β-arrestin-2靶向NF-κB通路抑制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中FLSs的炎性反應(yīng)

曹 峰 黃 承 程繼偉 余 霄

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)能夠?qū)е萝浌呛凸趋赖倪M(jìn)行性破壞，其主要特征是滑膜發(fā)炎[1]。成纖維樣滑膜細(xì)胞 (fbroblast-like synoviocyte, FLS) 作為滑膜的主要組成部分，其產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶能夠致使軟骨破壞[2]。因此，抑制FLS炎性反應(yīng)是RA的有效治療手段。有研究顯示，阻斷RA的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄途徑之一的NF-κB信號(hào)通路的信號(hào)傳遞可以調(diào)控RA引起的炎性反應(yīng)[3]。β-arrestin-2蛋白是G蛋白偶聯(lián)受體-β腎上腺素受體重要調(diào)節(jié)蛋白2[4]。已有研究顯示，β-arrestin-2在RA等多種炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮抗炎作用[5，6]。β-arrestin-2能夠作為支架蛋白參與調(diào)控NF-κB通路，然而，目前在RA中關(guān)于β-arrestin-2調(diào)控NF-κB通路的研究較少[5]。本研究使用膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)小鼠作為模型，分離獲取RA-FLSs細(xì)胞，并在該細(xì)胞中探討β-arrestin-2對(duì)RA-FLS炎性反應(yīng)的影響，結(jié)果證實(shí)β-arrestin-2通過(guò)NF-κB通路抑制炎性因子的產(chǎn)生。本研究闡明β-arrestin-2通過(guò)NF-κB通路影響FLS炎性反應(yīng)，為開(kāi)發(fā)RA新的治療靶點(diǎn)提供了新的理論依據(jù)。

材料與方法

1.試劑:牛Ⅱ型膠原(20021)購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司，弗氏完全佐劑(P2036-50ml)、弗氏不完全佐劑(P2031-50ml)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)， DMEM培養(yǎng)基(SH30022.01)、胎牛血清(SH30070.03)、PBS(SH30256.01B)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，總RNA提取試劑盒(R1200-50)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，蛋白提取試劑盒(BC3710)，BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒(C503021-0500)，兔抗GAPDH多克隆抗體(D110016-0100)購(gòu)自生工生物工程股份有限公司，兔抗Phospho-IκBα單克隆抗體(2859S)、兔抗IκBα單克隆抗體(4812S)、兔抗Phospho-P65單克隆抗體(3033S)、兔抗P65單克隆抗體(8242S)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，MMP3單克隆抗體(MA5-17123)、兔抗MMP13單克隆抗體(MA5-14238)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)所用SPF級(jí)，6～8周齡，DBA/1雄性小鼠購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，25 ℃下飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境潔凈。按照標(biāo)準(zhǔn)提供SPF級(jí)水與食物，保證小鼠的平均體質(zhì)量為18±2g，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，將小鼠分為正常組(8只)、CIA模型組(16只)。該實(shí)驗(yàn)方案已通過(guò)浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)(ZJCLA-IACUC-20010018)。

3.構(gòu)建小鼠CIA模型：將小鼠隨機(jī)分為空白組和CIA模型組?？瞻捉M：不接受牛Ⅱ型膠原免疫的正常小鼠；CIA模型組為接受牛Ⅱ型膠原免疫的小鼠。使用濃度為2mg/ml的牛Ⅱ型膠原蛋白，與完全弗氏佐劑等體積1∶1混合，同時(shí)冰浴，超聲乳化混勻，于小鼠尾巴根部皮下注射100μl進(jìn)行首次免疫，21天后，進(jìn)行加強(qiáng)免疫, 使用濃度為2mg/ml的牛Ⅱ型膠原蛋白與不完全弗氏佐劑按照等體積1∶1混合，冰浴上超聲乳化混勻,于小鼠尾巴根部皮下注射100μl。

4.獲取RA-FLSs細(xì)胞:實(shí)驗(yàn)前麻醉小鼠，分離裸關(guān)節(jié)滑膜組織，預(yù)冷含雙抗的PBS，冰上沖洗滑膜組織5次，然后將組織剪碎為1mm3碎片，膠原酶消化獲取RA-FLSs,以2×106的密度接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。密度達(dá)80%時(shí)，將構(gòu)建的β-arrestin-2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理:將RA-FLSs細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、β-arrestin-2過(guò)表達(dá)組(β-arrestin-2 over)，qRT-PCR、Western blot法分別檢測(cè)IL-1β、IL-6、MMP3、MMP13及NF-κB通路中P65、p-P65、IκBα、p-IκBα蛋白的表達(dá)水平。

為進(jìn)一步研究β-arrestin-2是否靶向NF-κB調(diào)節(jié)RA-FLSs中炎性細(xì)胞因子和軟骨基因的分泌與表達(dá)，將細(xì)胞分為對(duì)照組(Control)、β-arrestin-2過(guò)表達(dá)組(β-arrestin-2 over)、NF-κB通路抑制劑對(duì)照組(BAY 11-7082)、NF-κB通路抑制劑+β-arrestin-2過(guò)表達(dá)組(BAY 11-7082+β-arrestin-2 over)，在細(xì)胞處理48h后，qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞炎性因子和相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)。

6.qRT-PCR：棄掉細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用RNA提取試劑盒處理細(xì)胞獲得RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，適當(dāng)稀釋后，在ABI 7500 qPCR儀中檢測(cè)IL-1β、IL-6的轉(zhuǎn)錄水平，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析各mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列詳見(jiàn)表1。

表1 上下游引物序列

7.Western blot法檢測(cè):收集樣品提取總蛋白，滴定濃度，制備蛋白樣品，電泳(80V,120min)、轉(zhuǎn)膜(100V,120min)、脫脂奶粉封閉(5%，1h)，洗膜(3次，10分鐘/次)，加入稀釋后的一抗(MMP3、MMP13、Phospho-IκBα、IκBα、Phospho-P65、P65)，孵育過(guò)夜，加入稀釋好的二抗，ECL顯色液混合均勻，滴加在PVDF膜上，曝光顯影。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用GraphPad Prism 8.0.1進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Unpairedt檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.成功制備CIA模型:第2次免疫后觀察小鼠的兩后足踝關(guān)節(jié)，包括足趾與足掌出現(xiàn)嚴(yán)重紅腫現(xiàn)象，并通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量以比較不同時(shí)期足趾腫脹程度(表2)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的各個(gè)關(guān)節(jié)明顯膨大變形(圖1)。與RA患者有相似的病理學(xué)特征，說(shuō)明小鼠模型制備成功。

表2 正常組和CIA模型組不同時(shí)期左足腫脹程度比較

圖1 CIA模型制備成功A.正常組；B.CIA模型組

2.β-arrestin-2抑制RA-FLSs中促炎性細(xì)胞因子分泌：在初次免疫后第45天對(duì)CIA模型組小鼠進(jìn)行麻醉，并切除踝關(guān)節(jié)滑膜組織，處理后獲得RA-FLSs。有研究報(bào)道顯示，β-arrestin-2在FLS中的異常表達(dá)，并且在RA等多種炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮抗炎作用[5]。因此，為了研究β-arrestin-2對(duì)RA-FLSs的作用，在RA-FLS細(xì)胞中過(guò)表達(dá)β-arrestin-2(圖2 A)，通過(guò)TNF-α(TNF-α是RA發(fā)病機(jī)制中最常見(jiàn)的促炎性刺激物)刺激細(xì)胞24h，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)炎性因子IL-1β、IL-6 mRNA的水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，β-arrestin-2過(guò)表達(dá)處理會(huì)降低RA-FLSs細(xì)胞中炎性因子的水平(圖2B、C)[7]。

圖2 RA-FLSs中β-arrestin-2、炎性因子水平檢測(cè)A.β-arrestin-2表達(dá)情況；B.IL-1β mRNA表達(dá)水平；C.IL-6 mRNA表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，*P<0.05

3.β-arrestin-2抑制RA-FLSs中軟骨基因表達(dá)：有研究顯示MMP3能夠破壞關(guān)節(jié)組織，而MMP13在基質(zhì)破壞中具有重要作用，因此同時(shí)對(duì)RA-FLSs中MMP3、MMP13的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，與對(duì)照組比較，β-arrestin-2過(guò)表達(dá)處理會(huì)降低RA-FLSs中MMP3和MMP13的表達(dá)水平(圖3)。

圖3 RA-FLSs中MMP3和MMP13表達(dá)水平

4.β-arrestin-2抑制RA-FLSs中NF-κB通路：為了研究RA-FLSs中的NF-κB通路，筆者檢測(cè)了細(xì)胞中NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)β-arrestin-2會(huì)顯著降低p-P65和p-IκBα表達(dá)水平(圖4)。

圖4 RA-FLSs中NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平

5.β-arrestin-2通過(guò)NF-κB通路抑制RA-FLSs細(xì)胞炎性因子分泌和軟骨基因表達(dá)：為了驗(yàn)證β-arrestin-2通過(guò)調(diào)控NF-κB通路影響RA-FLSs細(xì)胞炎性因子分泌和軟骨基因表達(dá)，通過(guò)β-arrestin-2或NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082處理RA-FLS細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在β-arrestin-2或BAY 11-7082均能夠抑制炎性因子和軟骨基因的水平，而上述水平在β-arrestin-2 over+BAY 11-7082組中進(jìn)一步降低(圖5)。

圖5 RA-FLSs中軟骨基因、炎性因子水平A.MMP3和MMP13表達(dá)水平；B.IL-6；C.IL-1β；與對(duì)照組比較，*P<0.05；與β-arrestin-2過(guò)表達(dá)組或BAY 11-7082組比較，#P<0.05

討 論

RA常表現(xiàn)為滑液中炎性細(xì)胞增多，是一種自身免疫性疾病。在疾病的發(fā)展過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨持續(xù)性受損，也可引起機(jī)體其他部位的損傷，在RA的病程中，常導(dǎo)致滑膜、關(guān)節(jié)、軟骨等組織的不可逆損傷[8,9]。但目前關(guān)于RA機(jī)制的研究尚不十分明確，缺乏有效的治療措施，目前主要使用的藥物有：非留體抗炎藥(non-retained anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、傳統(tǒng)慢性抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素類等藥物，也包括生物制劑和基因治療等，但現(xiàn)有臨床藥物無(wú)法根治RA，且常伴隨一些不良反應(yīng)，因此亟待探索新的治療策略[10]。

FLS是滑膜組成中的重要成分，在RA的起始、持續(xù)中的作用十分關(guān)鍵，其能夠產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)，并且可以與浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞互作，引起滑膜病變、關(guān)節(jié)破壞，致使關(guān)節(jié)軟骨退化，近關(guān)節(jié)骨組織受損[11, 12]。軟骨細(xì)胞受到來(lái)自FLS分泌的促炎性細(xì)胞因子、趨化因子的刺激，表達(dá)的金屬蛋白酶能夠降解包含軟骨、軟骨下骨在內(nèi)的結(jié)締組織，使關(guān)節(jié)受損更加嚴(yán)重[9]。作為影響RA的重要因素之一，F(xiàn)LS的增多、移位都影響RA的炎性反應(yīng)過(guò)程，或許能夠通過(guò)調(diào)節(jié)FLS的功能，達(dá)到治療RA的目的。因此，本研究自小鼠CIA模型中分離RA-FLSs細(xì)胞作為研究對(duì)象用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

β-arrestin-2作為G蛋白偶聯(lián)受體的調(diào)節(jié)蛋白，可以參與調(diào)控NF-κB通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌[5]。其中IL-1β、IL-6、IL-17和腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎性細(xì)胞因子在RA的疾病進(jìn)程中有著重要作用[13]。本研究在過(guò)表達(dá)RA-FLSs中β-arrestin-2后，對(duì)IL-1β、IL-6的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)β-arrestin-2能夠抑制促炎性細(xì)胞因子的釋放。在RA疾病發(fā)展中產(chǎn)生的IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子能夠刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的產(chǎn)生，這些蛋白酶常導(dǎo)致軟骨、肌腱等組織的不可逆損傷[14]。其中MMP3能夠?qū)е露喾N類型膠原蛋白的降解，破壞關(guān)節(jié)組織；MMP13除了膠原蛋白，也降解蛋白多糖分子，在基質(zhì)破壞中具有雙重的作用[15]。本研究通過(guò)Western blot法檢測(cè)了MMP3、MMP13的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，β-arrestin-2抑制RA-FLSs中軟骨基因MMP3、MMP13的表達(dá)，其作用趨勢(shì)與細(xì)胞因子相一致。

NF-κB信號(hào)通路的活化影響IL-1β、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子的分泌，為進(jìn)一步明確β-arrestin-2是否通過(guò)NF-κB通路發(fā)揮抑制炎癥作用，首先通過(guò)Western blot法檢測(cè)p-P65、P65、p-IκBα、IκBα的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示這幾種蛋白的表達(dá)下調(diào)，表明β-arrestin-2可以抑制RA-FLSs中NF-κB通路的活化[16]。作為RA發(fā)病機(jī)制中重要通路之一，靶向NF-κB是治療RA的策略之一[17]。在RA患者、CIA模型中，NF-κB均有激活，已有研究證明通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，能夠緩解膠原誘導(dǎo)的小鼠RA中炎癥與關(guān)節(jié)組織的破壞[18]。為明確β-arrestin-2是否靶向NF-κB通路影響RA-FLSs細(xì)胞炎性因子、軟骨基因的分泌和表達(dá)，本研究通過(guò)使用β-arrestin-2、BAY 11-7082處理RA-FLSs細(xì)胞，結(jié)果顯示β-arrestin-2、BAY 11-7082均能降低炎性因子和軟骨基因的水平，且二者共同處理后，上述水平進(jìn)一步降低。

綜上所述，β-arrestin-2可以通過(guò)靶向抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，下調(diào)IL-1β、IL-6等炎性細(xì)胞因子的分泌水平，抑制RA-FLSs的炎性反應(yīng)，抑制軟骨基因MMP3、MMP13的表達(dá)。本研究為RA新的治療靶點(diǎn)的研究提供了新的思路，為進(jìn)一步明確β-arrestin-2是否能夠緩解RA奠定了基礎(chǔ)。