長鏈非編碼RNA ZEB2-AS1在非小細胞肺癌中的表達及臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系

杜進臣 聶洪鑫 胡尕偉 張 斌 王占鵬 李慶新

肺癌是當(dāng)前世界范圍內(nèi)發(fā)生率最高的惡性腫瘤，且發(fā)生率與致死率仍在繼續(xù)上升[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的近80%。肺腺癌和肺鱗癌是NSCLC的兩種主要組織學(xué)類型，而肺腺癌已成為近年來最常見的NSCLC組織學(xué)類型[2]。盡管近年來臨床不斷探尋新的治療方法，但NSCLC患者的總生存率僅為15%左右[3]。因此，深入地了解NSCLC的潛在發(fā)病機制，尋找早期診斷及治療NSCLC靶標(biāo)基因來提高NSCLC患者的生存率已成為研究重點。長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding RNA，lncRNA)在轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后修飾等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，并參與細胞的增殖、凋亡和代謝等生理過程[4,5]。目前已在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)了異常的lncRNA表達，其在不同類型的癌癥中作為原癌基因或抑癌基因發(fā)揮調(diào)控作用[6]。鋅指E盒結(jié)合同源盒蛋白2-反義RNA 1(zinc-finger E-box binding homeobox 2-antisense RNA1，ZEB2-AS1)是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA。越來越多的研究表明,lncRNA ZEB2-AS1參與、促進多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程，包括胰腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌和肝細胞癌等[7～17]。而關(guān)于lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC中的表達研究少有報道。本研究通過觀察lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC患者中表達，并分析其表達與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，以期為NSCLC早期診斷及靶向治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.患者與組織樣本：選取2013年1月～2018年3月在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院普胸外科行外科手術(shù)治療的非小細胞肺癌患者129例，其中男性79例，女性50例，患者平均年齡為62.41±6.13歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有NSCLC患者術(shù)前均未接受新輔助化療/放療或免疫治療；②具有NSCLC手術(shù)指征，無手術(shù)相關(guān)禁忌證；③術(shù)后病理報告明確證實為NSCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷資料不完整；②合并其他惡性腫瘤；③生存時間<3個月；④心臟、腎臟等器官嚴重損傷者。收集所有患者的肺癌組織和癌旁正常組織，且皆為手術(shù)切除新鮮標(biāo)本，液氮快速冰凍后于-80℃低溫保存。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對惡性腫瘤的分類，由兩名病理學(xué)專業(yè)醫(yī)師對所有NSCLC患者的診斷和病理分期進行組織病理學(xué)證實。收集患者的臨床病理資料主要包括腫瘤分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期，以及患者一般資料包括年齡、性別、吸煙史等。NSCLC的臨床病理分期，參照美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer，AJCC)TNM 分期系統(tǒng)。隨訪數(shù)據(jù)使用醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)和電話采訪進行。本研究已通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批(倫理審批號：2021KYLL069)，所有患者均被告知并獲得書面同意。

2.方法：取-80℃保存標(biāo)本約50mg在勻漿機勻漿后，按照TRIzol試劑(購自美國Invitrogen公司)的說明書，從NSCLC組織及癌旁正常肺組織中提取總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自北京智杰方遠)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)法檢測lncRNA ZEB2-AS1相對表達量(PCR儀購自賽默飛世爾科技有限公司)。lncRNA ZEB2-AS1以GAPDH為內(nèi)參基因，引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成。采用2-ΔΔCT法計算NSCLC患者癌組織及其癌旁組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1相對表達量。lncRNA ZEB2-AS1上游引物: 5′-ATG AAGAAGCCGCGAAGTGT-3′，下游引物: 5′-CACACCCTAATACACATGCCCT-3′；GAPDH上游引物: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物: 5′-TCCACCCTGTTGCTGTA-3′。

3.隨訪：術(shù)后對所有NSCLC患者進行隨訪，末次隨訪時間為2020年5月1日，統(tǒng)計總生存時間，并繪制Kaplan-Meier生存曲線。

結(jié) 果

1.NSCLC組織及其癌旁組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1表達水平檢測結(jié)果：通過qRT-PCR檢測了129例NSCLC組織和癌旁肺組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1的表達水平(圖1)。NSCLC組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。NSCLC組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1表達的中位數(shù)為4.36，將129例NSCLC患者分為低表達組(<4.36，n=68)和高表達組(≥4.36，n=61)。

圖1 NSCLC組織和癌旁正常肺組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1的相對表達水平

2.根據(jù)lncRNA ZEB2-AS1表達水平的分組：分析NSCLC組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，lncRNA ZEB2-AS1表達水平與NSCLC患者腫瘤分化程度(χ2=9.157，P=0.004)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.372，P=0.003)和TNM分期(χ2=23.155，P<0.001)顯著相關(guān)，而與性別、年齡、吸煙史、T分期之間無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)，詳見表1。

表1 NSCLC患者lncRNA ZEB2-AS1的相對表達量與其臨床病理特征的關(guān)系

3.NSCLC組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1的表達水平與患者預(yù)后的關(guān)系：Kaplan-Meier生存分析數(shù)據(jù)顯示，lncRNA ZEB2-AS1高表達組的總生存率顯著低于低表達組(P=0.013，圖2)。多因素COX比例風(fēng)險模型分析均顯示，lncRNA ZEB2-AS1表達水平與NSCLC患者的總生存率獨立相關(guān)(HR=1.925，95% CI：1.472～10.663，P=0.036，表2)，表明lncRNA ZEB2-AS1高表達提示NSCLC患者臨床預(yù)后不佳。此外，多因素COX比例風(fēng)險模型顯示分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期也與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)(P<0.05)。

圖2 lncRNA ZEB2-AS1高表達組和低表達組Kaplan-Meier生存曲線lncRNA ZEB2-AS1高表達組的總生存期與lncRNA ZEB2-AS1低表達組比較，P=0.013

表2 NSCLC患者預(yù)后的COX單因素和多因素回歸分析

討 論

肺癌是目前世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因[18]。盡管近年來在NSCLC臨床診治方面已取得了卓越的研究成果，但NSCLC早期的臨床癥狀隱匿，缺乏高效的篩查手段，診療效果仍不能令人滿意。因此，如何早期診斷并預(yù)測預(yù)后對于NSCLC的臨床治療尤為重要。有研究者發(fā)現(xiàn)人體近98%的基因組都將被轉(zhuǎn)錄為lncRNA，而只有約2%的RNA被編碼為蛋白質(zhì)[19]。越來越多的研究證據(jù)表明，lncRNA在調(diào)控人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并在NSCLC在內(nèi)的不同腫瘤中充當(dāng)原癌基因或抑癌基因[20]。人體組織或血漿中l(wèi)ncRNA的表達水平可用于多種惡性癌癥的早期診斷和預(yù)后評估。因此，探尋更精準(zhǔn)的lncRNA，對某些惡性腫瘤的早期診斷與靶向治療具有重要的臨床價值。

lncRNA ZEB2-AS1是近年來被探尋的新型lncRNA，最早由Zhuang等[21]在膀胱癌的研究中鑒定發(fā)現(xiàn)的。Jiang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB2-AS1在結(jié)直腸癌組織和細胞中均呈高表達，促進結(jié)直腸癌細胞的增殖及遷移，其研究結(jié)果顯示lncRNA ZEB2-AS1可顯著抑制癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。該實驗還發(fā)現(xiàn)lncRNA ZEB2-AS1的表達與微小RNA-1025(microRNA-1025，miR-1205)的表達呈負相關(guān)，CRKL(CT10 oncogene homolog-like)可能是miR-1205的直接靶點，lncRNA ZEB2-AS1通過調(diào)節(jié)miR-1205/CRKL通路來促進結(jié)直腸癌細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[21]。

Xu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB2-AS1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，且lncRNA ZEB2-AS1高表達的患者預(yù)后較差，表明在胃癌細胞中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1高表達可促進癌細胞增殖與侵襲，并抑制癌細胞的凋亡[9]。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA ZEB2-AS1在膀胱癌組織和細胞中也呈高表達，與膀胱癌組織中微小RNA-27b(miR-27b)表達顯著負相關(guān)(r=0.1688，P<0.05)，lncRNA ZEB2-AS1可通過下調(diào)miR-27b表達進而促進膀胱癌細胞增殖。Lan等[15]通過實驗發(fā)現(xiàn)，與癌旁的正常組織比較，肝癌組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1的表達水平更高，而lncRNA ZEB2-AS1的表達還與原發(fā)腫瘤的大小、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。該實驗中Kaplan-Meier生存曲線顯示，與lncRNA ZEB2-AS1低表達水平的患者比較，lncRNA ZEB2-AS1高表達肝癌患者的總體生存率和無復(fù)發(fā)生存率較低。通過調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的標(biāo)志物表達水平，lncRNA ZEB2-AS1的下調(diào)可抑制肝惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，可考慮將lncRNA ZEB2-AS1作為肝癌患者早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

而關(guān)于lncRNA ZEB2-AS1在肺癌中的研究卻鮮有報道。Guo等[17]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB2-AS1在人肺癌組織中顯著上調(diào)，而lncRNA ZEB2-AS1能夠促進人肺癌細胞的增殖并抑制其凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素-6(interleukin 6, IL-6)在非小細胞肺癌中上調(diào)，并通過激活STAT1/ ZEB2-AS1通路促進了非小細胞肺癌的進展[23]。然而，少有研究探討lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC中的臨床意義和預(yù)后價值。本研究通過qRT-PCR檢測了129例非小細胞肺癌組織和匹配的癌旁肺組織中l(wèi)ncRNA ZEB2-AS1的表達水平。筆者發(fā)現(xiàn)與相匹配的癌旁肺組織比較，lncRNA ZEB2-AS1在NSCLC組織中的表達水平顯著升高，這表明lncRNA ZEB2-AS1可能調(diào)控了NSCLC的發(fā)生。筆者探討了lncRNA ZEB2-AS1表達與129例NSCLC患者的臨床病理特征之間相關(guān)性。本研究結(jié)果表明，lncRNA ZEB2-AS1表達水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析數(shù)據(jù)顯示，lncRNA ZEB2-AS1高表達組的總生存期明顯低于低表達組。單因素和多因素COX比例風(fēng)險模型分析均顯示lncRNA ZEB2-AS1的表達與NSCLC患者的整體生存獨立相關(guān)，這表明lncRNA ZEB2-AS1可能是NSCLC患者的整體生存的獨立預(yù)后因素，這與Xu等[24]的研究結(jié)果一致。

總之，筆者研究發(fā)現(xiàn)，ZEB2-AS1在NSCLC組織中表達水平較高，并且其高表達與NSCLC中的腫瘤進展和不良預(yù)后相關(guān)，ZEB2-AS1可能成為新的NSCLC患者預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物及潛在的治療靶點。