濕寒應(yīng)激對(duì)絕經(jīng)大鼠骨生物力學(xué)及尿骨代謝指標(biāo)的影響

古麗娜孜·肉孜 穆妮熱·排爾哈提 海力里·麥麥提 買買提明·努爾買買提 卡依沙爾 陳媛鑫 阿衣努爾·買提斯迪克

環(huán)境與飲食作為應(yīng)激對(duì)疾病的影響目前研究較多，但對(duì)人體骨骼的影響，國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道較少。有研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)50～59歲女性骨質(zhì)疏松癥的患病率約為20.38%，且呈南方高、北方低的分布趨勢(shì)，這可能與體重、日照、生活飲食習(xí)慣等有關(guān)[1]。有研究表明，應(yīng)激(尤其是慢性)及其相關(guān)的炎性過(guò)程，會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、骨骼肌減少癥、肥胖以及阻塞性睡眠呼吸暫停，現(xiàn)代人所食用的食物、生活方式的改變，會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激以及隨后的慢性炎性狀態(tài)[2]。可見(jiàn)，環(huán)境與飲食因素是骨質(zhì)疏松發(fā)生、發(fā)展的重要因素。而濕寒的環(huán)境與飲食應(yīng)激對(duì)骨質(zhì)疏松的影響還未見(jiàn)研究報(bào)道。骨質(zhì)疏松的發(fā)生與骨代謝過(guò)程中骨吸收和骨形成密切相關(guān)，這一過(guò)程中與骨代謝相關(guān)的生化指標(biāo)水平也發(fā)生明顯變化，本研究通過(guò)觀察濕寒環(huán)境+飲食應(yīng)激條件下絕經(jīng)后大鼠骨密度，骨生物力學(xué)及尿生化指標(biāo)尿鈣(calcium，Ca)、尿磷(phosphorus, P)、尿Ⅰ型膠原交聯(lián)N-末端肽(type Ⅰ collagen amino-terminal peptide，NTX)、尿Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(type Ⅰ collagen carboxy-terminal peptide，CTX)水平，初步探討濕寒環(huán)境飲食應(yīng)激對(duì)絕經(jīng)后大鼠骨密度、骨生物力學(xué)及尿生化指標(biāo)的影響。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:選用SPF級(jí) SD 雌性大鼠 48只(新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，倫理審核號(hào)：IACUC20190916-01，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(新)-2018-0002。

2.主要試劑及儀器：尿 Ca、尿P試劑盒由南京建成生物有限公司提供，尿NTX、CTX試劑盒由江萊生物有限公司提供。臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自北京醫(yī)用離心機(jī)廠(型號(hào)LD4-2)；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司(型號(hào)Multiskan go)； Micro-CT購(gòu)自德國(guó)布魯克公司(型號(hào)SkyScan 1176)。

3.模型建立及分組干預(yù)：OVX模型組和OVX+濕寒組大鼠用10%水合氯醛(0.1ml/100g)腹腔注射麻醉，以下腹部正中切口入腹，切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅切除少許卵巢周圍脂肪組織。正常對(duì)照組、假手術(shù)組、OVX模型組置于室溫環(huán)境予普通飼料喂養(yǎng)；OVX+濕寒組給予濕寒復(fù)合應(yīng)激飼養(yǎng)9周。

4.濕寒應(yīng)激源的制備：①濕寒環(huán)境：控制人工氣候室條件，模擬濕寒飼養(yǎng)環(huán)境，OVX+濕寒組大鼠除游泳外其余時(shí)間均在人工氣候室內(nèi)(設(shè)置溫度6±1℃；相對(duì)濕度85%～95%)；②冷水游泳(水溫6±1℃，1次/天，每次5min)；③濕寒屬性飼料：將大鼠普通飼料和濕寒屬性飼料按7∶3比例混合制備(其中普通飼料70%、芫荽籽15%、菠菜籽15%)，委托江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司(生產(chǎn)批號(hào)：20190819)加工。

5.骨度密(BMD) 檢測(cè)：分別于術(shù)后 7、9周用Micro-CT掃描測(cè)量大鼠左側(cè)脛骨，所得掃描數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件 Mimics10.01 進(jìn)行三維重建并計(jì)算，得出骨密度數(shù)據(jù)。

6.骨生物力學(xué)：三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn):設(shè)置兩端跨距為 20mm,運(yùn)行速度設(shè)置為 2mm/min，記錄載荷-撓度曲線。并計(jì)算各力學(xué)指標(biāo)，骨應(yīng)力、楊氏模量、最大載荷、最大載荷點(diǎn)斜率。壓縮實(shí)驗(yàn)：連接小型加力架和力傳感器及電腦,組成測(cè)量系統(tǒng)。測(cè)定最大載荷、最大載荷點(diǎn)位移及壓縮力深度。

7.尿生化指標(biāo)檢測(cè)：每組取 6 只大鼠，分別于第7、9周末將各組大鼠放置集液籠12h，收集尿液，離心后尿液于-80℃冰箱保存待測(cè)。尿 Ca用微板法，尿P用磷鉬酸法檢測(cè)，尿NTX、CTX用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)。

結(jié) 果

1.骨密度檢測(cè)比較:7周時(shí)，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，OVX+濕寒組骨密度顯著下降；與OVX模型組比較，OVX+濕寒組骨密度顯著下降；9周時(shí)，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，OVX模型組、OVX+濕寒組均明顯下降(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組骨密度比較

2.骨生物力學(xué)檢測(cè)比較：第7周時(shí)各組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 第7周三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)

第9周時(shí)，與假手術(shù)組比較，OVX模型組骨折應(yīng)力、楊氏模量降低，與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較，OVX+濕寒組骨折應(yīng)力、楊氏模量明顯降低(P<0.05)，詳見(jiàn)表2。

表2 第9周三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)

壓縮實(shí)驗(yàn)第7周，與正常對(duì)照組比較，假手術(shù)組、OVX模型組最大載荷均降低(P<0.05)；OVX+濕寒組最大載荷降低(P>0.05)，詳見(jiàn)表3。

表3 壓縮實(shí)驗(yàn)第7周

壓縮實(shí)驗(yàn)第9周，與正常對(duì)照組比較，假手術(shù)組、OVX模型組最大載荷降低(P<0.05)；OVX+濕寒組最大載荷降低(P>0.05)；與OVX模型組比較，OVX+濕寒組最大載荷升高(P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

表4 壓縮實(shí)驗(yàn)第9周

3.尿生化指標(biāo)比較:第7周尿生化指標(biāo)比較：與正常對(duì)照組及假手術(shù)組比較，OVX模型組、OVX+濕寒組尿鈣降低、尿磷升高(P<0.05)；尿NTX與CTX升高，(P>0.05)；與OVX模型組比較，OVX濕寒組尿鈣、尿磷(P)、尿NTX、尿CTX升高(P>0.05),詳見(jiàn)表5。

表5 第7周各組尿生化指標(biāo)比較

第9周各組尿生化指標(biāo)對(duì)比，與正常對(duì)照組、假手術(shù)組比較，OVX模型組尿鈣降低(P<0.05)；OVX+濕寒組尿鈣降低(P>0.05)； OVX模型組、OVX+濕寒組尿磷均升高(P<0.05)。

與正常對(duì)照組比較，OVX模型組尿NTX及CTX均升高(P<0.05)，OVX+濕寒組變化不明顯，詳見(jiàn)表6。

表6 第9周各組尿生化指標(biāo)比較

討 論

環(huán)境及飲食作為應(yīng)激源對(duì)很多疾病都有影響，例如，在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折可能與居住地密切相關(guān)[3]。還有研究發(fā)現(xiàn)冷環(huán)境與高脂飲食長(zhǎng)期并進(jìn)可誘發(fā)弱精子癥[4]。在本研究中，濕寒應(yīng)激是在中醫(yī)證候病因造模法基礎(chǔ)上運(yùn)用大鼠濕寒屬性飼料加濕寒的人工氣候室條件與冷水游泳長(zhǎng)期刺激制備的；掌握環(huán)境與飲食應(yīng)激對(duì)疾病的影響，可從整體觀理論入手，改變?nèi)藗兊纳铒嬍沉?xí)慣，做到早預(yù)防，早治療，提高人群整體防病意識(shí)。

比較各組骨密度發(fā)現(xiàn)，濕寒組骨密度降低出現(xiàn)于第7周，OVX模型組出現(xiàn)于第9周，提示濕寒環(huán)境飲食應(yīng)激可能使骨質(zhì)疏松病程前移，在骨生物力學(xué)的研究結(jié)果中，OVX模型組與OVX+濕寒組最大載荷均降低，而OVX+濕寒組有更低的骨折應(yīng)力及楊氏模量，在尿生化指標(biāo)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，OVX模型組與OVX+濕寒組在7周時(shí)就可以表現(xiàn)出鈣磷代謝的紊亂，而骨吸收指標(biāo)的升高OVX模型組出現(xiàn)在第9周，OVX+濕寒組在第7周就已出現(xiàn)。可見(jiàn)，濕寒環(huán)境和飲食應(yīng)激不僅在第7周就影響了骨密度，而且影響了骨折應(yīng)力及楊氏模量，這可能與濕寒應(yīng)激可較早影響骨代謝，引起骨吸收加強(qiáng)有關(guān)。

骨生物力學(xué)是利用生物力學(xué)的方法將機(jī)械力學(xué)原理應(yīng)用于骨科的一門學(xué)科[5]。當(dāng)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生時(shí), 骨皮質(zhì)、骨松質(zhì)和骨膠原蛋白均發(fā)生相應(yīng)的改變, 從而導(dǎo)致骨生物力學(xué)特性的變化[6]。本研究主要應(yīng)用了彎曲試驗(yàn)及壓縮實(shí)驗(yàn)。彎曲試驗(yàn)可測(cè)量長(zhǎng)骨的骨干骨密質(zhì)的力學(xué)特性[7]。楊氏模量又稱彈性模量，它反映材料的內(nèi)在抗彈性變[4]。壓縮試驗(yàn)用于松質(zhì)骨和椎骨的力學(xué)性能測(cè)試[8]。影響骨生物力學(xué)性能的主要原因是骨的微觀結(jié)構(gòu)及骨膠原蛋白等成分的變化[9]。Guler等[10]對(duì)大鼠的研究結(jié)果顯示,去卵巢組在彈性模量上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為骨生物力學(xué)在決定骨骼脆性上具有重要作用。在另一些實(shí)驗(yàn)中，Yu等[11]研究發(fā)現(xiàn),去卵巢組股骨頭的破壞荷載顯著低于假手術(shù)組。對(duì)去卵巢兔股骨的研究也表明,術(shù)后8周時(shí)去卵巢組彈性模量、極限應(yīng)力、破壞應(yīng)力較對(duì)照組明顯降低[12]。這與本研究結(jié)果較一致，在4個(gè)組的比較中，OVX+濕寒組骨折應(yīng)力及彈性模量最低，可見(jiàn)濕寒環(huán)境飲食不僅影響骨密度，還會(huì)影響骨骼的應(yīng)力及彈性，這可能意味著在濕寒環(huán)境生活的人群面臨著更大的骨折風(fēng)險(xiǎn)。

鈣磷是骨礦物質(zhì)的主要成分，血中鈣磷水平的穩(wěn)定對(duì)骨骼的健康至關(guān)重要。尿鈣水平可評(píng)估老年人群骨吸收狀態(tài)[13]。本研究中OVX+濕寒組尿鈣降低、尿磷升高，可見(jiàn)骨骼處于鈣磷代謝紊亂的高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。NTX是骨降解后尿中出現(xiàn)的穩(wěn)定最終產(chǎn)物，可特異性地反映骨的吸收情況, 其測(cè)定方法簡(jiǎn)單且不受飲食影響，臨床中多在尿液中檢測(cè)[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在絕經(jīng)過(guò)渡期高水平的尿NTX，可能預(yù)示著更早和更多的骨折概率[15]。CTX水平反映了破骨細(xì)胞的活性，尿CTX更能反映當(dāng)前骨代謝狀態(tài)[16]。本研究中,OVX+濕寒組在7周時(shí)尿NTX、CTX升高，OVX模型組9周時(shí)升高明顯。這與Shieh等[17]的研究結(jié)果一致，指出NTX、CTX是骨代謝的敏感指標(biāo)，與骨折有明顯相關(guān)性?？梢?jiàn)，濕寒環(huán)境是可以較早影響骨吸收的。

在另一些研究中也發(fā)現(xiàn)濕冷環(huán)境對(duì)骨密度的影響，根據(jù)在濕冷環(huán)境下工作生活1年的隊(duì)員反映，在越冬末期出現(xiàn)腰背部疼痛、四肢無(wú)力等骨質(zhì)疏松前期癥狀[18]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，腕關(guān)節(jié)脆性骨折的發(fā)生率也增加[19]。在另一些研究中也證實(shí)了冷刺激可能與骨質(zhì)疏松性高轉(zhuǎn)換狀態(tài)有關(guān)[20]。分析其原因可能與血管功能障礙、血液循環(huán)不良、復(fù)溫模式干擾、溫度調(diào)節(jié)損傷等有關(guān)[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，濕寒環(huán)境飲食應(yīng)激對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨密度有顯著影響，并影響了骨折應(yīng)力及彈性模量，存在較大的骨折風(fēng)險(xiǎn)，考慮可能與早期影響骨代謝水平有關(guān)。因此，對(duì)環(huán)境飲食的干預(yù)可以較早地預(yù)防骨質(zhì)疏松。