TRIM19通過調(diào)控p53信號促進卵巢癌進展的作用及機制研究①

王 琪 廖振蓉 羅德平 余 瑛 李 榮 （贛南醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，贛州 341000）

卵巢癌是發(fā)達國家婦女癌癥病死的第五大原因，也是最致命的婦科惡性腫瘤［1-2］。由于卵巢癌早期無明顯癥狀、起病較隱匿，絕大多數(shù)患者初診時已經(jīng)發(fā)生腫瘤的腹腔轉(zhuǎn)移和擴散，兩年內(nèi)復(fù)發(fā)率達80%，五年生存率從45%下降到25%［3-5］。由于卵巢癌無癥狀特征，通常在晚期才被診斷出來。盡管其治療策略取得了重大進展，但仍是一種致命疾病，因此需要進一步研究以了解其發(fā)病機制和病理生理。TRIM（tripatite motif-containing protein）又稱為三基序蛋白，擁有環(huán)指結(jié)構(gòu)域（RING-finger）、B-box結(jié)構(gòu)域、卷曲螺旋coil-coiled）3 個特征性結(jié)構(gòu)域，是一類發(fā)揮E3 泛素連接酶作用的蛋白家族［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤中，不同的TRIM 成員呈現(xiàn)差異性表達，可能通過與p53信號通路的相互作用，影響腫瘤因子表達，作為癌基因或抑癌基因調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲等多種生物學(xué)過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［7］。

本研究檢測卵巢癌細胞中TRIM19 基因的表達，通過RNAi 技術(shù)降低TRIM19 的表達并觀察其對卵巢癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響，同時初步探索TRIM19 基因是否通過p53 信號通路調(diào)控卵巢癌進程及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 卵巢癌細胞株SKOV-3、A2780、OVCAR3，人正常卵巢上皮細胞株 IOSE80（ATCC）；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青鏈霉素（Sigma 公司）；TRIM19-siRNA、TRIM19、GAPDH 引物（安徽通用生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（Invitrogen）；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量檢測試劑盒、CCK-8、DMSO、細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；TRIM19 抗體及GAPDH 抗體、HRP標(biāo)記的IgG抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 靶向TRIM19 基因的siRNA 合成及細胞轉(zhuǎn)染 委托安徽通用生物科技有限公司以化學(xué)法合成靶向敲減TRIM19 基因的siRNA，靶點序列為：5'-TGGATAACGTCTTTTTCGAGAGT-3'。以1×106個/孔將SKOV-3細胞接種于6孔培養(yǎng)板，無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)，4 h 后當(dāng)細胞融合到70%～80%時進行細胞轉(zhuǎn)染。按照 TRIM19-siRNA 2 μg/Lipo 8 μl、TRIM19-siRNA 4 μg/Lipo 8 μl 的濃度分別配制無血清培養(yǎng)液各100 μl，6 h后更換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，24 h、48 h、72 h 后收集細胞備用。設(shè)轉(zhuǎn)染組（siTRIM19）、陰性對照組（NC），每組設(shè)3個復(fù)孔，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.2 熒光定量PCR（qPCR）檢測TRIM19 基因及信號分子表達 胰酶消化收集細胞，Trizol 裂解細胞，根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取細胞中總RNA，置入RNA free 水內(nèi)溶解備用。嚴格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明制備cDNA。以cDNA 為模板，GAPDH 為內(nèi)參，SYBR Green 染料法檢測 TRIM19 及p53 信號分子表達。PCR 反應(yīng)程序：95℃ 2 min，（95℃ 15 s、60℃ 15 s）40 個循環(huán)。每組設(shè)3 個復(fù)孔，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot 檢測 胰酶消化收集細胞，蛋白裂解液裂解細胞，4℃、14 000 r/min 離心10 min，提取細胞總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 電泳膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，PBS 洗滌。一抗4℃過夜，PBS 洗滌。二抗室溫下孵育2 h，PBS 洗滌，ECL 試劑化學(xué)發(fā)光，顯影、定影。掃描膠片，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白的灰度值。每組設(shè)3個復(fù)孔，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.4 CCK-8 法檢測細胞增殖能力 胰酶消化細胞，分別以 5 000 個/孔接種于 96 孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 后加入10%體積的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h后以酶標(biāo)儀檢測450 nm處的吸光度值。每組設(shè)3 個復(fù)孔，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化細胞，以1 200 r/min 離心5 min，預(yù)冷的PBS 洗滌、離心，再以預(yù)冷PBS 重懸制成細胞混懸液。按照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明用Annexin V染色法檢測細胞凋亡率。每組設(shè)3 個復(fù)孔，所有試驗均重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 將濾膜孔徑為 8 μm 的 Transwell 小室置于 24 孔板。胰酶消化并收集培養(yǎng)的細胞，以1×104個/孔接種于Transwell小室上室，下室加入 600 μl 含 20%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后取出小室，結(jié)晶紫染色，棉簽輕輕拭去小室濾膜上層的細胞。顯微鏡下觀察拍照，每個樣本隨機選取10 個視野拍照并計數(shù)。每組設(shè)3個復(fù)孔，所有試驗均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TRIM19 在卵巢癌細胞中高表達 qPCR 結(jié)果表明，以人卵巢表皮細胞IOSE80 為對照，卵巢癌細胞 SKOV-3、A2780、OVCAR3 中 TRIM19 mRNA 表達量均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。如圖 1，SKOV-3 細胞中 TRIM19 比 IOSE80 細胞中上調(diào)5.05 倍，A2780 細胞中上調(diào) 1.75 倍，OVCAR3 細胞中上調(diào)1.84倍。

圖1 qPCR檢測TRIM19基因在卵巢癌細胞中的表達Fig.1 Expression of TRIM19 gene in ovarian cancer cells was detected by qPCR

2.2 TRIM19 被成功敲減 轉(zhuǎn)染靶向TRIM19 基因的siRNA（siTRIM19）并培養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)染組TRIM19基因的mRNA 表達量較對照組（NC）降低約69.3%（圖2A），TRIM19 蛋白表達量較對照組（NC）降低約51.8%（圖2B），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，卵巢癌細胞SKOV-3中TRIM19基因被成功敲減。

圖2 SKOV-3細胞中的TRIM19基因被成功敲減Fig.2 TRIM19 gene was knocked down successfully in SKOV-3 cells

2.3 TRIM19 調(diào)控卵巢癌細胞增殖 敲減TRIM19基因后，細胞增殖能力明顯減弱，在第5 天時，轉(zhuǎn)染組細胞增殖率是對照組的25.8%（圖3A）。同時，細胞克隆形成能力明顯減弱。在第14天時，經(jīng)結(jié)晶紫染色后計數(shù)細胞發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組中細胞克隆數(shù)只有約52 個，而對照組中克隆數(shù)量接近368 個（圖3B、C）。提示TRIM19 基因?qū)β殉舶┘毎纳L及增殖有重要貢獻。

圖3 敲減TRIM19基因抑制SKOV-3細胞增殖與生長Fig.3 Knockdown of TRIM19 gene inhibited proliferation and growth in SKOV-3 cells

2.4 TRIM19 調(diào)控卵巢癌細胞侵襲 轉(zhuǎn)染組中可穿透小室上層阻隔膜的SKOV-3 細胞數(shù)量較對照組明顯增加。經(jīng)統(tǒng)計，敲減TRIM19后，細胞穿透能力約降低70%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。提示敲減TRIM19 基因可明顯抑制卵巢癌細胞SKOV-3的侵襲行為。

圖4 敲減TRIM19抑制SKOV-3細胞侵襲Fig.4 Knockdown of TRIM19 suppressed cell invasion in SKOV-3 cells

2.5 TRIM19 調(diào)控卵巢癌細胞凋亡 敲減TRIM19基因并培養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)染組中細胞凋亡率為12.5%，對照組中細胞凋亡率為0.45%，轉(zhuǎn)染組凋亡率是對照組的30倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。提示敲減TRIM19 基因明顯促進卵巢癌細胞SKOV-3凋亡。

圖5 敲減TRIM19誘導(dǎo)SKOV-3細胞凋亡Fig.5 Knockdown of TRIM19 induced cell apoptosis in SKOV-3 cells

2.6 TRIM19 調(diào)控 p53 信號通路 敲減 TRIM19 基因后，SKOV-3 細胞凋亡率明顯上調(diào)，提示TRIM19協(xié)助SKOV-3 細胞抵抗凋亡。為探明TRIM19 基因是如何抗凋亡的，以qPCR 技術(shù)檢測多個凋亡相關(guān)信號分子表達。如圖6，敲減TRIM19 基因后，細胞中p53、p21、CyclinD、CDK2、Bax 基因表達量分別提高 2.83、3.7、2.79、4.94、6.1 倍。 當(dāng) 同 時 下調(diào)SKOV-3 細胞中的 TRIM19 基因與 p53 基因后，細胞中p53、p21、CyclinD、CDK2、Bax 表達量比對照組略有提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，在卵巢癌中，TRIM19調(diào)控p53信號通路，抵抗凋亡行為。

圖6 qPCR檢測p53相關(guān)信號分子表達Fig.6 Expressions of p53-related molecules detected by qPCR

3 討論

卵巢癌是嚴重威脅全球女性健康及生命安全的致命因素。抽樣調(diào)研表明在我國每年死于卵巢癌的女性接近2.3 萬例，且每年新增約5.6 萬例卵巢癌病患［8］。然而當(dāng)前治療卵巢癌的主要策略是手術(shù)結(jié)合放化療，對晚期患者療效甚微。二代基因組測序發(fā)現(xiàn)大部分癌癥患者遺傳基因發(fā)生變異，而這些變異正是誘導(dǎo)正常細胞癌變的關(guān)鍵因素。更不幸的是，包括卵巢癌的絕大部分癌癥均具有異質(zhì)性特征，每個亞群甚至每個患者的關(guān)鍵致病基因均可能不同。例如，MDC1 可促進卵巢癌細胞增殖和遷移［9］；過表達PinX1 基因抑制卵巢癌細胞增殖和侵襲能力［10］。大量研究揭示癌癥的遺傳異質(zhì)性是導(dǎo)致臨床上不同個體對同一個治療方案或藥物產(chǎn)生差異反應(yīng)的關(guān)鍵因素，發(fā)掘關(guān)鍵致病基因是當(dāng)前精準(zhǔn)醫(yī)療、細胞免疫治療面臨的最大挑戰(zhàn)。

TRIM19，又 稱 PML（promyelocytic leukemia protein），屬于TRIM（protein of triple motif）家族，主要在細胞核中表達，在細胞核中形成被稱為PML 核體的動態(tài)結(jié)構(gòu)，是一種早幼粒細胞白血病蛋白［11］。TRIM19 最早被發(fā)現(xiàn)能夠干擾許多病毒，包括人類免疫缺陷病毒、人泡沫病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、流感病毒、狂犬病毒、腦心肌炎病毒、腺相關(guān)病毒和水泡性口炎病毒的復(fù)制［12-17］。在部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，作為抑癌基因，TRIM19 負向調(diào)控腫瘤的DNA損傷修復(fù)、增殖、分化、凋亡、侵襲等過程［18］。在前列腺腺癌、結(jié)腸腺癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和生殖細胞腫瘤中，TRIM19 蛋白表達完全或部分喪失，并與腫瘤的分級及分期密切相關(guān)［19］。在乳腺癌中，PML 表達隨病變進展而下調(diào)，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及pTNM 分期顯著相關(guān)；生存曲線分析顯示，PML 蛋白表達水平是影響乳腺癌預(yù)后的獨立因素，其表達水平越高，患者無病生存期越長［20］。在乳腺癌和造血干細胞中，細胞水平過表達PML 能夠抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞周期阻滯、老化及細胞凋亡［21-22］。然而，每個基因在不同的腫瘤中可能發(fā)揮不同作用。在卵巢癌細胞中，沉默PML表達抑制腫瘤細胞的增殖及誘導(dǎo)DNA損傷［23］。

本研究發(fā)現(xiàn)TRIM19 在卵巢癌細胞SKOV-3、A2780、OVCAR3 中表達較人卵巢表皮細胞IOSE80表達量明顯增高。敲減TRIM19 后，SKOV-3 細胞增殖能力降低，侵襲能力明顯減弱。相反，敲減TRIM19 明顯促進卵巢癌細胞SKOV-3 凋亡。本研究進一步證實TRIM19 基因在卵巢癌生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮致癌作用，同時本研究初步闡釋了TRIM19 基因誘發(fā)卵巢癌的分子機制。

p53 是一種重要的腫瘤抑制因子，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，選擇性地轉(zhuǎn)錄其靶基因，調(diào)控多種細胞應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮其抑制腫瘤的功能。TRIM 與p53 在抗腫瘤作用中相互調(diào)控，許多TRIM 是p53的負或正調(diào)控因子，同時許多 TRIM 被 p53 調(diào)控，介導(dǎo) p53 在細胞應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤抑制中的功能。很多帶有Ring結(jié)構(gòu)域的TRIM 可以與p53 結(jié)合，如TRIM24、TRIM39、 TRIM32、 TRIM59、 TRIM31、 TRIM71、TRIM69 和TRIM23，導(dǎo)致p53 泛素化和降解。另外，部分編碼TRIM 的基因是p53 的直接靶基因，p53 能夠 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 節(jié) TRIM3、TRIM8、TRIM19、TRIM22、TRIM24、TRIM32、TRIM67和TRIML2［7］。本研究中，敲 減 TRIM19 基因 后，qPCR 檢測 發(fā)現(xiàn) p53、p21、CyclinD、CDK2、Bax 表達增加，提示敲減 TRIM19 可能激活p53 依賴的凋亡信號通路，促進腫瘤細胞的凋亡。然而，TRIM19 與p53 信號是如何聯(lián)系的，二者之間的介導(dǎo)分子是什么？TRIM19 對卵巢癌細胞體內(nèi)生長的作用是什么？這些問題需要更深入的研究，也是課題組后期的研究計劃。

本研究證實，TRIM19基因在卵巢癌細胞SKOV-3、A2780、OVCAR3 中高表達。敲減 TRIM19 可明顯抑制卵巢癌細胞SKOV-3 增殖、侵襲能力并促進凋亡。機制研究表明TRIM19 可調(diào)控p53 依賴的凋亡信號通路。因此，TRIM19 具有成為卵巢癌治療的新靶點潛力，課題組將繼續(xù)研究TRIM19 對卵巢癌的發(fā)病及轉(zhuǎn)移的作用及深層分子機制。