血管緊張素Ⅱ皮下埋泵建立ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈夾層模型

徐 程 劉小偉 方曉欣 余 雷 陳曉鋒

主動(dòng)脈夾層(aortic dissection,AD)是一種危及生命的主動(dòng)脈擴(kuò)張疾病，其發(fā)生率和病死率居高不下。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示我國(guó)AD患者中 70 歲以下人群占 93.5%，平均發(fā)病年齡為52歲[1]。該疾病進(jìn)展快，病情復(fù)雜，未經(jīng)治療的患者在出現(xiàn)癥狀后每小時(shí)的病死率可達(dá)1%～2%[2]。AD患者的常見(jiàn)病理變化包括血管彈性纖維的廣泛紊亂和破壞，外膜彈性纖維丟失，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜纖維增厚明顯[3]。然而，因其發(fā)病機(jī)制不明確，沒(méi)有有效的藥物治療，臨床上主要治療手段為手術(shù)和血管內(nèi)修復(fù)[4]。動(dòng)物模型是了解疾病發(fā)生、發(fā)展的重要方法，為了對(duì)主動(dòng)脈夾層發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，目前迫切需要一種穩(wěn)定可靠、可重復(fù)性的AD動(dòng)物模型。

血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)能夠通過(guò)激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system,RAS)，引起血管收縮，血壓上升，導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)，使內(nèi)皮變脆弱，進(jìn)而誘導(dǎo)血管病變的產(chǎn)生[5]。既往研究表明，給予老齡C57BL/6小鼠AngⅡ埋泵以2500ng/(kg·min)的輸入量能夠成功誘導(dǎo)主動(dòng)脈夾層的發(fā)生，但此方法主動(dòng)脈夾層發(fā)生率較低[6]。因此，本研究擬采用ApoE-/-小鼠在造成高脂血癥加重血管負(fù)擔(dān)的同時(shí)進(jìn)行高劑量AngⅡ[2500ng/(kg·min)]皮下灌注，從而模擬人體AD病理生理過(guò)程，同時(shí)觀察小鼠AD的發(fā)生率以及血管組織形態(tài)學(xué)改變，期望建立一種穩(wěn)定、高效的小鼠主動(dòng)脈夾層模型。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：30只25～28周齡雄性ApoE-/-小鼠，購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院[動(dòng)物合格證號(hào): SCXK(浙)2008-0033],飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物房?jī)?nèi)，飼養(yǎng)條件：SPF 級(jí)環(huán)境，室溫25±2℃，濕度55%±3%，光照和黑暗循環(huán)時(shí)間12h。

2.主要試劑與儀器:血管緊張素Ⅱ、蘇木素、伊紅購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，Alzet 緩釋泵(型號(hào)：Model 1007D)購(gòu)自美國(guó) DURECT 公司，氣體麻醉劑異氟脘購(gòu)自河北一品制藥股份有限公司，小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓儀(型號(hào)：BP-2010A)購(gòu)自中國(guó)軟隆生物技術(shù)有限公司，vevo2100超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Visualsonics公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)小鼠一般情況觀察：裝泵前每天觀察小鼠精神狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前稱(chēng)量小鼠體質(zhì)量并定量小鼠飲食飲水量；裝泵后每隔12h觀察1次小鼠精神狀態(tài)，查看是否死亡，若發(fā)現(xiàn)小鼠死亡，立即解剖明確死亡原因，記錄實(shí)驗(yàn)期間7天內(nèi)兩組小鼠飲食，飲水量及體質(zhì)量變化。(2)小鼠血壓的測(cè)量：使用小鼠無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)在裝泵7天后分別測(cè)量?jī)山M小鼠尾部血壓，測(cè)量項(xiàng)目包括收縮壓(arterial systolic blood pressure， SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)和心率(heart rate，HR)，從每只小鼠身上獲得至少3個(gè)測(cè)量值，取其平均值作為小鼠最終血壓。(3)分組及建模方法：將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，兩組各15只，實(shí)驗(yàn)組給予皮下埋藏裝填有AngⅡ的微量滲透式緩釋泵，以2500ng/(kg·min)的速度持續(xù)輸注；而對(duì)照組小鼠皮下埋藏填裝0.9%氯化鈉注射液的微量滲透式緩釋泵，滲透量為0.5μl/h，持續(xù)灌注7天。(4)超聲檢查：造模7天后分別對(duì)小鼠行超聲檢查，評(píng)估小鼠血管夾層形成情況及血流信號(hào)的檢測(cè)。使用美國(guó)Visualsonics公司小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，MS550S探頭(中心頻率40MHz)，焦距為6mm，固定聚焦深度為10mm，寬度為12.00mm。檢查前使用1.5%～2.0%的異氟脘氣體將小鼠麻醉，確定小鼠完全麻醉后使用脫毛膏褪去小鼠胸部至腹部的毛發(fā)，其后使用溫?zé)峒埥韺⒚撁蟮钠つw擦干。將小鼠仰臥位固定于檢查臺(tái)上，四肢固定，其后將超聲凝膠涂抹于小鼠胸部至腹部皮膚，開(kāi)始進(jìn)行超聲檢查。(5)標(biāo)本采集及病理檢查：在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)死亡小鼠，立即將小鼠解剖明確死亡原因。所有小鼠于7天后完成超聲檢查通過(guò)斷髓處死，在顯微鏡下取出主動(dòng)脈。將取出的動(dòng)脈血管組織用0.9%氯化鈉溶液沖洗并置于4%多聚甲醛溶液中浸泡24h，石蠟包埋，間斷均勻切片，切片厚度5μm，其后行HE染色及EVG染色，普通光學(xué)顯微鏡觀察動(dòng)脈血管組織形態(tài)學(xué)改變。

結(jié) 果

1.小鼠一般狀況：對(duì)照組小鼠一般狀況良好，實(shí)驗(yàn)組有2只小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡，埋泵7天后兩組小鼠的體重、進(jìn)食及飲水量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在埋泵7天后，實(shí)驗(yàn)組小鼠的收縮壓，舒張壓顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 兩組小鼠一般狀況比較

2.造模結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組小鼠分別于裝泵后的第1天和第3天各死亡1只，解剖死亡小鼠可觀察到小鼠腹主動(dòng)脈撕裂，腹腔大量積血，確定小鼠為早期微小動(dòng)脈瘤破裂出血導(dǎo)致的死亡；在AngⅡ輸注7天后行超聲檢查，除去死亡的兩只小鼠，結(jié)合超聲及血管組織形態(tài)學(xué)觀察(圖1)，最終確認(rèn)實(shí)驗(yàn)組造模成模率為62%(8/13)，而對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)死亡，且最終未出現(xiàn)主動(dòng)脈夾層，最終成模率為0(0/15)。

圖1 小鼠主動(dòng)脈夾層形成情況A.小鼠主動(dòng)脈夾層模型肉眼可見(jiàn)血管外膜擴(kuò)張，局灶性出血區(qū)域內(nèi)夾層動(dòng)脈瘤形成； B.正常小鼠腹主動(dòng)脈肉眼可見(jiàn)管壁結(jié)構(gòu)完整，管壁無(wú)增厚及假腔形成

3.超聲結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組中小鼠在超聲成像系統(tǒng)下可看到血管膨大，血管壁剝離假腔形成(圖2A)，符合主動(dòng)脈夾層超聲影像學(xué)表現(xiàn)；而對(duì)照組小鼠腹腹主動(dòng)脈血管血管壁光滑結(jié)構(gòu)完整(圖2B)。

圖2 小鼠腹主動(dòng)脈超聲圖片A.實(shí)驗(yàn)組小鼠可見(jiàn)血管膨大，血管壁剝離假腔形成(箭頭所示)；B.對(duì)照組小鼠腹部血管光滑，結(jié)構(gòu)完整

4.病理學(xué)檢查：小鼠主動(dòng)脈組織切片行HE染色及EVG染色，在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠血管內(nèi)膜撕裂，血管壁增厚，彈力纖維紊亂，血管外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，中膜與外膜間假腔大量血栓溢出，形成夾層；而對(duì)照組小鼠血管壁結(jié)構(gòu)完整，平滑肌細(xì)胞排列整齊，管壁無(wú)增厚及假腔形成(圖3、圖4)。

圖3 主動(dòng)脈切片(HE染色)A.正常完整的主動(dòng)脈壁;B、C.正常主動(dòng)脈壁血管平滑肌胞排列整齊;D.主動(dòng)脈假腔形成;E、F.血管壁增厚，血管外膜大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

圖4 主動(dòng)脈切片(EVG染色)A.正常完整的彈性纖維;B、C.彈性纖維整齊連續(xù);D.血管壁擴(kuò)張，彈性纖維紊亂;E、F.血管內(nèi)膜彈性纖維撕裂

討 論

AD是一種極其兇險(xiǎn)的血管擴(kuò)張型疾病，研究表明，遺傳因素、基因突變、高血壓、血脂水平、炎癥機(jī)制、AngⅡ等均參與主動(dòng)脈夾層的形成[5,7～10]。但因其具體發(fā)病機(jī)制未清，目前尚缺乏有效的藥物治療手段。因此為了能夠更好地了解主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制，建立一款合適、穩(wěn)定、能夠模仿人體發(fā)病過(guò)程的動(dòng)物模型必不可少。李明等[11]使用外科手術(shù)的方式成功建立犬主動(dòng)脈夾層模型，但此方法不能模擬人體自然發(fā)生主動(dòng)脈夾層的病理過(guò)程。有報(bào)道表明，β-氨基丙腈聯(lián)合AngⅡ腹腔注射能夠建立起成模率高的小鼠主動(dòng)脈夾層模型，但β-氨基丙腈的使用能夠顯著抑制小鼠的食欲并且導(dǎo)致其活動(dòng)量減少，因此該方法在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性[12～14]。

AngⅡ是一種有效的血管活性肽，可引起血管收縮，并可影響血壓，在動(dòng)物模型中血管緊張素Ⅱ輸注能夠?qū)е卵芟到y(tǒng)中基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加，進(jìn)而導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞凋亡[15]。載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)與高脂血癥、高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等密切相關(guān)，ApoE的缺乏能引起小鼠嚴(yán)重的高脂血癥[16,17]。腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)和AD均屬血管擴(kuò)張性疾病，以1000ng/(kg·min)的AngⅡ的輸注能夠誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠腹主動(dòng)脈瘤的形成已得到廣泛證實(shí)[18,19]。而在先前的研究中，Tieu等[6]以2500ng/(kg·min)的AngⅡ輸入量在7～12月齡的C57BL/6小鼠體內(nèi)可使35%的小鼠在6～10天內(nèi)使形成主動(dòng)脈夾層，整體成模率較低。因此，研究者嘗試在本主動(dòng)脈夾層模型的建立過(guò)程中，給予ApoE-/-小鼠在伴隨高脂血癥的基礎(chǔ)上予以AngⅡ2500ng/(kg·min)的輸入量，進(jìn)而升高血壓誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡，加重血管負(fù)擔(dān)，以期建立一種更高效成模率的主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型。

本研究結(jié)果顯示使用AngⅡ以2500ng/(kg·min)的輸注量通過(guò)皮下埋泵的方式能夠短期內(nèi)成功在ApoE-/-小鼠中構(gòu)建較C57BL/6小鼠以相同劑量AngⅡ輸注更高成模率的主動(dòng)脈夾層模型。使用本方法，實(shí)驗(yàn)組小鼠的血壓明顯高于對(duì)照組，較之外科手術(shù)方式本方法更加符合人體主動(dòng)脈夾層血壓升高，內(nèi)膜撕裂的病理生理過(guò)程，且結(jié)果表明AngⅡ的使用未影響小鼠的食欲及活動(dòng)量。另外本研究中筆者加入了小動(dòng)物超聲的診斷，增加了最終診斷的敏感度和特異性為建模后續(xù)實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性提供了保障。

綜上所述，利用此方法構(gòu)建主動(dòng)脈夾層的模型模仿了老年人高血脂基礎(chǔ)上出現(xiàn)腎素-血管緊張素系統(tǒng)激活后造成血壓升高，血管內(nèi)膜損傷，彈性纖維破壞等人體主動(dòng)脈夾層形成的病理生理過(guò)程，并且此方法成膜率較高，周期短，操作簡(jiǎn)便，為進(jìn)一步揭示主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制提供了可靠的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。