苦參堿抗骨肉瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

黃心誠(chéng)，阮思源，王玉琦，劉德森，辜劉偉，曹 洪

（十堰市人民醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，湖北十堰442000）

骨肉瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨源性惡性腫瘤之一，是一種由成骨間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，主要累及股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和肱骨近端干骺端區(qū)域等兒童和青少年骨骼生長(zhǎng)最快的結(jié)構(gòu)［1］。持續(xù)性局部疼痛和靜脈怒張是骨肉瘤的主要臨床表現(xiàn)，當(dāng)患者出現(xiàn)全身惡病質(zhì)時(shí)，會(huì)嚴(yán)重威脅其生命。研究表明，骨肉瘤的發(fā)病率為0.000 3%，占兒童腫瘤的3% ～5%，在成人惡性腫瘤中的占比低于1%［2］。目前其臨床治療以手術(shù)治療為主，化療為輔，即采用“化療-手術(shù)-化療”的綜合治療模式，但效果并不明顯。20 世紀(jì)70 年代，骨肉瘤患者10 年生存率從30%提高到50%左右，但是患者總體10 年生存率無(wú)顯著改善［3］。因此，尋求更加有效的治療方法，以提高患者的生存率，已成為科研和臨床工作的重點(diǎn)。

苦參堿是從傳統(tǒng)中藥苦參和豆科植物苦豆子的根部分離得到的一種喹諾烷類(lèi)生物堿，因?qū)Ω鞣N濕熱證、熱毒證、皮膚瘙癢等有一定治療效果而被廣泛應(yīng)用于臨床。雖然現(xiàn)代科學(xué)尚未完全闡明苦參堿及其衍生物的作用機(jī)制，但以往大量研究已經(jīng)證明苦參堿及其衍生物具有廣泛的生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗纖維化、抗菌等［4-5］。在抗腫瘤方面，苦參堿的主要作用機(jī)制是通過(guò)上調(diào)或下調(diào)腫瘤相關(guān)分子的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［6］。Jiang等［7］研究合成了5 種苦參堿衍生物，即YF3-3、YF3-5、YF3-7、YF3-9、RW-23，并對(duì)其抗腫瘤作用進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明，YF3-5的抗腫瘤作用最強(qiáng)，可誘導(dǎo)肺腺癌A549 細(xì)胞G1期細(xì)胞周期阻滯和活性氧生成，為預(yù)測(cè)苦參堿衍生物的結(jié)構(gòu)修飾以合成新的有效抗腫瘤藥物提供了參考。

1 苦參堿通過(guò)STAT3 通路增強(qiáng)阿霉素抗骨肉瘤細(xì)胞作用

生物醫(yī)學(xué)研究表明，在各種致癌因子的作用下，細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控會(huì)發(fā)生嚴(yán)重紊亂，導(dǎo)致腫瘤形成，而STAT3 是該過(guò)程的關(guān)鍵信號(hào)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，其能夠介導(dǎo)與多種病理生理過(guò)程（如細(xì)胞增殖、分化、凋亡及血管生成、炎癥、免疫反應(yīng)等）相關(guān)的基因表達(dá)。與正常骨或軟骨瘤組織相比，骨肉瘤組織中STAT3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高［8］。研究發(fā)現(xiàn)，靶向抑制STAT3 表達(dá)可延緩腫瘤進(jìn)展，提高抗腫瘤免疫應(yīng)答［9-10］。STAT3 也因此被認(rèn)為是極具潛力的癌癥治療新靶點(diǎn)之一［11］。阿霉素是一種用于抗有絲分裂化療的細(xì)胞毒性蒽環(huán)類(lèi)抗生素，是一線治療藥物，其機(jī)制是擾亂腫瘤細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能，可通過(guò)靜脈注入治療骨肉瘤等腫瘤，是公認(rèn)有效的抗腫瘤藥物［12-14］。有研究表明，阿霉素可顯著降低增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）蛋白的表達(dá)，而苦參堿可進(jìn)一步增強(qiáng)這一作用。磷酸化STAT3（p-STAT3）已被證實(shí)能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，阿霉素可顯著降低p-STAT3/T-STAT3的比值，而苦參堿的應(yīng)用可進(jìn)一步降低該比值。腫瘤侵襲指標(biāo)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）在阿霉素作用下明顯降低，苦參堿則增強(qiáng)了阿霉素的這一作用。此外，在凋亡抑制基因survivin的改變中也觀察到類(lèi)似的趨勢(shì)［15］。以上研究提示，苦參堿通過(guò)下調(diào)p-STAT3、PCNA、MMP-9 和survivin表達(dá)促進(jìn)阿霉素的抗骨肉瘤作用。

2 苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)ERK/NF-κB 通路發(fā)揮抗骨肉瘤作用

ERK屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族成員，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在所有MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，ERK 是最重要的信號(hào)級(jí)聯(lián)因子，可以將胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)靶點(diǎn)，是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和有絲分裂的核心信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用［16］。NF-κB 是一種受信號(hào)激活級(jí)聯(lián)控制的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)控與免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞黏附等相關(guān)的基因表達(dá)，從而促進(jìn)癌變和腫瘤進(jìn)展［17］，表現(xiàn)為抗腫瘤活性，在骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制中具有一定的生物學(xué)意義。研究表明，ERK 通路通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)參與骨肉瘤的侵襲過(guò)程；NF-κB 在調(diào)節(jié)蛋白酶的合成中也發(fā)揮重要作用，而苦參堿不僅可直接影響NF-κB轉(zhuǎn)錄因子并顯著降低其在細(xì)胞核中的表達(dá)，還可影響ERK通路，其機(jī)制是誘導(dǎo)ERK/NF-κB通路下調(diào)，抑制MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)，從而阻斷細(xì)胞遷移和侵襲途徑［18］。還有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苦參堿處理后，p-ERK的表達(dá)與時(shí)間依賴(lài)性呈正相關(guān)，表明苦參堿激活了MG-63 細(xì)胞中的ERK；與單獨(dú)用苦參堿處理的細(xì)胞相比，經(jīng)苦參堿聯(lián)合ERK信號(hào)通路抑制劑U0126處理的細(xì)胞中p-ERK 和抗凋亡蛋白B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的表達(dá)降低，Bcl-2 樣蛋白4（Bcl-2-like protein 4，Bax）的表達(dá)升高，表明苦參堿通過(guò)ERK通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并阻斷其凋亡［19］。

3 苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Fas/Fasl 和Bcl-2 誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡

Bcl-2 和Bax是Bcl-2 類(lèi)蛋白家族的典型成員，Bax和Bcl-2 分別是細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子和抑制因子。Bax和Bcl-2 及其比值是各種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物。Bax 可通過(guò)從線粒體釋放細(xì)胞色素c 來(lái)激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)，有助于caspases的連續(xù)激活，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而B(niǎo)cl-2可以阻止這一過(guò)程，從而抑制凋亡機(jī)制的下游激活，使細(xì)胞存活。高Bax和/或低Bcl-2 及高Bax/Bcl-2 比值可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［20］。Fas（CD95/APO-1）是腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNFR）超家族的膜受體。Fas受體FasL（CD95L）的配體屬于TNF超家族。Fas/FasL 系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生中具有重要作用，其主要的作用是促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡，因此針對(duì)Fas/FasL系統(tǒng)的有效治療方法可能在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用［21］。Liang等［22］研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿可誘導(dǎo)Bax 表達(dá)，抑制Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)Fas/FasL 的活化和caspase-3、caspase-8 和caspase-9 的裂解，從而誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡。

4 苦參堿通過(guò)誘導(dǎo)線粒體caspases 依賴(lài)性凋亡途徑抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)

caspases是進(jìn)化上保守的半胱氨酸蛋白酶家族，主要參與細(xì)胞死亡和炎癥［23］，caspases 信號(hào)通路因其在啟動(dòng)和執(zhí)行程序性細(xì)胞死亡或凋亡中的作用最早被發(fā)現(xiàn)。除了參與凋亡過(guò)程，caspases 還參與許多非凋亡過(guò)程，包括細(xì)胞周期進(jìn)展、蛋白穩(wěn)定和細(xì)胞重塑［24］。在抗腫瘤方面，許多癌癥的傳統(tǒng)治療通過(guò)間接結(jié)合這些caspases來(lái)去除腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)其凋亡［25］。有研究表明，一定濃度的苦參堿可以抑制UMR-108 細(xì)胞的生長(zhǎng)，并以濃度依賴(lài)的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制由PARP切割后的caspase-9 和caspase-3 介導(dǎo)；經(jīng)苦參堿處理后，骨肉瘤UMR-108 細(xì)胞的基質(zhì)金屬蛋白酶早期降低，其在細(xì)胞凋亡中的作用可能與線粒體控制細(xì)胞死亡的作用相似；不同濃度苦參堿處理后，Bcl-2 蛋白的丟失可促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，UMR-108細(xì)胞Bcl-2 表達(dá)降低，Bax 表達(dá)增加；Bax 表達(dá)的變化也可促進(jìn)轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放［26］。因此，苦參堿通過(guò)干擾線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔和激活caspases 誘導(dǎo)UMR-108 細(xì)胞凋亡。

5 苦參堿通過(guò)滅活A(yù)KT通路抑制骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)

AKT是一種致癌蛋白，也被稱(chēng)為PKB，是PI3K 的主要底物，在人類(lèi)癌癥中，PI3K/AKT通路常因上游成分的突變和/或過(guò)表達(dá)而被過(guò)度激活。已有研究證實(shí)，PI3K/AKT通路是人類(lèi)癌癥中最重要的致癌途徑之一［27-29］。AKT通路的激活突變和擴(kuò)增與許多癌癥的發(fā)病有關(guān)，且已經(jīng)被證實(shí)是一個(gè)有前景的治療靶點(diǎn)［30］。有研究表明，苦參堿對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制和促凋亡作用，其抗增殖活性可能主要依賴(lài)于下調(diào)AKT磷酸化水平；苦參堿通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)因子AKT、糖原合成激酶3-β（glycogen synthesis kinase 3-β，GSK3-β）、cyclin D1、p27Kip1 和

Bax的表達(dá)來(lái)抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但僅能增加Bax 的表達(dá)，抑制AKT的磷酸化［31］。因此，苦參堿是通過(guò)滅活A(yù)KT通路抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

6 總結(jié)

中藥在抗腫瘤方面的作用及機(jī)制已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，苦參堿作為一種極具潛力的抗骨肉瘤中藥提取物，具有多種藥理活性，具有較高的臨床研究?jī)r(jià)值?？鄥A能夠通過(guò)STAT3 通路增強(qiáng)阿霉素的作用，調(diào)節(jié)ERK/NF-κB通路中Bax、Fas/Fasl和Bcl-2的表達(dá)，并通過(guò)誘導(dǎo)線粒體caspases依賴(lài)性凋亡和滅活A(yù)KT通路發(fā)揮抗骨肉瘤的作用。盡管苦參堿有一定的毒副作用，但其在抗骨肉瘤方面仍具有很大的研究?jī)r(jià)值和廣闊的發(fā)展前景。目前，研究者對(duì)苦參堿的抗腫瘤活性進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究，取得了積極的成果，并在此基礎(chǔ)上，合成了多種苦參堿衍生物，將其對(duì)不同骨肉瘤細(xì)胞系的抑制作用和促凋亡作用進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)?？鄥A及其衍生物在臨床上具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，可作為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物。毋庸置疑，越來(lái)越多的苦參堿衍生物將被設(shè)計(jì)和合成用于抗腫瘤藥物的研發(fā)，在抗腫瘤方面極具發(fā)展前景。