miR-143/145啟動子區(qū)rs17723799多態(tài)性與宮頸癌易感性的相關(guān)性研究①

姜霽珂 龔建瑜 蘇曉三 魯剛旭 朱正鳳 孫瑞芬 （云南中醫(yī)藥大學(xué)，昆明 650500）

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率位居女性惡性腫瘤第四，2018 年全球約有57 萬病例，31.1 萬例患者死亡，其中大部分發(fā)生于發(fā)展中國家［1］。我國宮頸癌發(fā)病率和病死率分別位居第六和第八，盡管近年發(fā)病率有所下降，但發(fā)病年齡逐漸呈年輕化［2-3］。HPV 感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因，但吸煙、口服避孕藥、多次妊娠也與宮頸癌發(fā)病有關(guān)［4］。大量研究表明，宮頸癌是一種多基因遺傳病引起的疾病［5］。

miRNAs 是一類內(nèi)源性長度為20～25 個(gè)核苷酸且具有多種調(diào)控功能的單鏈非編碼RNA，通過與mRNA 3'-非編碼區(qū)（3'-UTR）結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)［6］。研究表明，miRNAs 在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、代謝和腫瘤發(fā)生等生理和病理過程中起重要調(diào)控作用［7-8］。單核苷酸多態(tài)性（SNPs）能夠引起成熟miRNA 種子區(qū)基因突變，從而影響miRNA與靶點(diǎn)的相互作用，導(dǎo)致靶基因表達(dá)失調(diào)。研究表明，miRNAs 在癌癥中呈差異性表達(dá)，并在其發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用［9-10］。如趙成桂等［11］研究發(fā)現(xiàn)，miR-143/miR-145 啟動子區(qū)rs4705342 CC 基因型增加了前列腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)；miR-143-3p 異常表達(dá)能夠影響食管癌細(xì)胞增殖和侵襲［12］。本研究對云南地區(qū)漢族人群進(jìn)行了病例對照研究，探究miR-143/145 啟動子區(qū)基因多態(tài)性對宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的影響。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2015 年至2017 年延安醫(yī)院就診的242例宮頸癌患者及同期進(jìn)行體檢的249例健康志愿者作為研究對象。所有患者依據(jù)FIGO 確診，并排除患有癌癥、高血壓、糖尿病家族史者，收集患者臨床和病理特征，如年齡、臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等（表1）。所有受試者均為無遺傳關(guān)系的漢族女性，并簽署知情同意書。

表1 研究對象基本情況［，例（%）］Tab.1 Characteristics of study population［，n（%）］

表1 研究對象基本情況［，例（%）］Tab.1 Characteristics of study population［，n（%）］

Items Age Clinical stages Control（n=249）49.9±8.9 Case（n=242）50.0±9.3 P 0.47 1 2 133（54.9）109（45.1）Differentiated status Well-moderate Poorly Lymph node metastasis Yes No-- -- --89（36.8）153（63.2）49（20.2）193（79.8）

1.1.2 主要試劑 DNA 提取試劑盒（北京Bioteke）；FFPE RNA 劑盒（美國 Omega Bio-Tek）；bulge loop miRNA QRT PCR primer（廣東銳博）。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 室溫下采集研究對象外周血2 ml至EDTA 抗凝管，采用提取試劑盒從血液樣本中提取基因組DNA。SnaPshot 法分析rs17723799 多態(tài)性，并通過DNA 測序驗(yàn)證基因分型結(jié)果。引物序列：5'-ATGTACCAAGCCACAGGTCA-3'（正向）和5'-TACTGAAATCAGGGCCACGT-3'（反向）。

1.2.2 qRT-PCR 采用FFPE RNA 劑盒從石蠟包埋的宮頸癌組織中分離總RNA，采用bulge loop miRNA QRT PCR primer 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明對基因特異性引物進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。2-ΔΔCt法測定miR-143和 miR-145表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異比較采用t檢驗(yàn)。采用SNPstats軟件（https：//www.snpstats.net/start.htm）檢驗(yàn)rs17723799的基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡（HWE），并分析rs17723799 多態(tài)性與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。經(jīng)年齡校正后，采用比值比（OR）和95%置信區(qū)間（95%CI）表示宮頸癌相對危險(xiǎn)程度。采用單因素方差分析檢驗(yàn)miR-143/145相對表達(dá)。計(jì)量資料以表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs1723799 多態(tài)性與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性rs1723799 多態(tài)性與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性見表2。基因型分布符合HWE（P＞0.05），經(jīng)年齡校正后，宮頸癌患者rs1723799 TC 和TT 基因型頻率低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TC vs CC：校正OR=0.42，95%CI：0.28～0.63，P＜0.05；TT vs CC：校正OR=0.35，95%CI：0.19～0.63，P＜0.05）。顯性模型中TC/TT 基因型的頻率低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CC vs TC/TT：校正OR=0.40，95%CI：0.27～0.60，P＜0.05），隱性模型中TT 基因型頻率低于對照組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TT vs CC/TC：校正OR=0.61，95%CI：0.36～1.03，P=0.063）。

表2 rs1723799多態(tài)性與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性［例（%）］Tab.2 Association between rs1723799 polymorphism and risk of cervical cancer［n（%）］

2.2 rs1723799多態(tài)性與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的分層分析 根據(jù)宮頸癌組患者的臨床特征，包括腫瘤分期、分化程度和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移進(jìn)行亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，rs1723799T/C 位點(diǎn)TC/TT 基因型在宮頸癌中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移頻率為44.9%，低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的頻率62.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TC/TT vs CC：OR=2.03，95%CI：1.08～3.84，P=0.028）。TT 基因型在宮頸癌分期2期分布率為7.3%，低于1期的13.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TT vs CC：OR=0.39，95%CI：0.16～0.99，P=0.026）。TC/TT基因型在宮頸癌分期2 期分布率為51.4%，低于1 期的64.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（TC/TT vs CC：OR=0.58，95%CI：0.34～0.97，P=0.037，表3）。

表3 rs1723799多態(tài)性與宮頸癌臨床特征的關(guān)系［例（%）］Tab.3 Association of rs1723799 polymorphism with clinical features of cervical cancer［n（%）］

2.3 rs1723799 與宮頸癌組織miR-143/145 表達(dá)的關(guān)系 根據(jù)miR-143/145 啟動子區(qū)rs1723799 在宮頸癌組織中的基因型分布，結(jié)合miR-143/145 在宮頸癌石蠟樣本中的表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，rs1723799 位點(diǎn) CC 基因型 miR-143 表達(dá)明顯低于 TC 基因型（P=0.011），rs1723799 位點(diǎn) TT 基因型miR-145表達(dá)明顯低于TC基因型（P=0.014，圖1）。

圖1 rs1723799與宮頸癌組織miR-143/145表達(dá)的相關(guān)性Fig.1 Relationship between rs1723799 and expression of miR-143/145 in cervical cancer tissues

3 討論

越來越多研究發(fā)現(xiàn)miRNAs 與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13-14］。miR-143/145位于人類第5號染色體長臂3區(qū)2帶，研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血漿miR-145水平下降，提示miR-145 是宮頸癌診斷和預(yù)測放射敏感性的新的潛在生物標(biāo)志物［15］。長鏈非編碼RNA ACTA2-AS1在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，而miR-143-3p表達(dá)則顯著降低，ACTA2-AS 通過競爭性結(jié)合miR-143-3p上調(diào)SMAD3，從而加速宮頸癌進(jìn)程［16］。HIF-1α是miR-143的靶基因，miR-143通過靶向HIF-1α調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡［17］。miR-143-3p通過靶向抑制TREM1 表達(dá)抑制腎小球系膜細(xì)胞炎癥因子分泌及細(xì)胞增殖活性，從而發(fā)揮保護(hù)作用［18］。WEI 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，miR-143/145 啟動子中 rs4705342 T＞C 與缺血性腦卒中風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)。有研究采用PCRRFLP 法分析 miR-34b/c 基因啟動子區(qū) rs4938723 多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組C等位基因頻率高于對照組，TC 和 CC 基因型患者預(yù)后較差［20］。miR-143/145 啟動子區(qū)rs353293 多態(tài)性與膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，低級別腫瘤患者AA/AG 基因型和A 等位基因發(fā)生率較低［21］。上述研究表明 miRNAs 啟動子區(qū) SNPs 與多種疾病有關(guān)，但確切機(jī)制尚未闡明，目前尚無miR-143/145 啟動子區(qū)rs1723799 與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的報(bào)道。本研究通過比較宮頸癌組和對照組候選位點(diǎn)基因型頻率分布，發(fā)現(xiàn)與rs1723799CC基因型相比，rs1723799 TC 和TT 基因型與宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)降低有關(guān)，提示miR-143/145 rs1723799 多態(tài)性與云南地區(qū)漢族人群宮頸癌遺傳易感性關(guān)系密切。

XU 等［22］發(fā)現(xiàn)低表達(dá) miR-424 與宮頸癌分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管受累情況等其他預(yù)后不良的臨床病理參數(shù)呈正相關(guān)。miR-195 在宮頸癌組織及細(xì)胞系中均呈低表達(dá)，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和深層基質(zhì)浸潤顯著相關(guān)，認(rèn)為miR-195通過靶向Smad3抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲［23］。研究發(fā)現(xiàn)，let-7家族啟動子中rs13293512 CC基因型顯著增加乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，分層分析顯示，rs13293512 CC基因型與雌激素受體陰性患者、孕激素受體陰性患者、T1～2 期癌癥患者和 N1～3 期癌癥患者乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)［24］。本研究分層分析顯示，rs1723799位點(diǎn)頻率分布與宮頸癌臨床特征相關(guān)，rs1723799 TC/TT 基因型的宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移頻率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，證實(shí)miR-143/145 在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外，根據(jù)miR-143/145 啟動子區(qū)rs1723799多態(tài)位點(diǎn)在宮頸癌組織中的分布，結(jié)合該位點(diǎn)在宮頸癌組織中表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，攜帶rs1723799 TC基因型的患者與攜帶rs1723799 CC/TC基因型的患者相比，miR-143/145 表達(dá)更高，提示miR-143/145 啟動子區(qū)SNPs 可影響該基因表達(dá)，一定程度影響宮頸癌易感性。

綜上所述，miR-143/145 啟動子區(qū) rs1723799 多態(tài)性與云南地區(qū)漢族人群宮頸癌遺傳易感性關(guān)系密切，攜帶rs1723799 TC/TT 基因型的宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)降低，攜帶rs1723799 TC 基因型的患者miR-143/145 表達(dá)水平更高。位于啟動子區(qū)的單核苷酸多態(tài)性可能對基因表達(dá)產(chǎn)生影響，從而影響宮頸癌發(fā)生，因此對此類SNPs位點(diǎn)研究具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)rs1723799 TC基因型可能是宮頸癌發(fā)展的生物標(biāo)志物，為宮頸癌診斷和個(gè)體治療提供了參考。

本實(shí)驗(yàn)仍存在一些不足，如樣本選取為云南地區(qū)漢族人群，其結(jié)果不能代表其他民族，且由于缺乏生存信息，無法評估基因型對宮頸癌整體預(yù)后的影響。課題組后續(xù)將繼續(xù)研究其他少數(shù)民族基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本量。