1α，25-二羥基維生素D3通過TLR4信號通路抑制川崎病血清誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞炎癥因子表達(dá)*

周 忠， 田 正， 王 鋒， 李潔瀅， 胡 琳， 楊艷娟， 焦 蓉

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽 441000）

川崎?。↘awasaki disease，KD）又稱皮膚粘膜淋巴結(jié)綜合征，其主要臨床癥狀包括發(fā)熱、結(jié)膜充血、草莓舌、皮疹及淋巴結(jié)腫大等，最常見的并發(fā)癥是冠狀動脈病變（coronary artery lesion，CAL）［1］。丙種球蛋白聯(lián)合阿司匹林是KD 治療的經(jīng)典方案，早期干預(yù)使CAL 的發(fā)生率可降至3%～5%。但近年來不完全KD 病例數(shù)量呈上升趨勢，使得KD 診斷及治療更加困難［2-3］。目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確，有研究表明Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）途徑參與了KD的發(fā)病機(jī)制［4］。TLR4途徑是巨噬細(xì)胞抵御外界病原的重要通路，但過度活化的TLR4途徑是造成炎癥損傷的重要環(huán)節(jié)［5］。有關(guān)TLR4 途徑在KD 發(fā)病中發(fā)揮的作用尚無定論。

維生素D3是體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷代謝的重要類固醇激素。但很早以前人們便發(fā)現(xiàn)通過光照可改善結(jié)核患者的癥狀，隨著后來研究的深入人們逐漸認(rèn)識到維生素D3是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)劑。其可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等發(fā)揮抗炎的生物學(xué)效應(yīng)［6］。當(dāng)病原體入侵后，刺激巨噬細(xì)胞體內(nèi)的維生素D 在25-羥基維生素D3［25-hydroxyvita?min D3，25-（OH）D3］-1α-羥化酶（CYP27B1）的羥化作用產(chǎn)生1α，25- 二羥基維生素D3［1α，25-dihy?droxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3］，與核內(nèi)維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）結(jié)合，可導(dǎo)致TLR2 及TLR4 炎癥通路下調(diào)，白細(xì)胞介素12（interleukin-12，IL-12）產(chǎn)生減少，保護(hù)性炎癥因子IL-10 上調(diào)［6-8］。Stagi 等［9］發(fā)現(xiàn)，急性期KD 患兒體內(nèi)25-（OH）D3的水平顯著下降，推測維生素D3水平的降低與KD患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但目前相關(guān)研究報道較少。因此，本研究擬通過觀察1，25-（OH）2D3對TLR4 途徑的影響，探討維生素D3在KD 中發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制。

材料和方法

1 對象與材料

1.1 研究對象選取2019 年9 月～2021 年5 月本院住院治療KD 患兒73 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合日本KD 研究會的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡5 歲以下；（2）73 例患兒入院時均處于發(fā)病的10 d以內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院前3 月已使用丙種球蛋白、腎上腺皮質(zhì)激素及抗血小板等治療，近半年服用維生素D治療；（2）近1月內(nèi)有感染性疾病病史或合并其他免疫性疾??；（3）不同意、不配合研究者。另外選取我院兒保科正常體檢兒童及急性上呼吸道感染（acute upper respiratory tract infection，AURI）患兒各30 例作為正常組和感染組（受試對象近半年均未服用維生素D）。所有受試對象均處于丙種球蛋白治療前，采集靜脈血3 mL，并于當(dāng)天分離血清，凍存于?80 ℃冰箱。利用簡單隨機(jī)抽樣的方法從73 例KD 血清中隨機(jī)選取40 例，與30 例感染組及30 例正常體檢兒童血清比較，應(yīng)用25-（OH）D3試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）檢測各組25-（OH）D3水平。另外33 例KD 血清吸取相同體積后進(jìn)行混合，并在56 ℃水浴鍋加熱30 min后用于細(xì)胞實驗，保證實驗中血清的同質(zhì)化處理。所有受試對象家屬均知情同意，項目已通過醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗材料及主要試劑人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1（貨號CC-Y1519）購自EK-Bioscience；鼠抗人β-actin 抗體（Proteintech，66009-1-Ig）；兔抗人磷酸化NF-κB P65 抗體（Wanleibio，WL02169）；兔抗人TLR4 抗體（Absin，abs132000）；反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript RT Master Mix 和實時定量試劑SYBR Premix?ExTaqTM（TliRNaseH Plus）均購自TaKaRa；羊抗兔549 Ⅱ抗（貨號A23220）購于Abbkine。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)液（10% 胎牛血清、1% 青霉素/鏈霉素）中，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。傳代時控制細(xì)胞密度在（2～4）×108/L，并在細(xì)胞生長至（8～10）×108/L 時進(jìn)行傳代，約每3 d 傳代1 次。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

2.2 THP-1細(xì)胞的分組和處理將THP-1細(xì)胞分別以1×109/L 和5×108/L 的密度培養(yǎng)于6 孔板和24 孔板中，以100 nmol/L佛波酯（phorbol 12-myristate 13-ace?tate，PMA）誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞24 h，使其向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，證實誘導(dǎo)成功。利用15% 同質(zhì)化處理后的KD 血清刺激誘導(dǎo)后THP-1 細(xì)胞24 h 作為KD 固有免疫模型。用不同濃度1，25-（OH）2D3（1、10 和100 nmol/L）預(yù)保護(hù)48 h 后，應(yīng)用15% KD 血清刺激THP-1 細(xì)胞24 h 作為維生素D 干預(yù)組。實驗處理及實驗分組如下：15% 正常血清組、15% KD 血清組及15% KD 血清+1，25-（OH）2D3（1、10 和100 nmol/L）組。本研究中使用的1，25-（OH）2D3濃度（1、10 和100 nmol/L）與正常維生素D 劑量給藥后健康人群血漿中的濃度一致［10］。分別提取細(xì)胞中RNA、總蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用RT-qPCR 檢測TLR4 通路及相關(guān)炎癥因子mRNA 的表達(dá)；采用Western blot 檢測全細(xì)胞裂解物TLR4 和磷酸化NF-κB P65（p-P65）的蛋白水平；采用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中腫瘤壞死因子α（tumor ne?crosis factor-α，TNF-α）的水平；采用免疫熒光技術(shù)檢測細(xì)胞TLR4 蛋白表達(dá)水平。每項實驗至少進(jìn)行3次重復(fù)實驗。

2.3 RT-qPCR將密度為1×109/L 的THP-1 細(xì)胞接種于6 孔板中，取對數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，按照如上方式進(jìn)行PMA 誘導(dǎo)，以無血清不同濃度（1、10和100 nmol/L）的1，25-（OH）2D3進(jìn)行預(yù)保護(hù)20 h，最后按照上述分組加入正常血清及KD 血清刺激24 h。利用Trizol 試劑提取6 孔板中不同處理細(xì)胞中總RNA，取1 μg 總RNA 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取2 μL 為模板進(jìn)行PCR。總反應(yīng)體系為20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，58 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參照，用2?ΔΔCt法計算TLR4、IL-1β 和TNF-α mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

2.4 Western blot培養(yǎng)于6孔板的THP-1細(xì)胞處理方式同上，1，25-（OH）2D3預(yù)保護(hù)48 h 后，加用血清刺激24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 遍后，采用蛋白裂解液在冰上裂解細(xì)胞15 min，裂解后4 ℃、13 500×g離心15 min 得到蛋白上清液。利用BCA 蛋白濃度測定，測定蛋白濃度。蛋白變性后，每孔上樣量為30 μg，預(yù)先制備10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用聚偏二氟乙烯膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（250 mA，150 min）。在5% 脫脂牛奶封閉2 h 后，將膜與抗TLR4 和抗p-P65 Ⅰ抗（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。在TBST 洗滌后，用辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗孵育2 h。Western blot 條帶采用ChemiDocTMXRS+ 成像系統(tǒng)（Bio-Rad）成像，利用Image Lab 凝膠分析軟件分析，以目的蛋白與內(nèi)參照條帶累積吸光度之比作為蛋白水平的相對指標(biāo)。

2.5 免疫熒光染色為進(jìn)一步了解單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)情況，采用免疫熒光檢測TLR4的表達(dá)。將密度為5×108/L 的THP-1 細(xì)胞接種于多聚賴氨酸包被的載玻片上，實驗分組：15% 正常血清組、15%KD 血清組、15%KD 血清+100 nmol/L 1，25-（OH）2D3組和15% 正常血清+100 nmol/L 1，25-（OH）2D3組。1，25-（OH）2D3預(yù)保護(hù)48 h 后，加用血清刺激24 h。用PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛固定30 min，然后在室溫下用專用封閉液封閉和透膜，與抗TLR4 Ⅰ抗（1∶300）孵育過夜。PBS清洗細(xì)胞3次后，與DyLight 549標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，細(xì)胞核用Hoechst 33342 染色20 min。選擇合適的濾光片，在熒光顯微鏡下采集圖像。

2.6 ELISA 法將密度為5×108/L 的THP-1 細(xì)胞接種于12孔板中，1，25-（OH）2D3預(yù)保護(hù)48 h，收集血清刺激24 h后各組培養(yǎng)上清液測定其中炎癥因子的表達(dá)情況，人TNF- α ELISA 檢測試劑盒購自Multi?Sciences（貨號70-EK182HS），操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 26.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KD組與感染組人口學(xué)資料及實驗室檢查的比較

收集73 例KD 患兒及30 例AURI 患兒基本情況及實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。2 組年齡比較無統(tǒng)計學(xué)差異；與感染組相比，KD 組患兒白細(xì)胞數(shù)、中性粒細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶及C-反應(yīng)蛋白均顯著升高（P<0.01），而體內(nèi)白蛋白水平較感染組呈顯著下降（P<0.01）；2 組間血紅蛋白及血鈉水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表2 KD組和感染組臨床指標(biāo)的特點Table 2.Clinic indexes in Kawasaki disease（KD）group and acute upper respiratory tract infection（AURI）group（Mean±SD）

2 KD 組、感染組與正常組血清中25-（OH）D3水平的比較

應(yīng)用試劑盒檢測40 例KD 組、30 例感染組及30例正常組血清中25-（OH）D3水平，分別為（21.86±7.41）、（33.39±8.96）和（35.04±5.14）μg/L；KD 組25-（OH）D3水平較感染組顯著下降（P<0.01），與正常組比較也得到同樣的結(jié)果（P<0.01），感染組和正常組血清中25-（OH）D3水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

3 血清25-（OH）D3水平預(yù)測KD的ROC曲線

ROC 曲線顯示，血清25-（OH）D3水平預(yù)測KD 的曲線下面積為0.922（95% CI：0.864～0.980），與正常組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；將25-（OH）D3取截斷值為27.55 μg/L 時，預(yù)測KD 的靈敏度為93.3%，特異度為75.0%，見圖2。

4 應(yīng)用PMA誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞

應(yīng)用100 nmol/L PMA 對懸浮生長的人單核細(xì)胞誘導(dǎo)24 h，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。如圖3所示，分別在不同倍鏡下觀察THP-1 細(xì)胞形態(tài)，A～C 為PMA 誘導(dǎo)前細(xì)胞形態(tài)，D～F 為PMA 誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)。光學(xué)顯微鏡下可見單核細(xì)胞貼壁生長，由圓形變?yōu)闄E圓形、不規(guī)則形，伸出偽足，證實單核細(xì)胞已被成功誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。

Figure 1.Serum 25-（OH）D3 level in 40 patients with Kawasaki disease（KD），30 healthy controls，and 30 acute up?per respiratory tract infection （AURI） controls.Mean±SD.**P<0.01 vs healthy and AURI control groups.圖1 三組血清中25-（OH）D3水平

5 1，25-（OH）2D3顯著抑制血清誘導(dǎo)的THP-1 巨噬細(xì)胞促炎因子的表達(dá)

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與正常血清誘導(dǎo)組相比，KD 血清誘導(dǎo)組可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞IL-1β 和TNF-α的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P<0.05 或P<0.01）；以不同濃度的1，25-（OH）2D3預(yù)保護(hù)20 h后可顯著降低KD 血清誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞IL-1β 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)（P<0.05），見圖4B、C。ELISA 結(jié)果顯示，與正常血清組相比，KD 血清刺激巨噬細(xì)胞可使TNF-α 的分泌水平顯著升高（P<0.05）；而1，25-（OH）2D3預(yù)保護(hù)可顯著抑制TNF-α的分泌（P<0.05），見圖4D。

Figure 2.The ROC curve of serum 25-（OH）D3 level predicting Kawasaki disease（KD）.There were 40 patients with KD，and 30 healthy controls.圖2 血清25-（OH）D3水平預(yù)測川崎病的ROC曲線

6 1 ，25-（OH）2D3顯著抑制巨噬細(xì)胞TLR4和p-P65的活化

Western blot 結(jié)果顯示，與正常血清相比，KD 患兒血清可刺激巨噬細(xì)胞TLR4 和p-P65 蛋白表達(dá)（P<0.05）；1，25-（OH）2D3在濃度為100 nmol/L 時可顯著抑制KD 血清誘導(dǎo)的TLR4 和p-P65 蛋白表達(dá)（P<0.05），見圖5。此外，1，25-（OH）2D3可降低血清誘導(dǎo)的TLR4 mRNA 表達(dá)水平（P<0.01），見圖4A。同樣的，TLR4免疫熒光染色結(jié)果與Western blot得到相同的結(jié)論，如圖6 所示，與正常血清組相比，KD 血清誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)TLR4熒光強(qiáng)度更強(qiáng)（P<0.05）；應(yīng)用100 nmol/L 的1，25-（OH）2D3預(yù)保護(hù)48 h 后，TLR4 熒光強(qiáng)度顯著下降（P<0.05）。

Figure 3.Phorbol 12-myristate 13-acetate（PMA）induced the transformation of THP-1 cells into macrophages.Human THP-1 mono?cytes were induced by 100 nmol/L PMA for 24 h.A，B and C：morphological changes of THP-1 cells before PMA induc?tion；D，E and F：morphological changes of THP-1 cells after PMA induction.Scale bar=200 μm in A and D；scale bar=100 μm in B and E ；scale bar=20 μm in C and F.圖3 佛波酯誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞

Figure 4.Effect of 1，25-（OH）2D3 on serum-induced expression of pro-inflammatory factors in THP-1 cells.A，B and C：the mRNA expression levels of TLR4，IL-1β and TNF-α in KD serum-treated THP-1 cells after pretreatment with 1，25-（OH）2D3；D：the secretion of TNF-α in the cell culture supernatant detected by ELISA.Mean±SD. n=3.#P<0.05，##P<0.01 vs control（Con）group；*P<0.05，**P<0.01 vs KD group.圖4 1，25-（OH）2D3對血清誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞TLR4及促炎因子mRNA表達(dá)的影響

討 論

我們的研究觀察到維生素D3對KD 起著至關(guān)重要的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用是通過抑制巨噬細(xì)胞TLR4 信號通路激活來實現(xiàn)的，這一以前未引起我們重視的類固醇激素為KD 的診斷、評估和治療提供了新的線索。

自從1967 年川崎富作醫(yī)生報道了50 例KD 以來，50 多年過去了。目前其病因機(jī)制尚不清楚，感染、遺傳、免疫及環(huán)境因素均影響著疾病的發(fā)生和發(fā)展［11-12］。日本流行病學(xué)調(diào)查顯示KD 發(fā)病有明顯的季節(jié)性，主要好發(fā)于冬春季節(jié)［13］。而冬春季節(jié)的北半球平均日照時間縮短，皮膚接受紫外線照射時間也縮短。而在紫外線照射下體內(nèi)7-脫氫膽固醇才可最終轉(zhuǎn)化為維生素D3最終形式1，25-（OH）2D3，作為體內(nèi)的活性成分在多種生理過程中發(fā)揮作用［14］。Stagi等［9］的研究提出低水平的25-（OH）D3與KD冠脈并發(fā)癥的發(fā)生具有相關(guān)性。陳小紅等［15］的研究也證實25-（OH）D3與CAL 發(fā)生有關(guān)，但其無法區(qū)分KD 和健康兒童。而本研究結(jié)果表明KD 患兒體內(nèi)25-（OH）D3顯著低于普通上呼吸道感染及正常兒童。因此我們認(rèn)為KD 免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生可能與體內(nèi)保護(hù)性活性成分維生素D3水平下降有關(guān)。

目前盡管對于不完全KD 的診斷提出不少的預(yù)測評分系統(tǒng)，但不同國家間評分系統(tǒng)的可靠性有待考究。更加可靠的危險評分指標(biāo)的加入，可能增加評分的可靠性。關(guān)于25-（OH）D3水平作為KD 獨立的危險因素及預(yù)測指標(biāo)的研究較少。因此，我們進(jìn)一步評估了血清25-（OH）D3水平作為預(yù)測KD 指標(biāo)的可靠性，結(jié)果顯示ROC 曲線下面積為0.922，靈敏度為93.3%，特異度為75.0%，診斷的截斷點為27.55 μg/L，其作為KD 預(yù)測指標(biāo)有較好的靈敏度和特異度。

Figure 5.1，25-（OH）2D3 significantly inhibited the activation of TLR4 and NF-κB in macrophages.The protein levels of TLR4 and p-NF-κB P65 were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.#P<0.05 vs control（Con）group；*P<0.05 vs KD group.圖5 1，25-（OH）2D3對THP-1細(xì)胞TLR4和NF-κB活化的影響

巨噬細(xì)胞TLR4途徑在KD 的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)程中扮演著重要的作用?；趩渭?xì)胞測序的結(jié)果，KD 患兒較正常兒童體內(nèi)外周血單個核細(xì)胞中單核細(xì)胞占比顯著升高，關(guān)鍵炎癥因子IL-1β 和TNF-α 的差異也來自單核細(xì)胞［16］。正因如此我們選用單核巨噬細(xì)胞系作為干預(yù)對象，以期望從上游環(huán)節(jié)發(fā)現(xiàn)KD 的發(fā)病機(jī)理。G-菌產(chǎn)生的脂多糖（LPS）、G+菌產(chǎn)生的磷壁酸酯質(zhì)及內(nèi)源性配體等病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMP）通過與巨噬細(xì)胞Toll 樣受體結(jié)合，進(jìn)而通過NF-κB 活化，NF-κB 核轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與相應(yīng)啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)前炎癥因子及細(xì)胞表面共刺激分子轉(zhuǎn)錄［17］。王國兵等［4，18］對KD 患兒外周血巨噬細(xì)胞的研究顯示，急性期KD 患兒TLR4、MyD88 及MD-2 mRNA 顯著增高。此外，他們的研究表明急性期KD 存在TLR4-MyD88 非依賴性途徑異?；罨?。他們提出KD 體內(nèi)PAPMs 可能觸發(fā)巨噬細(xì)胞TLR4，但并未得到證實。但Rosenkranz等［19］在應(yīng)用干酪乳桿菌構(gòu)建KD 小鼠模型的研究中表明，KD 小鼠冠脈炎癥反應(yīng)的發(fā)生依賴于TLR2 信號通路而不是TLR4通路。目前關(guān)于TLR4途徑是否參與KD 炎癥反應(yīng)發(fā)生尚無定論，本研究中應(yīng)用KD患兒血清誘導(dǎo)人單核巨噬細(xì)胞，從基因和蛋白水平表明急性期KD 患兒血清中存在某種PAPM 激活巨噬細(xì)胞TLR4 炎癥信號通路，并活化NF-κB 途徑上調(diào)IL-1β 和TNF-α 的mRNA 表達(dá)，顯著提高了關(guān)鍵性炎癥因子TNF-α 的含量。進(jìn)一步證實巨噬細(xì)胞TLR4活化可能是KD免疫功能紊亂的始動因素之一。

Figure 6.1，25-（OH）2D3 significantly inhibited the activation of TLR4 in macrophages.The expression of TLR4 was detected by im?monofluorescence staining.Mean±SD. n=3.#P<0.05 vs control（Con）group；*P<0.05 vs KD group.圖6 1，25-（OH）2D3顯著抑制巨噬細(xì)胞TLR4的活化

我們觀察到KD 患兒體內(nèi)的25-（OH）D3水平呈顯著下降，同時基于維生素D 在免疫調(diào)節(jié)中的重要作用，我們提出額外提高維生素D 的水平是否能在KD 患兒體內(nèi)發(fā)揮保護(hù)作用。Suzuki 等［20］的研究顯示，1，25-（OH）2D3通過抑制NF-κB 途徑，從而減輕TNF-α 誘導(dǎo)人冠脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，提示維生素D 可在冠脈炎癥中發(fā)揮抗炎作用。而維生素D 是否能通過巨噬細(xì)胞來影響KD 炎癥反應(yīng)尚未見報道。我們的研究表明，1，25-（OH）2D3可顯著抑制KD 血清誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞TLR4 途徑的活化，進(jìn)而抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終抑制關(guān)鍵性炎性因子的產(chǎn)生和分泌。此外，有文獻(xiàn)報道1，25-（OH）2D3通過活化P53 通路并抑制ERK1/2 通路調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的增殖，抑制T 細(xì)胞在KD 患兒體內(nèi)過度增殖［21］。綜上所述，證明維生素D 不僅可能從上游免疫細(xì)胞環(huán)節(jié)抑制KD 炎癥風(fēng)暴的發(fā)生，還可抑制炎癥因子導(dǎo)致的冠脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷。基于糖皮質(zhì)激素及烏司他丁等在兒童應(yīng)用的副作用問題以及生物制劑（英夫利昔單抗、依那西普和阿那白滯素等）的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，維生素D 可能是一種更安全更經(jīng)濟(jì)的治療手段。但關(guān)于維生素D 是否能作為KD 輔助治療方案，尚缺乏多中心臨床研究確定其療效，值得進(jìn)一步研究。

基于上述結(jié)果，我們推測在環(huán)境因素的影響下，KD 易感兒童受到外界病原刺激，由于體內(nèi)維生素D產(chǎn)生不足，巨噬細(xì)胞TLR4 炎癥途徑過度活化，從而激活NF-κB 途徑啟動炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯。而補(bǔ)充維生素D 通過下調(diào)巨噬細(xì)胞TLR4 和NF-κB 信號通路，從而抑制KD 患兒炎癥級聯(lián)效應(yīng)。但目前有關(guān)維生素D 在KD 的發(fā)病機(jī)理中的作用上尚未完全闡明，補(bǔ)充維生素D 對KD 及冠脈損傷是否有預(yù)防及改善作用，仍有待進(jìn)一步探討。