新生兒高膽紅素血癥117例病因分析

馮于玲 王 婷 紀 青 蔣最明 肖建平 周小楨

新生兒高膽紅素血癥是新生兒普遍存在的良性疾病，是生后早期住院的主要原因，多數(shù)為未結(jié)合膽紅素增高，而未結(jié)合膽紅素具有較強的神經(jīng)毒性，超過一定閾值可引起神經(jīng)功能不全綜合征(BIND)[1]。嚴重者導致膽紅素腦病，造成基底神經(jīng)節(jié)和腦干核損傷，可能遺留不同程度的聽覺、視覺、運動等能力的障礙，甚至發(fā)生死亡。新生兒高膽紅素血癥的發(fā)病因素錯綜復雜，常見為早產(chǎn)、胎膜早破、感染、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UGT1A1) 基因突變、G-6-PD酶缺乏、溶血性疾病、母乳性黃疸等[2]。不同高膽病例可能存在單一病因或混合病因，不同地區(qū)高膽的病因構(gòu)成及UG1A1基因突變點可能存在差異性，從而導致臨床上患兒出現(xiàn)不同程度的病理性黃疸。目前國內(nèi)外關(guān)于新生兒高膽紅素血癥的高危因素及相關(guān)基因分析仍需要進一步研究。本研究主要探討湖南省株洲地區(qū)新生兒高膽紅素血癥患兒常見病因，為該病的臨床診治及基礎(chǔ)研究提供參考資料。

對象與方法

1.研究對象:(1)入選標準：出生胎齡>35周，日齡<28天，體重≥2.5kg，經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準[(2018)倫審(K)第(0348)號]，患兒家屬簽署知情同意書。病例組：隨機選取2018年9月～2020年12月筆者醫(yī)院確診新生兒高膽紅素血癥的患兒117例。新生兒高膽紅素血癥的診斷標準為血清總膽紅素以間接膽紅素升高為主，時齡血清總膽紅素值達到或超過2014年新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識的新生兒小時膽紅素列線圖第95百分位,或光療參考曲線的干預(yù)標準[3]。對照組：隨機選取同期筆者醫(yī)院未達新生兒高膽紅素血癥診斷標準的新生兒65例，監(jiān)測新生兒期膽紅素水平未達光療標準。(2)排除標準：除外先天性畸形、低出生體重兒、巨大兒、遺傳代謝性疾病、染色體異常疾病等病例。(3)脫落標準:患兒病情危重或死亡，患兒家長失訪、主動退出研究等病例。

2.收集臨床資料：收集所有患兒的臨床資料，包括性別、民族、胎齡、出生體重、分娩方式、喂養(yǎng)方式、產(chǎn)婦情況、圍生期情況等，常規(guī)抽血行血常規(guī)、肝功能、G-6PD酶活性、溶血全套(包括血型、直接抗人球蛋白試驗、抗體釋放試驗、游離抗體試驗)、感染指標、甲狀腺功能等檢測，完善彩超、MRI等檢查，并收集相關(guān)檢查結(jié)果進行病因分析。

3.標本采集及DNA提?。赫髑蠡純杭议L知情同意后，收集血常規(guī)的廢棄血標本(抗凝)2ml(已通過醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準)，使用血液基因組DNA抽提試劑盒(TIANGEN 公司產(chǎn)品)，依照說明書進行外周血DNA提取，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

4.PCR反應(yīng)：根據(jù)UGT1A1基因結(jié)構(gòu)并參考文獻[4]設(shè)計引物，引物擴增包含啟動子TATA盒及5個外顯子，共7對引物詳見表1。PCR反應(yīng)體系: 總體積30μl，模板DNA 2.0μl，正向引物、反向引物各1.0μl，PCRmix 18μl，ddH2O 8μl。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性4min; 95℃變性40s，56℃退火40s，72 ℃延伸40s，循環(huán)35次;72 ℃延伸5min。PCR產(chǎn)物置于4℃保存。

5.凝膠電泳:取PCR產(chǎn)物加入上樣緩沖液混勻，行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并拍照。

6.基因測序:將鑒定正確的PCR產(chǎn)物送上海鉑尚生物工程公司進行DNA測序。測序結(jié)果與GenBank中的UGT1A1基因序列進行Blast比對，同時用Chromas軟件分析判斷堿基突變點，發(fā)現(xiàn)突變點則進行反向測序驗證。

表1 UGT1A1基因擴增及測序引物

結(jié) 果

1.一般資料:病例組患兒為2018年9月～2020年12月筆者醫(yī)院確診新生兒高膽紅素血癥的患兒117例，其中男性患兒65例，女性患兒52例，胎齡 38.63±1.05周，出生體重3.31±0.36kg，日齡<28天。

對照組患兒為同期筆者醫(yī)院未達新生兒高膽紅素血癥診斷標準的新生兒65例，其中男性患兒34例，女性患兒31例，胎齡39.01±1.13周，出生體重3.37±0.44kg，日齡<28天，其性別、胎齡、出生體重、分娩方式、喂養(yǎng)方式等與病例組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05，表2)，病例組與對照組患兒均為漢族。對照組膽紅素水平未達到新生兒高膽紅素血癥的診斷標準。

表2 兩組新生兒一般資料比較

2.病例組新生兒高膽紅素血癥的病因分析:病例組117例患兒中，共發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因G71R突變61例(52.14%)，不明原因28例(23.93%)，溶血性疾病(包括ABO血型不合溶血、RH血型不合溶血、G-6PD酶缺乏)27例(23.08%)，感染21例(17.95%)，出血性疾病(包括頭顱血腫、腦實質(zhì)出血、蛛網(wǎng)膜下腔出血、硬膜下出血)13例(11.11%)，其中有28.21%病例存在混合原因(≥2種病因)，詳見表3。

表3 病例組患兒的高膽病因分析

3.病例組中混合原因與單種原因發(fā)生TBL≥342μmol/L的比較：Logistic回歸分析顯示，病例組中混合原因與單種原因發(fā)生TBL≥342μmol/L比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.419，OR:1.486,95%CI:0.569～3.878)，詳見表4。

表4 病例組中混合原因與單種原因發(fā)生TBL≥342μmol/L的比較

4.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果:PCR產(chǎn)物均呈單一條帶，片段大小與目的片段相符合(圖1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

5.UGT1A1基因突變情況:第1外顯子區(qū)：病例組中檢測到G71R純合子10例，雜合子51例，突變頻率為52.14%；對照組中檢測到G71R純合子4例，雜合子13例，突變頻率為26.15%，詳見圖2。在啟動子區(qū)及第2～4外顯子區(qū)均未檢測到任何突變點。

圖2 UGT1A1 G71R(211G>A)位點測序圖A.純合突變；B.雜合突變

6.兩組UGT1A1基因突變點的基因型分布及等位基因頻率分析：病例組中發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因G71R突變61例，其中雜合突變51例、純合突變10例；對照組中共發(fā)現(xiàn)G71R突變17例，其中雜合突變13例、純合突變4例。兩組間G71R的突變類型分布比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=11.85，P=0.003)；病例組的G71R等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.907，P=0.003)，提示G71R突變是株洲地區(qū)新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的危險因素，詳見表5。

表5 兩組UGT1A1 G71R基因型分布和等位基因頻率分析[n(%)]

7.UGT1A1基因突變對株洲地區(qū)重度高膽紅素血癥的影響:Logistic回歸分析顯示，UGT1A1基因G71R突變類型(純合、雜合)對重度高膽紅素血癥的發(fā)生比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表6。

表6 病例組中G71R突變類型發(fā)生TBL≥342μmol/L的比較

討 論

新生兒高膽紅素血癥的病因復雜，往往是多種因素綜合作用的結(jié)果。臨床上將≥35周的新生兒，根據(jù)不同膽紅素水平升高的程度，分為重度、極重度和危險性，其中將血清膽紅素峰值(TSB)≥20mg/dl(342μmol/L)且<25mg/dl(427μmol/L)定義為新生兒重度高膽紅素血癥，TSB≥25mg/dl(427μmol/L)且<30mg/dl(513μmol/L)定義為新生兒極重度高膽紅素血癥，TSB≥30mg/dl(513μmol/L)定義為新生兒危險性高膽紅素血癥，TSB值越高提示發(fā)生神經(jīng)損害的概率越大[5]。王秋月等[6]通過多因素分析發(fā)現(xiàn)，感染、母子血型不合、早產(chǎn)是重癥高膽紅素血癥發(fā)病的危險因素。Yu等[7]研究發(fā)現(xiàn)當ABO溶血患兒合并UGT1A1基因突變(尤其是G71R純合突變)時，重度高膽紅素血癥的發(fā)生率顯著增加。而在本研究人群中，高膽紅素血癥主要原因依次為UGT1A1基因G71R突變、不明原因、溶血性疾病、感染，且混合原因引起的高膽紅素血癥占很大比例，但混合原因與單種原因相比較，前者發(fā)生重度高膽紅素血癥(TBL≥342μmol/L)的差異并不顯著，仍需要擴大樣本量進一步研究分析。目前關(guān)于高膽紅素血癥影響因素的研究越來越多，仍有許多病例的病因尚未明確，如本研究病例組中有23.93%的病例原因不明，其準確的發(fā)病原因仍需進一步探討。另外，在本研究的對照組中，患兒新生兒期無異常黃疸情況，但仍檢測到了一定數(shù)量的G71R雜合子、純合子突變，說明G71R突變可能不是導致新生兒高膽紅素血癥的唯一因素，提示高膽紅素血癥可能是多種因素共同作用的結(jié)果。

2004年美國兒科協(xié)會(AAP)及中國兒科學教材、2014年中國新生兒高膽紅素血癥專家共識中，均引用Bhutani曲線作為光療干預(yù)標準，其曲線適用于胎齡≥35周新生兒[3]。對于胎齡<35周的早產(chǎn)兒，因各器官系統(tǒng)發(fā)育不成熟，易受胎齡、出生體重、喂養(yǎng)不耐受、胎糞排出延遲等相關(guān)混雜因素影響，其高膽紅素血癥干預(yù)標準另有推薦，且仍存在爭議。故在本研究中僅納入胎齡>35周的新生兒，在今后的研究中可考慮擴大樣本量，進一步探討分析更小胎齡早產(chǎn)兒發(fā)生高膽紅素血癥的病因。

目前，UGT1A1基因多態(tài)性與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)系主要集中在啟動子區(qū)的TATA盒和編碼區(qū)上[8,9]。亞洲報道較多的是UGT1A1基因編碼區(qū)的突變，如G71R、Y486D、F83L、P229Q等，其中G71R是突變的主要類型。近年來鐘勇等[10]、卜愛林等[11]、日孜萬古麗·買吐送等[12]曾報道我國各地區(qū)G71R基因突變與新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生密切相關(guān)，證實G71R突變是我國新生兒高膽紅素血癥及遷延性黃疸發(fā)生、發(fā)展的高危因素。UGT1A1基因G71R突變?yōu)榈?外顯子存在211G→A堿基點突變，使突變點編碼的甘氨酸變?yōu)榫彼幔餟GT1A1酶活性降低，從而導致高膽紅素血癥，成為Crigler-Najjar綜合征、Gilberts綜合征等發(fā)病因素之一，與新生兒期乃至成人期膽紅素代謝異常有關(guān)。

本研究中病例組的G71R等位基因頻率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義，提示本研究人群中患兒UGT1A1基因突變以G71R突變?yōu)橹?，G71R基因突變與株洲地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生密切相關(guān)。但在本研究中，病例組G211A變異的A等位基因突變頻率(52.18%)明顯高于對照組(26.15%)，且高于來自廣東省、中國臺灣地區(qū)、廣西壯族自治區(qū)的報道[4，13，14]。存在這樣的差異，可能與地理環(huán)境不同有關(guān)，也可能是因為國內(nèi)關(guān)于UGT1A1基因的研究中大多數(shù)均選擇不明原因高膽紅素血癥患者為病例組，而本研究對病例組中所有患者均進行了UGT1A1基因檢測，從而探討了UGT1A1基因突變在人群中的發(fā)生率，提示G71R突變在普通人群中發(fā)生率較高。另外，國內(nèi)相關(guān)研究提示UGT1A1基因G71R純合突變型患兒血清膽紅素水平顯著高于雜合突變型和野生型[15]。但本研究顯示，G71R不同突變類型(純合、雜合)對株洲地區(qū)重度高膽紅素血癥的發(fā)生差異無統(tǒng)計學意義，提示同一基因位點的突變對新生兒高膽紅素血癥的影響可能在不同地區(qū)、不同人群中存在差異，需要進一步深入研究分析。

據(jù)相關(guān)報道，UGT1A1基因啟動子區(qū)域TATA盒對新生兒高膽紅素血癥的影響在人群和區(qū)域中差異很大，TATA啟動子多態(tài)性被認為是亞洲和歐洲新生兒高膽紅素血癥的一個潛在危險因素[9]。但也有研究發(fā)現(xiàn)TA7重復變異與高膽紅素血癥風險之間存在反相關(guān)，提示(TA)7突變在新生兒高膽紅素血癥的進展過程中具有保護作用[13]。目前國內(nèi)大多數(shù)研究均未發(fā)現(xiàn)TA7與新生兒高膽紅素血癥的關(guān)聯(lián)性[4，10，11]。本研究亦未檢測到(TA)7純合子插入突變，提示TATA盒突變可能與株洲地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的發(fā)生無關(guān)。

關(guān)于UGT1A1基因的研究，國內(nèi)外近年來有較多新的突變位點病例報告。國外研究者在一個CNS Ⅱ型患者檢測到UGT1A1基因近端啟動子中HNF-1α結(jié)合位點發(fā)生突變，從而出現(xiàn)嚴重高未結(jié)合膽紅素血癥[16]。國內(nèi)也報道在兩例CNS患者分別檢測到392T>C(p.Leu131Pro)、1456T>G(p.Tyr486Asp)兩種雜合致病性變體[17]。本研究未發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因第1外顯子其他突變類型，且在啟動子區(qū)及第2～4外顯子未檢測到任何突變類型。提示在株洲地區(qū)新生兒UGT1A1基因中可能不存在G71R以外的其他突變類型，或者某些突變類型的等位基因頻率很低，需要增加樣本量深入研究。

UGT1A1基因多態(tài)性影響UGT酶活性，從而影響膽紅素代謝異常，而在實際臨床診療過程中RFV，積極尋找患兒病因時，常規(guī)行UGT1A1基因檢測不僅需花費貴，而且等待結(jié)果時間較長。國內(nèi)有研究者開發(fā)并驗證了一種易于使用的檢測方法，利用液相色譜和熒光檢測(LC-FD)來監(jiān)測UGT1A1酶活性[17]。本研究人群中G71R突變發(fā)生率較高，將來有望通過檢測UGT1A1酶活性為高膽紅素血癥的診治提供新思路新方法。

綜上所述，株洲地區(qū)新生兒高膽紅素血癥的病因以UGT1A1基因G71R突變、不明原因、溶血性疾病為主，高膽紅素血癥患兒UGT1A1基因突變以G71R突變?yōu)橹?，G71R突變是株洲地區(qū)新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的危險因素，當患兒出現(xiàn)重度高膽紅素血癥時需綜合考慮是否存在多種因素共同作用。該結(jié)論為本地區(qū)新生兒高膽紅素血癥提供了臨床診治思路，但本研究樣本量有限，還需擴大樣本量進一步探討新生兒高膽紅素血癥的病因機制。