miR-589-3p靶向DSPP基因?qū)谇击[狀細(xì)胞癌腫瘤干細(xì)胞的調(diào)控作用①

游東樂(lè) 全海薇 全海英 （吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科，吉林 132000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作為口腔頜面惡性腫瘤，嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量并危及健康。由于受到面部生理功能以及結(jié)構(gòu)特殊性等因素的影響，OSCC 也較容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)等情況［1］。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)近年來(lái)越來(lái)越受關(guān)注，干細(xì)胞并非一種功能性概念，而是指在腫瘤中具有干細(xì)胞屬性以及能力的部分細(xì)胞，明確干細(xì)胞作用的相關(guān)機(jī)制對(duì)于了解腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展以及耐藥性等十分重要［2］。

牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）在種類(lèi)上屬于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，其不僅在成牙本質(zhì)中高表達(dá)，也存在于骨及非礦化組織中，DSPP 的突變會(huì)引起牙本質(zhì)發(fā)育不良等［3］。近年來(lái)DSPP在口腔癌中的作用也不斷被發(fā)現(xiàn)，如有研究證實(shí)該基因的沉默能夠抑制口腔癌細(xì)胞株的關(guān)鍵致瘤活性［4］。另外也有研究證實(shí)DSPP 能夠與基質(zhì)金屬蛋白酶20 相互作用，同時(shí)沉默DSPP 能夠抑制口腔癌細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)［5］。miR-589 被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中發(fā)揮致癌或者抑癌因子作用，如miR-589 能夠通過(guò)調(diào)控LIFR-PI3K/AKT-cJun 通路進(jìn)而促進(jìn)胃癌的侵襲性［6］。另外也有研究表明其在肝癌中能夠抑制肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)［7］。但是對(duì)于其是否參與口腔相關(guān)癌癥目前尚沒(méi)有充足證據(jù)證明。本研究從腫瘤干細(xì)胞角度出發(fā)，探究miR-589-3p/DSPP在OSCC中的作用并探究其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 EDTA 溶液（PB180320）、胰蛋白酶（9002-07-7）購(gòu)自上海雅心生物技術(shù)有限公司；CD44（130-110-293）和 CD133（130-050-801）免疫磁珠均購(gòu)自德國(guó)美天旎；轉(zhuǎn)染用載體購(gòu)自Invitrogen；Buffer溶液（EHJSW-023512）購(gòu)自廈門(mén)慧嘉；流式細(xì)胞儀（CytoFLEX S）購(gòu)自Beckman coulter；Lipofectamin 2000（11668027）購(gòu)自Invitrogen；細(xì)胞轉(zhuǎn)染載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒（E1910）購(gòu)自 Promega；Trizol（15596-018）試劑盒、MTT 溶液（M1025）、Transwell 試劑盒（3413）、凋亡檢測(cè)試劑盒（CA1020-20T）購(gòu)自北京索萊寶；焦炭酸二乙酯（1609-47-8）購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（UV-1500）購(gòu)自上海美析儀器有限公司；qRT-PCR 基因檢測(cè)試劑盒（QPG-023）購(gòu)自蘇州吉瑪基因；酶標(biāo)儀（Thermo MK3）購(gòu)自上海賽默生物；RPMI1640培養(yǎng)基（PM150110）購(gòu)自武漢普諾賽；流式細(xì)胞儀（FACSCalibur）購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 組織樣本收集 收集2018 年2 月至2019 年7 月收治于吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院口腔科的48 例OSCC 患者組織標(biāo)本。男32 例、女16 例，平均年齡（60.2±9.7）歲?；颊呔性徊≡钋谐蝾i淋巴清掃術(shù)且術(shù)前未接受任何放化療等質(zhì)量措施，術(shù)后進(jìn)行隨訪。同時(shí)收集同期于本院接受治療的29 例口腔黏膜良性腫物患者的口腔黏膜上皮組織作為對(duì)照，男18 例、女11 例，平均年齡（59.5±10.3）歲。所有切除標(biāo)本均置于液氮迅速冷凍，之后保存于-80℃環(huán)境。本研究符合赫爾辛基宣言，經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批同意且經(jīng)所有患者知情同意。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人OSCC 細(xì)胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中并于37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)密度約80%時(shí)使用含0.02%EDTA 和0.25%胰蛋白酶的消化液消化細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。

1.2.3 免疫磁珠技術(shù)分選OSCC 腫瘤干細(xì)胞 胰酶消化OSCC 細(xì)胞后加入血清終止消化，1 200 r/min離心5 min，離心半徑20 cm，去上清后加入Buffer溶液和CD44/CD133免疫磁珠，4℃孵育10 min，1 200 r/min離心10 min 后去上清，Buffer 溶液重懸細(xì)胞，將分選架和磁場(chǎng)連接后將CD44/CD133 置于磁場(chǎng)，Buffer 溶液沖洗分選柱，加入細(xì)胞懸液后再次沖洗，分選柱脫離磁場(chǎng)后收集標(biāo)記細(xì)胞，離心后接種于培養(yǎng)瓶。胰酶消化分選后的細(xì)胞，1 000 r/min 離心5 min 去上清，PBS 溶液沖洗。細(xì)胞計(jì)數(shù)后分兩組，一組加入PBS 溶液和 5 μl 的 CD44/CD133 抗體，另一組加入PBS溶液和CD44/CD133同型對(duì)照。4℃孵育30 min后離心去上清，PBS 沖洗，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44+和CD133+細(xì)胞純度。

1.2.4 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 OSCC 腫瘤干細(xì)胞分為：mimics control 組（轉(zhuǎn)染miR-589-3p 模擬物對(duì)照）、mimics miR-589-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-589-3p 模擬物）、inhibitors control 組（轉(zhuǎn)染miR-589-3p 抑制物對(duì)照）、inhibitors miR-589-3p 組（轉(zhuǎn)染miR-589-3p 抑制物）、mimics miR-589-3p+pcDNA-DSPP（共轉(zhuǎn)染miR-589-3p模擬物和DSPP）。細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)lipofectamin 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5 雙熒光素酶驗(yàn)證miR-589-3p 與DSPP 的靶向關(guān)系 借助Targetscan 在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http：//www. targetscan. org/mamm_31/）預(yù)測(cè) miR-589-3p 與DSPP 之間的結(jié)合位點(diǎn)。之后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者的靶向關(guān)系，實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性。

1.2.6 qRT-PCR 檢測(cè) 依據(jù)Trizol 試劑盒說(shuō)明提取細(xì)胞中總RNA，之后使用DEPC 處理的超純水溶解RNA，紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值進(jìn)而測(cè)定總RNA 濃度。借助qRT-PCR 基因檢測(cè)試劑盒一步法完成RT 和PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件均依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)完成。miR-589-3p 以U6 為內(nèi)參，DSPP以GAPDH 作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。本方法同樣適用于組織實(shí)驗(yàn)。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

1.2.7 Western blot RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，然后將細(xì)胞收集于 EP 管，4℃、2 000 r/min 離心 30 min，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，行SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%BSA 封閉1 h。洗膜，加入一抗兔抗人 DSPP、MMP2、N-cadherin、Vimentin。4℃孵育，TBST 沖洗，加入二抗山羊抗兔IgG。4℃孵育，TBST 沖洗，將化學(xué)發(fā)光液混勻后滴加至 PVDF 膜，ECL 顯影，拍照，Image J 分析蛋白表達(dá)量。

1.2.8 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞生長(zhǎng)密度約80% 時(shí)以 1×106個(gè)/ml 的密度接種于 96 孔板，每孔20 μl，分別在24 h、48 h、72 h 時(shí)在細(xì)胞中加入20 μl的MTT溶液，濃度5 mg/ml，培養(yǎng)4 h后加入150 μl的DMSO 溶液。振蕩混勻后將細(xì)胞置于酶標(biāo)儀，檢測(cè)490 nm處吸光度值并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.9 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞侵襲情況 使用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋ECM膠使其濃度為0.8 mg/ml，取 60 μl 加入 Transwell 小室上室，37℃ 孵育 8 h 后將50 μl濃度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞加入上室，下室加入趨化液，培養(yǎng)24 h后取出上室，吸除上室液體后，4%多聚甲醛固定，之后借助0.05%結(jié)晶紫溶液染色30 min。蒸餾水沖洗后顯微鏡下拍照，計(jì)算跨膜細(xì)胞數(shù)目。

1.2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。首先胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml 后以75%乙醇固定細(xì)胞，4℃ 過(guò)夜。1 500 r/min 離心 15 min，PBS 沖洗，緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl Annexin V-FITC 以及10 μl PI，將二者混勻并且置于室溫下反應(yīng)15 min。使用流式細(xì)胞儀激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 和530 nm 對(duì)FITC進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)575 nm 對(duì)PI 進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用Pearson 卡方檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OSCC 組織中 miR-589-3p 表達(dá)降低、DSPP 表達(dá)增加 qRT-PCR 檢測(cè)OSCC 和口腔良性腫物患者切除組織中 miR-589-3p 的表達(dá)和 DSPP 的 mRNA 表達(dá)，結(jié)果表明，相對(duì)于Control 組，OSCC 患者切除組織中miR-589-3p 表達(dá)被抑制而DSPP 表達(dá)增高（均P＜0.05）。同時(shí)，miR-589-3p 和DSPP 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.350 4，P=0.014 6）。見(jiàn)圖1。

圖1 Control 組和 OSCC 組組織中 miR-589-3p 和 DSPP mRNA表達(dá)情況Fig.1 Expression of miR-589-3p and DSPP mRNA in tissue of Control and OSCC group

2.2 miR-589-3p 靶向下調(diào) DSPP 表達(dá) Targetscan預(yù)測(cè)到miR-589-3p 與DSPP 存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于共轉(zhuǎn)染mimics control和DSPP-WT，共轉(zhuǎn)染miR-589-3p模擬物與DSPP-WT的細(xì)胞中熒光素酶活性被顯著抑制（P＜0.05）。同時(shí)，相對(duì)于 mimics control 組，mimics miR-589-3p 組中DSPP 表達(dá)被抑制（P＜0.05）；而相對(duì)于inhibitors control組，inhibitors miR-589-3p組中DSPP表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。結(jié)果表明 miR-589-3p 能夠靶向抑制DSPP。見(jiàn)圖2。

圖2 miR-589-3p與DSPP的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.2 Verification of targeting relationship between miR-589-3p and DSPP

2.3 OSCC 腫瘤干細(xì)胞分選鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選完成后的OSCC 細(xì)胞中的CD44 和CD133 表達(dá)，結(jié)果表明，CD133+和 CD44+細(xì)胞的純度分別為91.02%及93.41%，表明分選后的細(xì)胞為OSCC腫瘤干細(xì)胞，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖3。

圖3 腫瘤干細(xì)胞分選結(jié)果Fig.3 Sorting results of cancer stem cells

2.4 過(guò)表達(dá)miR-589-3p 抑制OSCC 腫瘤干細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 檢測(cè)各組增殖活力和凋亡情況，結(jié)果顯示，相對(duì)于mimics control 組，mimics miR-589-3p 組細(xì)胞增殖活力被抑制，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)（均P＜0.05）。而相對(duì)于 inhibitors control 組，inhibitors miR-589-3p 組細(xì)胞增殖活力被誘導(dǎo)而細(xì)胞凋亡減少（均P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 各組細(xì)胞增殖活力和凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Cell proliferation and apoptosis results in each group

2.5 過(guò)表達(dá)miR-589-3p 抑制OSCC 腫瘤干細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 對(duì)各組細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，相對(duì)于mimics control 組，mimics miR-589-3p 組細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá)被抑制（均P＜0.05）。而相對(duì)于 inhibitors control 組，inhibitors miR-589-3p 抑制物組細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá)減少（均P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 各組細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Results of cell invasion and epithelial-mesenchymal transition related factors expression in each group

2.6 DSPP 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn) mimics miR-589-3p 對(duì) OSCC腫瘤干細(xì)胞增殖和凋亡的影響 對(duì)mimics control、mimics miR-589-3p以及mimics miR-589-3p+pcDNADSPP 組中細(xì)胞凋亡和增殖情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，相對(duì)于mimics control組，mimics miR-589-3p組中凋亡增多而增殖活力被抑制（均P＜0.05）。mimics miR-589-3p+pcDNA-DSPP 組 和 mimics control 組 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），表明DSPP 能夠逆轉(zhuǎn)miR-589-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)OSCC 腫瘤干細(xì)胞增殖和凋亡的影響。見(jiàn)圖6。

圖6 各組細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Results of cell proliferation and apoptosis in each group

2.7 DSPP 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-589-3p 模擬物對(duì)OSCC腫瘤干細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 對(duì)mimics control、mimics miR-589-3p 以及 mimics miR-589-3p+pcDNA-DSPP 組中細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，相對(duì)于mimics control，mimics miR-589-3p組中細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化因子的表達(dá)被抑制（均P＜0.05）。mimics miR-589-3p+pcDNADSPP 組和mimics control 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），表明DSPP 能夠逆轉(zhuǎn)miR-589-3p 過(guò)表達(dá)對(duì)OSCC 腫瘤干細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。見(jiàn)圖7。

圖7 各組細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of invasion and epithelial-mesenchymal transition related factors expression in each group

3 討論

本研究從OSCC 腫瘤干細(xì)胞的角度出發(fā)，通過(guò)分選腫瘤干細(xì)胞并干預(yù)細(xì)胞中miR-589-3p 和DSPP的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-589-3p 能夠抑制OSCC 腫瘤干細(xì)胞的增殖、侵襲、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡且該作用能夠被DSPP逆轉(zhuǎn)。

DSPP 為Sibling 家族的最大成員，其主要編碼1 300 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在翻譯后又分裂為2 個(gè)主要蛋白質(zhì)即牙本質(zhì)涎蛋白和牙本質(zhì)磷蛋白，其在骨、牙齒等礦化組織和上皮細(xì)胞中均有表達(dá)［8-10］。近年來(lái)包括DSPP 在內(nèi)的Sibling 家族成員被發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種癌癥的增殖、遷移存在關(guān)聯(lián)［11-12］。此外，GKOUVERIS 等［13］證實(shí) DSPP 在口腔癌 中 具 有 致 瘤 性 。 SAXENA 等［14］發(fā) 現(xiàn) DSPP 在MMP20 啟動(dòng)子區(qū)域大量富集且二者共同參與口腔癌的癌變。此外，DSPP 還能夠?qū)SCC 腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行影響［5］。本研究除進(jìn)一步證實(shí)DSPP 在OSCC 患者組織中表達(dá)增強(qiáng)外還發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與miR-589-3p 呈負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了二者之間的靶向關(guān)系，表明DSPP 可能受miR-589-3p的調(diào)控。

CD44+和CD133+細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)在遷移、侵襲以及存活方面更具優(yōu)勢(shì)且對(duì)化療具有更高抵抗力，也被認(rèn)為是OSCC 腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物［15］。本研究借助磁珠分選技術(shù)成功分離出OSCC 腫瘤干細(xì)胞并干預(yù)其中miR-589-3p 和DSPP 的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-589-3p 能夠抑制OSCC 腫瘤干細(xì)胞的增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，同時(shí)轉(zhuǎn)染 miR-589-3p 和 DSPP 后，miR-589-3p 對(duì) OSCC 腫瘤干細(xì)胞的作用消失，表明DSPP 能夠逆轉(zhuǎn)miR-589-3p 的影響。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是癌癥轉(zhuǎn)移早期的關(guān)鍵步驟之一，主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［16-17］。越來(lái)越多的研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在口腔癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等絕大多數(shù)癌癥中均發(fā)揮重要作用［18-21］。本研究干預(yù)OSCC 腫瘤干細(xì)胞中miR-589-3p和DSPP的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-589-3p 能夠抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá)，且其作用可被DSPP 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)，即miR-589-3p 能夠通過(guò)調(diào)控DSPP 的表達(dá)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)OSCC 腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，miR-589-3p在OSCC腫瘤干細(xì)胞調(diào)控中具有重要意義，其能夠靶向DSPP進(jìn)而抑制OSCC 腫瘤干細(xì)胞的增殖、侵襲等，對(duì)于明確OSCC 的機(jī)制具有重要意義。但本研究也有一定的局限性，如對(duì)體外實(shí)驗(yàn)的涉及不夠，沒(méi)有對(duì)細(xì)胞死亡的具體方式進(jìn)行探討等，本課題組將會(huì)在今后的研究中不斷完善。