心臟死亡大鼠雙腎移植模型的建立

鄧妙文 金鐘大

目前治療終末期腎臟病的最佳方案是行腎移植手術(shù)，供腎的短缺是制約其發(fā)展的一個重要因素，而心臟死亡器官捐獻(xiàn)是擴(kuò)展供腎來源的重要途徑。為研究心臟死亡后移植腎的功能恢復(fù)情況，建立心臟死亡后腎移植動物模型具有現(xiàn)實(shí)意義。臨床腎移植左、右腎都可以作為供腎，筆者在前期研究基礎(chǔ)上采用內(nèi)撐法間斷吻合腎靜脈及用改進(jìn)的套袖法吻合腎動脈，現(xiàn)進(jìn)一步探索心臟死亡后大鼠雙側(cè)供腎移植方法。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物：供、受體大鼠均為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供的雄性近交系Wistar大鼠，體質(zhì)量約為200～250g，大鼠的飼養(yǎng)及腎移植手術(shù)均于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心進(jìn)行,動物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號：TCM1087512)。大鼠術(shù)前禁食8～10h，可自由飲水。

2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組：將120只雄性近交系Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組30只(供體10只，受體20只)，實(shí)驗(yàn)組分為0min組、20min組和40min組，分別于供鼠心跳停止后0、20和40min獲取其雙腎作為供腎，腎移植時(shí)用內(nèi)撐法間斷吻合腎靜脈，腎動脈的吻合采用改進(jìn)原位套袖吻合法，對照組為供鼠心跳停止后0min后取雙側(cè)供腎，采用傳統(tǒng)的端對端間斷縫合技術(shù)進(jìn)行吻合[1，2]。0min組的左側(cè)供腎為1組，右側(cè)供腎為2組。行左側(cè)原位腎移植完畢后，即刻切除受體右腎。觀察各組受體大鼠術(shù)后移植腎的功能恢復(fù)情況和生存率。

3.實(shí)驗(yàn)步驟：(1)供腎的切?。菏中g(shù)在10倍顯微鏡下進(jìn)行。供體大鼠腹腔麻醉固定，取腹部正中切口入腹腔并用拉鉤盡可能大的暴露視野，游離靠近腹主動脈和下腔靜脈的雙側(cè)腎動、靜脈，將左腎動、靜脈根部上下兩側(cè)的腹主動脈和下腔靜脈各分離10mm，以便從腹主動脈進(jìn)行穿刺灌洗。左右輸尿管中上段周圍的脂肪組織和結(jié)締組織進(jìn)行銳性分離，并于離腎門10mm平腎下極處剪斷雙側(cè)輸尿管。完全游離雙側(cè)腎動、靜脈及輸尿管后分離左右腎，并進(jìn)行肝素化。剪開膈肌，用血管鉗夾閉心臟基底部致心臟停止搏動，并阻斷胸主動脈，確定心臟停止搏動后按照各組熱缺血時(shí)間進(jìn)行計(jì)時(shí)。各組熱缺血時(shí)間達(dá)到后，分別用血管夾阻斷腎動、靜脈水平上、下的腹主動脈和下腔靜脈，剪斷靠近下腔靜脈處的左腎靜脈根部，在腹主動脈阻斷部分的遠(yuǎn)端用肝素生理鹽水對雙腎進(jìn)行低壓勻速灌洗直至雙腎變成黃白色。在雙腎周圍放置冰塊，在低溫下灌洗5min后，靠近腹主動脈處剪斷左右腎動脈根部，右腎靜脈上部的下腔靜脈結(jié)扎剪斷，其下部的下腔靜脈在長約2mm處剪斷以備與受體腎靜脈吻合。在4℃ 0.9%氯化鈉溶液中保存取出的雙側(cè)供腎。(2)受體腎移植：左側(cè)供腎與右側(cè)供腎的移植由雙人同時(shí)進(jìn)行。受鼠麻醉固定后打開腹腔，以上述方法分離受者的左腎動、靜脈，在靠近腹主動脈處阻斷腎動脈血流，為便于腎動、靜脈的吻合需保留較長的腎動、靜脈。適當(dāng)游離輸尿管周圍的組織后剪斷輸尿管，并在腎包膜下切除左腎。供腎用紗布包繞，將冰屑置于供腎周圍保持低溫。供體左腎行左側(cè)原位腎移植，右腎翻轉(zhuǎn)后移植到受體左側(cè)，實(shí)驗(yàn)組腎靜脈采用內(nèi)撐間斷吻合法，腎動脈的血管重建采用改進(jìn)原位套袖法，對照組用傳統(tǒng)的端對端間斷縫合法[1，2]。血管重建完畢后，去掉包繞著供腎的紗塊，在供腎腎門處阻斷血流。依次開放腎靜脈及腎動脈的血管夾，供腎血流開放后即見腎臟充血，移植腎顏色逐漸變?yōu)榫鶆蚍奂t色，腎靜脈充盈，腎動脈搏動明顯。從陰莖靜脈靜脈注射3ml 0.9%氯化鈉注射液，可見輸尿管口流出清亮尿液。輸尿管的吻合采用端端吻合法，用10.0縫線間斷縫合6針，并固定移植腎的上下極。切除受體右腎并關(guān)腹。在受者恢復(fù)清醒后放入籠內(nèi)正常飼養(yǎng)。

4.觀察指標(biāo)：術(shù)中記錄各組腎動、靜脈的吻合時(shí)間，記錄移植腎的冷缺血時(shí)間(從灌注到血流開放的時(shí)間)。觀察各組受鼠腎移植術(shù)后的飲食、活動及并發(fā)癥情況，并記錄死亡時(shí)間。術(shù)后第3、5和7天從尾靜脈采集血樣，評估血清肌酐水平和血尿素氮水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對所有動物實(shí)施頸椎脫臼安樂死。

結(jié) 果

實(shí)施移植手術(shù)120例(供體40只，受體80只)。術(shù)后各組大鼠手術(shù)時(shí)間及存活率如表1所示，0min組、20min組和40min組之間的腎動、靜脈吻合時(shí)間及冷缺血時(shí)間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對照組較0min組長。40min組的大鼠均于14天后死亡，其存活率與0min組及20min組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；0min組與對照組大鼠存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組手術(shù)時(shí)間、術(shù)后并發(fā)癥及存活率

各組術(shù)后肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)檢測結(jié)果如表2所示，所有組在腎移植后3、5和7天血肌酐和血尿素氮水平均升高，與0min組及20min組比較，40min組明顯升高。0min組與對照組的血肌酐和血尿素氮水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組血肌酐及血尿素氮的檢測結(jié)果

0min組中的左側(cè)供腎為1組，右側(cè)供腎為2組，雙側(cè)供腎為同時(shí)取腎，雙人同時(shí)進(jìn)行腎移植。1組和2組大鼠的存活率及腎移植術(shù)后的血肌酐、血尿素氮水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3、表4。

表3 1組與2組手術(shù)時(shí)間、術(shù)后并發(fā)癥及存活率

表4 1組與2組血肌酐及血尿素氮的檢測結(jié)果

討 論

目前治療終末期腎臟病的最佳方案是行腎移植手術(shù)，可有效提高患者的生活質(zhì)量，延長患者的生存時(shí)間。現(xiàn)在等待腎源的患者逐漸增多，為縮小腎移植目前供需關(guān)系之間的差距，逐漸開發(fā)利用許多邊緣供腎如心死亡或腦死亡的供腎。與活體或腦死亡供腎比較，移植腎無功能和移植腎功能延遲的情況因心死亡供腎遭受更嚴(yán)重的熱缺血損傷而更廣泛存在。心死亡所致的無氧葡萄糖代謝增加導(dǎo)致了乳酸形成，細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶的腔內(nèi)釋放顯著增加，這是術(shù)后移植腎無功能或延遲恢復(fù)腎功能的主要原因，這也恰恰縮短了移植腎的存活時(shí)間[3]。腎臟病理的改變也隨著缺血時(shí)間的增加而增加[4]，其中一個重要的病理改變與腎小管的損傷有關(guān)，熱缺血時(shí)間的長短與腎小管損傷的預(yù)后呈正相關(guān)[5]。熱缺血損傷的時(shí)間短，則腎小管呈現(xiàn)輕度水腫，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，存活的腎小管上皮細(xì)胞通過細(xì)胞周期可以恢復(fù)細(xì)胞功能；而當(dāng)熱缺血時(shí)間延長時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞的損傷、壞死超過了修復(fù)上限，則出現(xiàn)間質(zhì)纖維增生[6，7]。另一原因可能與腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡有關(guān), 腎小管上皮凋亡細(xì)胞的數(shù)量隨著缺血時(shí)間的延長而增加[8]。一般來講，當(dāng)供腎熱缺血時(shí)間超過40min時(shí)，受鼠的移植腎纖維化程度高，受鼠的存活率低[9]。本研究發(fā)現(xiàn)移植腎熱缺血時(shí)間為40min時(shí)受體大鼠均于14天內(nèi)死亡，40min組術(shù)后肌酐和尿素氮水平較0min組及20min組明顯升高，這表明供腎熱缺血時(shí)間大于40min的供腎不宜使用。

為研究心死亡供腎的安全熱缺血時(shí)限，建立穩(wěn)定的、成功率高的大鼠腎移植模型十分必要。既往有許多文獻(xiàn)運(yùn)用了不同的方法建立心臟死亡大鼠模型，如安樂死、用過量的異氟烷或者打開胸腔通過心臟外部壓迫(填塞)誘導(dǎo)心臟驟停等[10～12]。筆者團(tuán)隊(duì)游離左、右腎后，直接剪開膈肌打開胸腔，用血管鉗夾閉心臟基底部致使心臟停搏，此法方便快捷，且更容易控制熱缺血時(shí)間，保證雙側(cè)供腎同時(shí)缺血。

在以往的大鼠腎移植模型中用左側(cè)或右側(cè)單側(cè)供腎研究較多，近年來雙側(cè)供腎移植因節(jié)省供體而多采用。Yin等[13]采用雙腎供體，供體下腔靜脈和腹主動脈與受體下腔靜脈和腹主動脈分別行端側(cè)吻合。馮寧翰等[14]的供體腎動脈與受體腹主動脈行端側(cè)吻合，供體腎靜脈與受體腎靜脈行端端吻合，尿道重建采用膀胱補(bǔ)片法。然而以上技術(shù)均不同程度阻斷腹主動脈和下腔靜脈血流，受體缺血再灌注后血流動力學(xué)變化較大，易形成血栓。供體膀胱瓣與受體膀胱吻合，腹部切口較大，影響術(shù)后恢復(fù)。

本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠腎動脈的吻合采用筆者前期研究的改進(jìn)套袖法，將受者的腎動脈套入經(jīng)顯微鑷少許擴(kuò)張后的供腎動脈腔內(nèi)，用顯微鑷幫助第1針穿過外膜進(jìn)入動脈內(nèi)腔，然后從動脈末端取出針，較之更方便，易于操作[1]。雖然筆者的技術(shù)可能對供體動脈內(nèi)膜造成損傷，但受損內(nèi)膜與受體動脈的外膜接觸，對腎血流量影響不大。實(shí)驗(yàn)組腎靜脈采用以前使用的內(nèi)撐法間斷吻合，該方法具有兩端對合好，針距易于控制，吻合整齊、內(nèi)膜外翻，符合血流動力學(xué)的要求等優(yōu)點(diǎn)，血管吻合后不易發(fā)生血栓形成及漏血和狹窄[2]。對照組腎動脈、腎靜脈均采用傳統(tǒng)的端端吻合法，與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的腎動、靜脈吻合時(shí)間及冷缺血時(shí)間明顯縮短。且本研究取雙側(cè)供腎后雙人同時(shí)進(jìn)行腎移植，0min組中的左側(cè)供腎(1組)及右側(cè)供腎(2組)術(shù)后肌酐、尿素氮及存活率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明此種方法兩個移植腎術(shù)后腎功能無明顯區(qū)別，可節(jié)省供體。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于描述了一種心臟死亡后大鼠雙側(cè)供腎移植的模型，采用心臟死亡后的大鼠雙腎作為供腎，分別進(jìn)行左側(cè)原位腎移植，采用改進(jìn)的套袖法進(jìn)行腎動脈吻合，內(nèi)撐法間斷吻合腎靜脈, 手術(shù)時(shí)間短，可有效減少供腎的冷缺血時(shí)間，成功率高，無需其他特殊器械，且可以減少在建立心死亡大鼠腎移植模型中的供體消耗，有利于心臟死亡供體腎移植實(shí)驗(yàn)研究，為研究供腎熱缺血安全時(shí)限提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。