分泌anti-PD-L1及IFNα的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合治療小鼠黑色素瘤①

林 浩 李 民 韓 萍 楊選明 （上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200240）

腫瘤及其周圍的免疫細(xì)胞、免疫分子、細(xì)胞外基質(zhì)、血管和淋巴網(wǎng)絡(luò)等共同組成了免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，抑制抗腫瘤免疫細(xì)胞如T細(xì)胞和NK細(xì)胞的活化和效應(yīng)功能，誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制細(xì)胞如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、髓系來源的抑制細(xì)胞等，幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視［1-2］。因此，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，改變其免疫抑制性是提高腫瘤治療效果的關(guān)鍵之一［3-4］。

近年來，以免疫檢查點(diǎn)治療為代表的腫瘤免疫治療在臨床上取得巨大突破，但臨床上僅有部分患者對免疫治療有較好的響應(yīng)，仍然許多患者對免疫治療不響應(yīng)或在初始響應(yīng)后發(fā)生耐受性，因此，關(guān)于免疫檢查點(diǎn)阻斷治療方案仍需繼續(xù)改善［5-7］。PD-L1是細(xì)胞程序性死亡蛋白（programmed death-1，PD-1）的兩個(gè)配體之一，廣泛表達(dá)于造血與非造血干細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)都能表達(dá)PD-L1，PD-1/PD-L1 是最知名的免疫檢查點(diǎn)通路之一，在腫瘤環(huán)境中，PD-1和PD-L1 的結(jié)合可傳遞T 細(xì)胞負(fù)向調(diào)控信號，從而削弱T 細(xì)胞的抗腫瘤功能，anti-PD-L1 抗體可阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合，解除T細(xì)胞的抑制信號，恢復(fù)T 細(xì)胞活化和效應(yīng)功能，達(dá)到治療腫瘤的效果［8-9］。PD-1/PD-L1 信號通路阻斷抗體對多種腫瘤有治療效果，但也有相當(dāng)一部分患者對PD-1/PD-L1 抗體治療缺乏響應(yīng)，其中的原因與機(jī)制目前尚無定論，腫瘤組織缺乏足夠的淋巴細(xì)胞浸潤，腫瘤突變負(fù)荷較低，腫瘤微環(huán)境內(nèi)PD-1/PD-L1表達(dá)水平低以及多種免疫抑制性細(xì)胞的作用均可能導(dǎo)致治療效果不佳［10-13］。

IFNα是Ⅰ型干擾素家族成員，是最早被用于臨床治療的干擾素，也是目前臨床上腫瘤免疫治療最常用的細(xì)胞因子之一［14］。研究表明，IFNα可誘導(dǎo)腫瘤表面MHCⅠ分子表達(dá)，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞活化，其還可活化效應(yīng)T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［15］。IFNα 通過調(diào)控淋巴細(xì)胞活性以及對腫瘤的浸潤，可以調(diào)節(jié)免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，此外，IFNα 還可直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成，協(xié)同作用達(dá)到抗腫瘤的效果。然而，IFNα 高劑量及毒副作用是制約其臨床應(yīng)用的主要原因［16-18］。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類多能干細(xì)胞，可以從骨髓、脂肪組織、胎盤、臍帶等多種組織中分離出來，由于其易分離、易培養(yǎng)擴(kuò)增、免疫原性低等特點(diǎn)在臨床上有廣泛用途［19-20］。既往研究表明MSC 存在特殊的歸巢機(jī)制，外源性的MSC 具有向體內(nèi)受損的組織、炎癥部位以及腫瘤組織遷移的能力，因此MSC 可作為抗腫瘤藥物的載體用于腫瘤治療［21-22］。本研究以MSC 為載體，分別構(gòu)建了能分泌 anti-PD-L1 蛋白和 IFNα4 蛋白的 MSC 細(xì)胞系，利用MSC 的歸巢特性，聯(lián)合腫瘤免疫檢查點(diǎn)阻斷抗體和細(xì)胞因子兩種免疫治療方法，靶向調(diào)控腫瘤微環(huán)境，從而提高治療腫瘤的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)均采用雌性6～8周齡小鼠。C57BL/6 小鼠［體質(zhì)量（17.0±1.1）g］購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。OT-Ⅰ轉(zhuǎn)基因小鼠［體質(zhì)量（17.8±0.5）g］購自美國 Jackson 實(shí)驗(yàn)室。NDG免疫缺陷小鼠［體質(zhì)量（20.2±1.4）g］購自百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司。小鼠的繁殖、飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)均在恒溫（20～26℃）、恒濕（50%～56%）的SPF級動(dòng)物房進(jìn)行。動(dòng)物的培育和使用符合國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用準(zhǔn)則及上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理與使用委員會(huì)規(guī)則。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 Lenti-293X 細(xì)胞購自美國Clontech 公司；MSC 細(xì)胞由上海隆耀生物科技有限公司饋贈(zèng)；B16-OVA 細(xì)胞由美國芝加哥大學(xué)Hans Schreiber饋贈(zèng)。表達(dá)質(zhì)粒pCDH-EF1-MCS購自美國System Biosciences 公司；DMEM、α-MEM、RPMI 等液體培養(yǎng)基和雙抗購自Hyclone 公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司；分子克隆所用酶購自美國NEB 公司；CCK-8 溶液購自日本同仁公司；WB（Western blot）實(shí)驗(yàn)所用抗體購自美國 Sigma 公司；qPCR 實(shí)驗(yàn)所用試劑購自南京諾唯贊生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系的構(gòu)建和培養(yǎng) 將anti-PD-L1（或IFNα4）及hFc 序列克隆到改造后的表達(dá)質(zhì)粒pCDH-EF1-MCS-puro 上 ，構(gòu) 建 出 pCDH-EF1-anti-PD-L1-Fc 及 pCDH-EF1-IFNα4-Fc 重組質(zhì)粒并分別生產(chǎn)慢病毒，利用慢病毒感染MSC 細(xì)胞，通過puromycin 篩 選 后 獲 得 MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSCIFNα4-Fc 兩種細(xì)胞系。本實(shí)驗(yàn)所用的MSC 細(xì)胞均在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為含15%胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基。

1.2.2 細(xì)胞系的鑒定與表征 37℃恒溫培養(yǎng)MSC、MSC-anti-PD-L1-Fc、MSC-IFNα4-Fc 3 種細(xì)胞，換液后24 h 收集上清，通過ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測Fc 融合蛋白含量；利用Protein A Beads富集3種細(xì)胞上清中的Fc蛋白并使用WB 進(jìn)行檢測，分析Fc融合蛋白對應(yīng)條帶。收集MSC-anti-PD-L1-Fc 的上清作為一抗，與表達(dá)PD-L1 的黑色素瘤B16-OVA 細(xì)胞共同孵育，流式檢測B16-OVA 細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)水平。收集MSC-IFNα4-Fc 細(xì)胞上清與B16-OVA 細(xì)胞共同孵育，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測B16-OVA細(xì)胞表面PD-L1和MHCⅠ分子表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn) 100 μl的 B16-OVA 細(xì)胞懸液置于96 孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板在37℃恒溫培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)板中加入等體積的MSC 細(xì)胞培養(yǎng)上清液和對照培養(yǎng)基，孵育24 h 后每孔加入10 μl CCK-8 溶液，搖床內(nèi)孵育2 h后，酶標(biāo)儀測定其在450 nm處的吸光值。

1.2.4 OT-Ⅰ-T 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn) 取OT-Ⅰ小鼠的脾臟，研磨后用紅細(xì)胞裂解液1×ACK 裂解，中和后離心獲得包含T 淋巴細(xì)胞的脾臟細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 培養(yǎng)基中，將脾臟細(xì)胞、B16-OVA細(xì)胞及MSC 細(xì)胞系上清液加入96 孔板中共培養(yǎng)，48 h 后對B16-OVA 細(xì)胞計(jì)數(shù)并收集上清液，利用CBA檢測上清液中IFN-γ的表達(dá)水平。

1.2.5 小鼠腫瘤生長與測量 取6～8周齡的小鼠，在其背部右側(cè)皮下注射約7.5×105個(gè)B16-OVA 細(xì)胞，1 周后測量小鼠腫瘤體積［長（mm）×寬（mm）×高（mm）/2］，并使用構(gòu)建的MSC 細(xì)胞系在腫瘤所在位置皮下治療，每周2次測量腫瘤體積。

1.2.6 MSC 細(xì)胞體內(nèi)存續(xù)分析 對治療后的C57BL/6 小鼠進(jìn)行周期性靜脈取血，ELISA 檢測分析血液內(nèi)Fc濃度。取約8周齡的NDG 小鼠，皮下接種7.5×105個(gè)B16-OVA細(xì)胞，1周后靜脈注射1×106個(gè)MSC 細(xì)胞，取不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠腫瘤組織并提取全基因組DNA，利用qPCR檢測MSC細(xì)胞的DNA。

1.2.7 小鼠腫瘤微環(huán)境分析 利用MSC 細(xì)胞系治療荷瘤小鼠7 d 后，稱取約150 mg 腫瘤組織，盡可能剪碎后，利用含10%Liberase L、8%DnaseI和1%雙抗的RPMI 培養(yǎng)基作為消化液擠壓、研磨、消化，37℃搖床孵育約15 min 后利用EDTA 溶液和血清中和消化液，移液槍吹勻后轉(zhuǎn)移至70 μm的濾膜過濾，利用含10%FBS的RPMI培養(yǎng)基沖洗，獲得細(xì)胞懸液后離心并棄去上清，重懸細(xì)胞于PBS 緩沖液。加入不同的單克隆抗體組合于4℃孵育，流式分析腫瘤微環(huán)境中各類群免疫細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 兩組間數(shù)據(jù)比較使用非成對雙尾T檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析。誤差條代表標(biāo)準(zhǔn)差或標(biāo)準(zhǔn)誤。（統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的意義用P表示，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義、P＜0.05、P＜0.01 和P＜0.001分別以ns、*、**和***表示）。

2 結(jié)果

2.1 MSC 細(xì)胞系的構(gòu)建與鑒定 ELISA 檢測結(jié)果顯示 MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSC-IFNα4-Fc 兩種細(xì)胞系的上清中都有Fc 蛋白的表達(dá)（圖1A），WB 檢測結(jié)果與ELISA 結(jié)果相符（圖1B）。流式分析可檢測到與MSC-anti-PD-L1-Fc 的上清共同孵育的B16-OVA細(xì)胞表面PD-L1 的表達(dá)（圖1C）。以上結(jié)果證明構(gòu)建的兩種MSC 細(xì)胞系都能在體外分泌Fc 蛋白，MSC-anti-PD-L1-Fc 細(xì)胞系分泌的上清具有anti-PDL1抗體功能。

圖1 改造分泌免疫調(diào)節(jié)分子的MSCs細(xì)胞系Fig.1 Engineering MSCs to secret anti-PD-L1-Fc and IFNα4-Fc

2.2 MSC 細(xì)胞系的體外功能驗(yàn)證 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比對照組，加入MSC-IFNα4-Fc細(xì)胞上清的B16-OVA細(xì)胞生長受到顯著抑制（P＜0.001，圖2A）。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相比對照組，MSC-IFNα4-Fc細(xì)胞上清液可顯著提升B16-OVA 細(xì)胞表面的PD-L1 及MHCⅠ的表達(dá)水平（圖2B、C，P＜0.001）。

OT-Ⅰ-T 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是MSC-anti-PD-L1-Fc 細(xì)胞上清還是 MSC-IFNα4-Fc 細(xì)胞上清，都能顯著增強(qiáng)OT-Ⅰ小鼠T 細(xì)胞對黑色素瘤細(xì)胞的殺傷能力，相比之下，MSC-IFNα4-Fc 細(xì)胞上清對OT-Ⅰ小鼠T 細(xì)胞的殺傷能力提升比MSC-anti-PD-L1-Fc 細(xì)胞上清更強(qiáng)（圖2D），原因可能是IFNα4不僅能活化OT-Ⅰ小鼠T 細(xì)胞，還對B16-OVA 細(xì)胞的生長有直接抑制作用。OT-Ⅰ小鼠T 細(xì)胞與B16-OVA 細(xì)胞共培養(yǎng)上清流式檢測結(jié)果表明，MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSC-IFNα4-Fc 細(xì)胞上清都能促使 T 細(xì)胞IFN-γ表達(dá)水平顯著提高（P＜0.001，圖2E）。

圖2 MSC細(xì)胞系分泌免疫調(diào)控蛋白的體外功能研究Fig.2 Functional characterization of MSC-secreted IFNα4-Fc and anti-PD-L1-Fc in vitro

以上實(shí)驗(yàn)表明MSC-anti-PD-L1-Fc和MSC-IFNα4-Fc 兩種細(xì)胞系在體外情況下可分泌有功能活性的an-PD-L1-Fc 和 IFNα4-Fc 蛋白，并且都能在體外刺激T 細(xì)胞活化，提升對小鼠黑色素瘤的殺傷能力，IFNα4-Fc 蛋白還能直接作用于黑色素瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長。

2.3 MSC 細(xì)胞系的體內(nèi)藥效及分布 對治療后的小鼠靜脈取血，ELISA 檢測分析血液內(nèi)Fc 濃度，結(jié)果顯示治療后第3 天所有小鼠血液均檢測到Fc，第8天時(shí)大部分小鼠血液內(nèi)依然存在一定濃度的Fc（圖3A），證明該治療在小鼠體內(nèi)有較好的持續(xù)性。

圖3 MSCs細(xì)胞在體內(nèi)的藥效及分布Fig.3 In vivo duration of PD-L1-Fc and IFNα4-Fc secreted from MSCs

在NDG 小鼠B16-OVA 腫瘤模型中，利用qPCR檢測是否存在MSC 細(xì)胞，結(jié)果顯示在MSC 細(xì)胞治療后的10 d 內(nèi)，小鼠腫瘤組織中可檢測到MSC 細(xì)胞（圖3B），說明本研究中使用的MSC細(xì)胞具有向炎癥性腫瘤環(huán)境遷移并在腫瘤內(nèi)長期存續(xù)的能力。

2.4 MSC 細(xì)胞系的體內(nèi)抗腫瘤活性研究 在C57BL/6 小鼠體內(nèi)構(gòu)建B16-OVA 腫瘤模型研究MSC-anti-PD-L1-Fc 和 MSC-IFNα4-Fc 在體內(nèi)的抗腫瘤功能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MSC-anti-PD-L1-Fc 和MSCIFNα4-Fc 的聯(lián)合治療可顯著抑制腫瘤的生長（P＜0.001，圖4A），相比于單獨(dú)的MSC-anti-PD-L1-Fc 或MSC-IFNα4-Fc治療，聯(lián)合治療對腫瘤生長抑制作用更加明顯（P＜0.05），相比對照組，接受MSC-anti-PDL1-Fc 或MSC-IFNα4-Fc 治療的小鼠生存時(shí)間均顯著延長（P＜0.05），聯(lián)合治療組的效果更為顯著（P＜0.01，圖4B）。流式分析小鼠腫瘤微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示MSC 聯(lián)合治療可顯著提升CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞浸潤，單獨(dú)治療可以提升CD8+T 細(xì)胞浸潤，但對CD4+T 細(xì)胞浸潤提升不明顯（圖4C、D），由此推測MSC 聯(lián)合治療主要依賴CD8+T 細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤功能，聯(lián)合治療中anti-PD-L1和IFNα4具有協(xié)同作用，提升CD4+T細(xì)胞的浸潤，因此能進(jìn)一步提高治療腫瘤的效果。

圖4 MSC細(xì)胞系的體內(nèi)抗腫瘤活性研究Fig.4 Anti-tumor activity of MSC-anti-PD-L1-Fc and MSC-IFNα4-Fc in vivo

3 討論

隨著對腫瘤研究的不斷深入，研究者們意識到腫瘤的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤細(xì)胞從被免疫系統(tǒng)識別監(jiān)控，被清除或抑制，到和免疫系統(tǒng)彼此共存并持續(xù)對抗，最終發(fā)展成腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)控，迅速增殖并開始向周邊組織侵襲和轉(zhuǎn)移［23-24］。腫瘤免疫治療是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)，其通過活化機(jī)體免疫系統(tǒng)，恢復(fù)被抑制的抗腫瘤免疫反應(yīng)達(dá)到治療腫瘤的效果，理論上其相比于傳統(tǒng)的化療等治療方式具有更好的靶向性和更低的副作用［25-27］。目前，以 PD-1/PD-L1 免疫阻斷和CAR-T 細(xì)胞療法為代表的免疫治療在多種腫瘤中都顯示了長期、顯著的療效，但這種良好的治療效果往往只限于部分患者，大部分患者往往對免疫治療響應(yīng)不足甚至不響應(yīng)，造成這一情況的機(jī)制目前尚在研究之中。腫瘤免疫治療起效需要免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的特異性識別，效應(yīng)細(xì)胞的足量增殖及活化免疫細(xì)胞可對腫瘤組織的充分浸潤［2］。腫瘤細(xì)胞通過免疫抑制的腫瘤微環(huán)境介導(dǎo)免疫逃逸和免疫耐受，改變抑制性的腫瘤微環(huán)境是恢復(fù)免疫系統(tǒng)抗腫瘤功能，提高免疫治療效果的關(guān)鍵之一［3］。本研究利用改造的MSC 從免疫檢查點(diǎn)阻斷和細(xì)胞因子兩個(gè)方面調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境并活化免疫細(xì)胞，從而提高腫瘤治療效果。

PD-1/PD-L1 通路抑制是目前臨床上最常用的免疫檢查點(diǎn)抑制之一，臨床上只有一部分腫瘤患者響應(yīng)PD-1/PD-L1 抗體治療，有效的PD-L1 抗體治療不僅需要腫瘤微環(huán)境中存在足夠的PD-L1 抗體，而且需要足夠的淋巴細(xì)胞浸潤腫瘤組織［28］。IFNα 是臨床上免疫治療中常用的細(xì)胞因子，具有活化免疫細(xì)胞，調(diào)控腫瘤環(huán)境、抑制腫瘤細(xì)胞生長的功能，但其在體內(nèi)半衰期較短，缺乏對腫瘤組織的靶向性，劑量過高時(shí)也會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用。本研究利用MSC 細(xì)胞聯(lián)合PD-L1 抗體和IFNα 兩種免疫治療手段，綜合二者的優(yōu)勢改善抑制性的腫瘤微環(huán)境，協(xié)同治療腫瘤。MSC 細(xì)胞由于其低免疫原性和向腫瘤組織遷移的能力，是理想的腫瘤靶向治療載體，課題組在基因水平改造MSC 細(xì)胞，使其具備分泌anti-PD-L1-Fc 和IFNα4-Fc 蛋白的能力。有研究表明，MSC 細(xì)胞具有免疫抑制和促進(jìn)腫瘤生長功能，具體通過 IDO、iNOS 等機(jī)制實(shí)現(xiàn)，IDO 是一種具有免疫調(diào)節(jié)能力的酶，可分解色氨酸，并能通過代謝通路生成犬尿氨酸，色氨酸是T 細(xì)胞活化的必需氨基酸，而犬尿氨酸則對T細(xì)胞活化有抑制作用，人源的MSC 細(xì)胞能表達(dá)IDO 進(jìn)而產(chǎn)生免疫抑制性［29-32］，因此將MSC 用于腫瘤治療可能會(huì)增強(qiáng)免疫抑制，影響治療效果。本實(shí)驗(yàn)使用MSC 細(xì)胞取得了顯著的抗腫瘤效果，一方面可能是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)使用了IFNα-Fc 蛋白，研究顯示干擾素蛋白轉(zhuǎn)染后的MSC 細(xì)胞免疫抑制效果會(huì)減弱，免疫反應(yīng)會(huì)由促腫瘤向抗腫瘤轉(zhuǎn)變［33］；另一方面，已有大量研究表明MSC 作為載體攜帶藥效分子的抗腫瘤治療具有可行性，這些藥效分子通常有較強(qiáng)的治療效果，相比之下MSC 自身潛在的促腫瘤效果可能會(huì)被覆蓋［34-36］。在本研究中，anti-PD-L1-Fc 和 IFNα4-Fc 兩種蛋白在腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)，在腫瘤微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)中占主導(dǎo)地位，這種情況下，MSC 自身的免疫抑制作用可能比較有限；此外，本研究使用的MSC 細(xì)胞來源為臍帶，相比其他MSC，臍帶來源的MSC免疫抑制能力更弱，適用于腫瘤治療［37］。

在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，改造后的MSC 細(xì)胞都顯示了抗腫瘤功能。在小鼠腫瘤模型中，MSC-anti-PD-L1-Fc 和MSC-IFNα4-Fc 兩種細(xì)胞的聯(lián)合治療改善了腫瘤微環(huán)境，增加CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的浸潤，延長了小鼠的生存時(shí)間，相比單獨(dú)治療，聯(lián)合治療對腫瘤生長的抑制更加明顯。聯(lián)合治療可綜合兩種治療方法的優(yōu)勢，彌補(bǔ)單獨(dú)治療的局限性，腫瘤微環(huán)境中IFNα 的免疫調(diào)控能力可增加淋巴細(xì)胞對腫瘤的浸潤，提升PD-L1 抗體的功能。IFNα 和anti-PD-L1共同作用，提升了對T淋巴細(xì)胞的活化能力。腫瘤環(huán)境中IFNα 會(huì)導(dǎo)致PD-L1 分子表達(dá)水平上調(diào)，在聯(lián)合治療中，PD-L1分子表達(dá)水平上調(diào)可能導(dǎo)致了MSC 分泌的anti-PD-L1-Fc 蛋白在腫瘤微環(huán)境中富集，提升了靶向抗腫瘤能力。MSC 細(xì)胞向腫瘤組織的歸巢能力可確保anti-PD-L1-Fc和IFNα4-Fc蛋白能靶向進(jìn)入腫瘤微環(huán)境發(fā)揮功能，降低毒副作用。通過MSC 細(xì)胞持續(xù)表達(dá)兩種蛋白可以延長治療持續(xù)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)檢測大部分小鼠血清中的重組蛋白可以存在超過1 周，相比傳統(tǒng)細(xì)胞因子直接注射治療，MSC 細(xì)胞治療的方式藥效時(shí)間更長。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)以MSC 細(xì)胞為載體，通過基因改造方式分別構(gòu)建了能表達(dá)anti-PD-L1-Fc 和IFNα4-Fc的MSC 細(xì)胞系，通過聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷治療和細(xì)胞因子治療兩種免疫治療方法調(diào)控腫瘤微環(huán)境，提升了對腫瘤的治療效果。anti-PD-L1-Fc和IFNα4-Fc二者聯(lián)合治療可以綜合雙方的優(yōu)勢，并在一定程度上彌補(bǔ)單獨(dú)治療的局限性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明利用MSC 細(xì)胞作為載體的聯(lián)合免疫治療方式是可行的思路，并有望成為未來臨床上提高腫瘤免疫治療效果的新策略。