.250.210.31±0.16 0.39±0.21-1.410.160.55±0.28 0.61±0.23-1.000.32

2.5 CD25、FOXP3 抗體對(duì) NSCLC 診斷效能的分析 繪制CD25、FOXP3 抗體對(duì)NSCLC 診斷的ROC曲線，CD25a 曲線下面積為 0.727（95%CI：0.677～0.778），最佳截?cái)嘀禐?.55，敏感度為77%，特異度為64%；CD25b 曲線下面積為0.601（95%CI：0.545～0.657），最佳截?cái)嘀禐?.35，敏感度為62%，特異度為 57%；FOXP3 曲 線 下 面 積 為 0.613（95%CI：0.557～0.669），最佳截?cái)嘀禐?.54，敏感度為58%，特異度為65%（圖1）。

圖1 血漿CD25、FOXP3抗體診斷NSCLC的ROC曲線圖Fig.1 ROC curve of diagnostic value of CD25 and FOXP3 antibodies for NSCLC

3 討論

Tregs 是一類具有免疫抑制功能的T 細(xì)胞亞群，在維持免疫耐受、調(diào)控免疫應(yīng)答中起重要作用［18-19］。Tregs與腫瘤關(guān)系密切，它可抑制機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。CD25 分子可表達(dá)于激活態(tài)的T 細(xì)胞表面，亦可表達(dá)于Treg，其在兩者的表達(dá)有明顯區(qū)別，F(xiàn)OXP3 在 Treg 的表達(dá)具有高度特異性［20］。FOXP3 被認(rèn)為是目前Tregs 高度特異性的分子標(biāo)志，其表達(dá)與Treg 的成熟、分化及其免疫抑制功能密切相關(guān)［21］。本研究通過(guò)檢測(cè)NSCLC 患者血漿CD25、FOXP3 抗體表達(dá)變化，以明確其在 NSCLC 發(fā)生發(fā)展中的作用及其作為診斷標(biāo)志物的潛能。

本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者血漿CD25a 和FOXP3抗體的水平顯著高于健康對(duì)照，且隨肺癌的進(jìn)展逐漸增加，由此可推測(cè)Treg 數(shù)量可能與NSCLC 分期呈正相關(guān)。隨著肺癌的進(jìn)展，Treg 數(shù)量逐漸增多，CD25a 和FOXP3 分子釋放增加，激活機(jī)體體液免疫應(yīng)答，導(dǎo)致CD25a 和FOXP3 抗體增多。本課題組用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各期NSCLC 患者外周血中Tregs 數(shù)目，也證實(shí)了這一推測(cè)。Ⅳ期NSCLC 患者外周血中Tregs 細(xì)胞數(shù)量高于Ⅲ期患者，Ⅲ期患者外周血中Tregs細(xì)胞數(shù)量高于Ⅱ期患者，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì) CD25a 抗體診斷 NSCLC 效能的ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)CD25a 曲線下面積為0.727（95%CI：0.677～0.778），最佳截?cái)嘀禐?0.55，敏感度為77%，特異度為64%，提示CD25a 抗體對(duì)NSCLC 具有一定的診斷價(jià)值。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)CD25a 抗體的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示血漿CD25a 抗體的表達(dá)可能與NSCLC 預(yù)后有關(guān)，這一初步結(jié)論仍需大規(guī)?；仡櫺匝芯窟M(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究根據(jù)CD25 分子中不同抗原表位設(shè)計(jì)了2 個(gè)線性抗原肽即CD25a 和CD25b，通過(guò)檢測(cè)其抗體表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)CD25a 和CD25b 抗體在NSCLC 患者中呈現(xiàn)出完全相反的表達(dá)趨勢(shì)。相較于健康對(duì)照，CD25a 抗體在NSCLC 患者表達(dá)增加，而CD25b抗體在NSCLC 患者表達(dá)顯著降低，這一變化在Ⅰ～Ⅲ期NSCLC 患者中尤為顯著，且Ⅰ～Ⅱ期NSCLC 患者CD25b 抗體表達(dá)降低較Ⅳ期患者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這源于不同抗原表位的免疫原性不同，與相應(yīng)B 細(xì)胞受體結(jié)合后激活免疫應(yīng)答的能力不同［22］。同時(shí)也說(shuō)明CD25b 天然抗體可能參與維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，其含量減少可削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，促進(jìn)NSCLC 的發(fā)生。本研究結(jié)果與之前報(bào)道的CD25b抗體在NSCLC 患者血漿中的表達(dá)存在相反趨勢(shì)［23-24］。推測(cè)可能與以下因素有關(guān)：①由于腫瘤的異質(zhì)性，同種腫瘤抗體的表達(dá)水平可能存在差異；②樣本量及來(lái)源不同、偏倚采樣、檢測(cè)方法的不同也可能是導(dǎo)致結(jié)論不一的原因。

此外，血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)NSCLC 的發(fā)生也有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，目前臨床常用的NSCLC 腫瘤標(biāo)志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原 19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）等。由于單個(gè)標(biāo)志物對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值有限，下一步將與上述敏感腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合，以提高NSCLC 診斷的敏感度及特異度。

綜上所述，CD25a、CD25b、FOXP3抗體在NSCLC中的表達(dá)變化提示其可能參與NSCLC 的發(fā)病機(jī)制，其中CD25a 抗體可能對(duì)診斷肺癌有幫助，CD25b 抗體在早期NSCLC（Ⅰ～Ⅱ期）中表達(dá)降低，可能對(duì)肺癌發(fā)生有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，但對(duì)NSCLC 診斷效能有限，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值，并聯(lián)合其他NSCLC 敏感性標(biāo)志物提高早期NSCLC診斷的靈敏度及特異度。