借助自組裝多肽水凝膠構(gòu)建高活性復(fù)層結(jié)膜上皮細(xì)胞片*

王 華， 唐浚杰▲， 徐李玲， 陳芳圓， 王穎薇， 周 清△， 陳 劍△

（暨南大學(xué)1第一臨床醫(yī)學(xué)院，2生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510630）

眼表化學(xué)傷是一種常見(jiàn)的眼部急癥，可導(dǎo)致嚴(yán)重視力損害，占眼部急癥的0.1%～15%，估計(jì)發(fā)病率為每年每10 萬(wàn)人0.051～50 例［1］。眼表化學(xué)傷的治療主要是眼表重建，包括角膜、結(jié)膜、淚膜和眼瞼的重建。結(jié)膜上皮由層狀鱗狀上皮和分泌黏蛋白的杯狀細(xì)胞組成，可調(diào)節(jié)眼表微環(huán)境，維持淚膜穩(wěn)定，保持角膜表面光滑。因此，成功的結(jié)膜重建是恢復(fù)眼表結(jié)構(gòu)完整和功能穩(wěn)定的重要前提。然而，眼表化學(xué)傷患者通常缺乏足夠的健康結(jié)膜組織進(jìn)行結(jié)膜重建，而異種結(jié)膜組織又存在免疫排斥反應(yīng)［2］。

為了解決免疫排斥和移植材料短缺的問(wèn)題，為結(jié)膜重建提供理想的替代品，已有研究開(kāi)發(fā)了組織工程結(jié)膜細(xì)胞片。目前結(jié)膜細(xì)胞片的構(gòu)建主要是通過(guò)直接在支架表面種植細(xì)胞獲得結(jié)膜移植物［3］。直接種植存在以下缺點(diǎn)［4-5］：（1）上皮難以快速分層；（2）細(xì)胞容易從支架上脫落；（3）杯狀細(xì)胞分化差。直接種植只構(gòu)造了一個(gè)單層細(xì)胞面，雖然細(xì)胞可以逐步分化形成多層細(xì)胞面，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，底層細(xì)胞的逐漸出現(xiàn)衰老和凋亡，細(xì)胞和支架之間的黏附力也開(kāi)始降低。

RADA-16是一種廣泛應(yīng)用的自組裝納米多肽水凝膠，在生理?xiàng)l件下可以自組裝成孔隙尺寸為50～200 nm、含水量大于99% 的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［6］，可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，提供一個(gè)利于細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移［7］，已被成功應(yīng)用于軟骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等不同類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)［8-10］。該材料還用于組織工程，促進(jìn)骨組織和神經(jīng)組織的再生，顯示其具有支持細(xì)胞附著、增殖和分化的能力［11-12］。

基于此，我們?cè)O(shè)想將RAD16-I 與兔結(jié)膜上皮細(xì)胞（rabbit conjunctival epithelial cells，rCECs）混合后種于脫細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（decellularized extracellu?lar matrix，dcECM）上，希望其也能發(fā)揮相關(guān)的調(diào)控作用，進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞的增殖，從而快速形成復(fù)層細(xì)胞片。本研究以此為切入點(diǎn)，評(píng)價(jià)RAD16-I對(duì)結(jié)膜上皮細(xì)胞復(fù)層過(guò)程的影響，探討其作用機(jī)制及應(yīng)用潛能。

材料和方法

1 動(dòng)物

新西蘭大白兔，雌雄不限，2.5～3.0 kg，普通清潔級(jí)別，用于結(jié)膜上皮細(xì)胞及結(jié)膜組織取材，來(lái)源于暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房及廣州花都區(qū)花東信華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)［許可證號(hào)為SCXK（粵）2019-0023］。

2 主要試劑

高糖DMEM 培養(yǎng)液、PuraMatrix?（RAD16-I）及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自Corning；分散酶（dispase）Ⅱ、0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA、細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK）4、CK13、黏蛋白5AC（mu?cin 5AC，MUC5AC）、磷脂酶A2 及脫氧膽酸鈉購(gòu)自Sigma；pan-cadherin 抗體、laminin 抗體、Alexa Fluor 488 及Alexa Fluor 594 購(gòu)自Abcam；collagen I 和colla?gen IV 抗體購(gòu)自Affinity；核酸染料DAPI 購(gòu)自Invitro?gen；磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）及碳酸鹽緩沖液（carbonate-buffered saline，CBS）購(gòu)自Biosharp；阿爾辛藍(lán)（Alcian blue，AB）-過(guò)碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色試劑盒及Calcein-AM/PI 活/死細(xì)胞雙染試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；櫻花OCT包埋劑購(gòu)自上海鑫樂(lè)公司。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用酶消化法［13］，新西蘭大白兔耳緣靜脈注入空氣處死，立即取結(jié)膜組織，充分分離干凈多余的脂肪和肌肉組織。用含有1% 青霉素/鏈霉素 的PBS 沖 洗3 次，后 用2.0×103U/L disase Ⅱ在37 ℃、5% CO2中浸泡2 h；再用0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化5 min，加入完全培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞，以1×108/L 接種培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)增殖到80% 匯合時(shí)及時(shí)傳代。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化及其生長(zhǎng)增殖情況。

3.2 rCECs 的鑒定當(dāng)傳代細(xì)胞達(dá)到80% 匯合時(shí)，用75%乙醇固定，用AB-PAS染色試劑盒檢測(cè)結(jié)膜杯狀細(xì)胞。AB 染色20 min 后氧化劑氧化5 min，Schiff試劑染20 min，蘇木素染色1 min 后酸性分化液分化2 s，最后用Scott 藍(lán)化液返藍(lán)。細(xì)胞表型通過(guò)免疫熒光染色確定，用PBS 沖洗細(xì)胞數(shù)次，然后在室溫下用1% Triton X-100 孵化30 min，10% 山羊血清孵化1 h，然后用Ⅰ抗在4 ℃孵育過(guò)夜，對(duì)照組加PBS。隨后，室溫下Ⅱ抗避光孵育2 h。

3.3 dcECM 的制備新鮮兔結(jié)膜組織用CBS 浸泡12 h，然后放入含有2×106U/L磷脂酶A2和5 g/L脫氧膽酸鈉的CBS 中室溫下水浴震蕩6 h，CBS 洗滌3 次后放入含2×106U/L 磷脂酶A2 的CBS 中室溫下水浴震蕩12 h。最后將結(jié)膜組織用生理鹽水清洗50 h（每2 h更換一次生理鹽水）。所得樣品干燥至恒重，角膜環(huán)鉆裁剪成直徑12 mm 的圓形，鈷60（25 kGy）滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 dcECM 脫細(xì)胞效率檢測(cè)采用HE染色和免疫熒光染色觀察dcECM 脫細(xì)胞前后的變化。簡(jiǎn)而言之，dcECM 和天然結(jié)膜（natural conjunctiva，NC）的樣品被冷凍在OCT 化合物中，制備成5 μm 切片，行HE染色和collagen I免疫熒光染色以觀察異種細(xì)胞去除效果及天然細(xì)胞外基質(zhì)存留情況。DNA 提取試劑盒提取DNA 后使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提取DNA 樣品的濃度，根據(jù)溶液體積計(jì)算得到各樣品DNA含量，以評(píng)估脫細(xì)胞效率。

3.5 dcECM 的復(fù)水能力及體外降解能力為比較NC 和dcECM 的復(fù)水能力，將恒重干燥的NC 和dcECM（n=5）樣品的質(zhì)量記為m0。樣品在PBS 中浸泡24 h 后，再次稱(chēng)量質(zhì)量，記為m1。樣品的含水率（%）=（m1?m0）/m1×100%。

為比較NC和dcECM的降解能力，將恒重干燥的NC 和dcECM（n=3）切成1 cm×1 cm 的樣品，測(cè)量其確切質(zhì)量，記為m0，37 ℃下將其置于PBS 中，濃度為1.5 g/L。分別于第1、4、7、14、21、30、45、60 和90 天將樣品取出，用蒸餾水清洗后干燥，測(cè)量其質(zhì)量，記為m1。樣品的體外降解率（%）=（m0?m1）/m0×100%。

3.6 細(xì)胞片的構(gòu)建首先將滅菌后的dcECM 固定在環(huán)架上，室溫下用培養(yǎng)基復(fù)水30 min。隨后，酶消化法收集足量細(xì)胞（每個(gè)細(xì)胞片用5×105rCECs）用于組織工程結(jié)膜（tissue engineering conjunctiva，TEC）上皮細(xì)胞片的構(gòu)建。rCECs 經(jīng)10% 蔗糖溶液洗滌后離心，用80 μL 蔗糖溶液和20 μL RAD16-I 多肽水凝膠重懸，隨后，將細(xì)胞混懸液加入到復(fù)水后的dcECM表面。對(duì)照組不使用RAD16-I，即消化收集5×105rCECs，使用100 μL 完全培養(yǎng)液重懸后直接種植到復(fù)水后的dcECM 的表面。構(gòu)建完成后加入2 mL 培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。

3.7 細(xì)胞活/死染色檢測(cè)細(xì)胞活性每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。培養(yǎng)5 d后，從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出樣品進(jìn)行評(píng)估。用Calcein-AM/PI 活/死細(xì)胞染色試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞存活率。簡(jiǎn)而言之，在熒光顯微鏡下觀察（隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，20 倍放大）活細(xì)胞（綠染）和死細(xì)胞（紅染），使用ImageJ 軟件計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞比例用活細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算。

3.8 組織學(xué)及免疫熒光分析為比較細(xì)胞片的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞表型和基質(zhì)成分，將細(xì)胞片包埋于OCT后制成20 μm 切片。行HE 染色觀察組織結(jié)構(gòu)；ImageJ 軟件測(cè)量上皮層平均厚度；行CK4、CK13 及MUC5AC免疫熒光檢測(cè)觀察細(xì)胞表型及基質(zhì)成分；行collagen IV、pan-cadherin 及l(fā)aminin 免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞間及細(xì)胞與基質(zhì)間的連接情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有統(tǒng)計(jì)分析均使用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 rCECs的體外培養(yǎng)與鑒定

大多數(shù)rCECs 在接種24 h 內(nèi)貼壁生長(zhǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，rCECs 呈半透明圓形（圖1A）。ABPAS 染色顯示結(jié)膜上皮原代培養(yǎng)中存在杯狀細(xì)胞（圖1B）。免疫熒光染色顯示，培養(yǎng)細(xì)胞中結(jié)膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK4 和杯狀細(xì)胞特異性黏蛋白MUC5AC陽(yáng)性表達(dá)（圖1C、D），與結(jié)膜上皮細(xì)胞表型一致。

2 脫細(xì)胞基質(zhì)的外觀

NC 呈乳白色薄膜，脫細(xì)胞后，dcECM 呈半透明的白色薄膜，透明度較NC增加（圖2A）。

3 脫細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)構(gòu)

HE 和免疫熒光染色（圖2B、C）證實(shí)異種細(xì)胞成分基本完全去除，天然膠原纖維結(jié)構(gòu)得到完整保留。NC 的DNA 含量為（1 846.85±66.15）μg/g，脫細(xì)胞后DNA 含量顯著下降至（46.47±2.48）μg/g，表明細(xì)胞成分有效去除（圖2D）。

4 脫細(xì)胞基質(zhì)的性質(zhì)

dcECM 的水分含量與NC 相比無(wú)顯著差異（82.20%vs80.20%，P>0.05），見(jiàn)圖2E。兩者的體外降解率亦無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)圖2F。這些結(jié)果表明，磷脂酶A2 可以有效地去除異種抗原成分，同時(shí)完整保留天然細(xì)胞外基質(zhì)的膠原結(jié)構(gòu)，達(dá)到脫細(xì)胞的效果；此外，理化性質(zhì)并不會(huì)因脫細(xì)胞過(guò)程而改變。

5 RAD16-I構(gòu)建細(xì)胞片的流程及結(jié)果

rCECs 與RAD16-I 混合后種植在dcECM 表面構(gòu)建三維細(xì)胞片（圖3），不添加RAD16-I直接將細(xì)胞混懸液種植在支架上作為對(duì)照組。

6 RAD16-I對(duì)細(xì)胞活力的影響

2 種方式構(gòu)建的細(xì)胞片在培養(yǎng)第3 天均混合在一起，呈鵝卵石狀（圖4A）。細(xì)胞活/死染色（圖4B）顯示，和二維對(duì)照組相比，僅有散在死細(xì)胞（紅點(diǎn)）隱藏在三維細(xì)胞片內(nèi)，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示，三維細(xì)胞片活細(xì)胞比例（97.90%）與二維細(xì)胞片（89.31%）相比有顯著差異（P<0.01），見(jiàn)圖4D。

Figure 1. In vitro expansion of rabbit conjunctival epithelial cells.A：light microscopic images of rabbit conjunctival epithelial cells；B：Alcian blue-periodic acid-Schiff staining to identify goblet cells；C and D：immunofluorescence staining of cultured rab?bit conjunctival epithelial cells using antibodies against CK4 and MUC5AC.圖1 兔結(jié)膜上皮細(xì)胞的體外擴(kuò)增

7 RAD16-I對(duì)細(xì)胞復(fù)層能力的影響

HE 染色（圖4C）顯示，三維細(xì)胞片中的rCECs 與基質(zhì)緊密連接，形成4～5 層上皮，而對(duì)照組僅形成1～2層上皮。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，上皮平均厚度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（20.19±1.05）μmvs（6.12±0.45）μm，P<0.05］，見(jiàn)圖4E。

8 RAD16-I對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

CK4、CK13 和MUC5AC 免疫熒光染色鑒定細(xì)胞片的細(xì)胞表型。三維細(xì)胞片中檢測(cè)到結(jié)膜上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK4 和CK13 及杯狀細(xì)胞特異性黏蛋白MUC5AC，而對(duì)照組中未檢測(cè)到，見(jiàn)圖5。

9 RAD16-I對(duì)胞間連接能力的影響

免疫熒光染色檢測(cè)鑒定細(xì)胞片的細(xì)胞外成分及胞間連接，結(jié)果顯示，pan-cadherin、laminin 和colla?gen IV 在2 組均呈陽(yáng)性表達(dá)，但添加RAD16-I 的細(xì)胞片的胞間連接明顯強(qiáng)于對(duì)照組，見(jiàn)圖6。

討 論

在臨床上，自體結(jié)膜或結(jié)膜替代品常用于結(jié)膜重建。雖然自體結(jié)膜是結(jié)膜重建的最佳選擇，但它僅限于有足夠健康結(jié)膜組織的患者。羊膜（amotic membrane，AM）是一種常用的結(jié)膜移植替代品，可有效減少結(jié)膜表面炎癥，防止結(jié)膜瘢痕形成。然而，AM 在眼表重建方面仍具有一定的限制性。傳統(tǒng)的AM 移植治療存在疾病傳播和異源反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)，AM移植物在炎癥環(huán)境中可能快速降解，這極大地限制了其在嚴(yán)重炎癥環(huán)境中的應(yīng)用，如眼表化學(xué)燒傷［14-15］。在此基礎(chǔ)上，結(jié)膜細(xì)胞片因其低免疫原性和良好的生物相容性而發(fā)展成為理想的結(jié)膜替代品。

dcECM 是通過(guò)物理和化學(xué)過(guò)程來(lái)去除細(xì)胞結(jié)構(gòu)、核酸和抗原成分的［16］。dcECM 具有以下優(yōu)勢(shì)［17］：組織特異性的生物力學(xué)強(qiáng)度和生物相容性，能有效促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和分化；該材料來(lái)源廣泛，生物性能穩(wěn)定；制備方法簡(jiǎn)單易操作。結(jié)膜基質(zhì)主要由3種大分子蛋白組成：層粘連蛋白、糖蛋白和膠原蛋白［18］。我們用磷脂酶A2 對(duì)兔結(jié)膜進(jìn)行脫細(xì)胞處理，結(jié)果證實(shí)脫細(xì)胞處理后的結(jié)膜上皮層被完全去除，基質(zhì)中的膠原纖維結(jié)構(gòu)得到保留。雖然目前對(duì)脫細(xì)胞支架和種子細(xì)胞的研究有所改進(jìn)，但如何將這兩種重要元素結(jié)合起來(lái)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

RAD16-I 是由麻省理工學(xué)院的張曙光教授等人發(fā)現(xiàn)的一種知名的自組裝多肽水凝膠，它在水介質(zhì)中形成β-結(jié)構(gòu)并自組裝成納米纖維［19］。 由于RAD16-I 具有良好的生物相容性，可促進(jìn)細(xì)胞增殖和組織再生，因此其商業(yè)名稱(chēng)為PuraMatrix［20-21］。近年來(lái)，RAD16-I 越來(lái)越多地被用作組織再生的人工支架。有報(bào)道稱(chēng)，自組裝多肽水凝膠的濃度會(huì)影響細(xì)胞形狀，常用的濃度范圍為0.2%～0.5%［22］。在本研究中，我們將RAD16-I 的濃度稀釋至0.2%，因?yàn)閞CECs在該濃度下表現(xiàn)出更好的分層能力。

Figure 2.Preparation of decellularized conjunctiva.A：photographs of decellularized extracellular matrix（dcECM）and natural con?junctiva（NC）after dehydration；B：histological analysis of dcECM and NC；C：immunofluorescence staining of dcECM and NC using antibodies against collagen I（COLI）；D：DNA content of dcECM and NC；E：moisture content of dcECM and NC after rehydration；F：in vitro degradation capacity of dcECM and NC.Mean±SD. n=3.**P<0.01 vs NC group.圖2 脫細(xì)胞結(jié)膜的制備

Figure 3.Overall approach for the construction of multilayer cell sheet.圖3 構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞片的流程及結(jié)果

Figure 5.Cell phenotype in tissue engineering conjunctiva（TEC）.Immunofluorescence staining for CK13（A），CK4（B）and MUC5AC（C）expression in the cells on 3D TEC and control TEC.圖5 組織工程結(jié)膜細(xì)胞片的細(xì)胞表型

Figure 6.Extracellular components in tissue engineering con?junctiva （TEC）.Immunofluorescence staining for cadherin（A），laminin（B）and collagen IV（C）ex?pression in the extracellular matrix of 3D TEC and control TEC.圖6 組織工程結(jié)膜細(xì)胞片的細(xì)胞外成分

前期研究發(fā)現(xiàn)，氣/液界面培養(yǎng)提供了一個(gè)更接近體內(nèi)的培養(yǎng)環(huán)境，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及快速?gòu)?fù)層［23］。一些研究已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了在生物支架上的結(jié)膜上皮細(xì)胞復(fù)層。例如，Zorn-Kruppa 等［24］在氣/液界面下培養(yǎng)6 d 后實(shí)現(xiàn)了3 層以上的結(jié)膜上皮細(xì)胞復(fù)層；Gipson 等［25］將結(jié)膜上皮細(xì)胞在涂有I 型膠原的Tran?swell上培養(yǎng)后實(shí)現(xiàn)了2～3層的復(fù)層；Bosworth等［26］在dcECM-PCL靜電紡絲支架上實(shí)現(xiàn)了結(jié)膜上皮細(xì)胞的復(fù)層。在本研究中，我們通過(guò)RAD16-I 水凝膠將rCECs 和dcECM 有效結(jié)合，恢復(fù)結(jié)膜的固有結(jié)構(gòu)和功能。培養(yǎng)5 d后用HE染色直接觀察移植物的整體結(jié)構(gòu)。組織學(xué)分析表明，0.2% RAD16-I 構(gòu)建的細(xì)胞片形成了4～5層的細(xì)胞復(fù)層，而不含RAD16-I的細(xì)胞片僅形成1～2 層細(xì)胞復(fù)層。與通常需要7 d 以上形成復(fù)層的傳統(tǒng)方法相比，RAD16-I 具有快速形成復(fù)層的能力。

細(xì)胞分化與周?chē)h(huán)境［27］密切相關(guān)。與傳統(tǒng)高分子材料的微尺寸相比，RAD16-I 的納米尺寸更接近于細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞提供了一個(gè)真實(shí)的三維微環(huán)境［28］。結(jié)膜杯狀細(xì)胞主要負(fù)責(zé)分泌黏蛋白形成淚膜。黏液蛋白改變或杯狀細(xì)胞功能障礙可導(dǎo)致眼表微環(huán)境紊亂。因此，杯狀細(xì)胞的恢復(fù)是結(jié)膜重建中的一個(gè)重要問(wèn)題。本研究結(jié)果表明，對(duì)照組在體外培養(yǎng)5 d 后，CK4、CK13 和MUC5AC 均陰性表達(dá)，考慮可能是因?yàn)榻Y(jié)膜上皮細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中因缺乏足夠的營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生了衰老和變異，從而引起角蛋白發(fā)生變異，該現(xiàn)象此前亦有相關(guān)報(bào)道［29］。三維培養(yǎng)組結(jié)膜杯狀細(xì)胞在RAD16-I 所創(chuàng)造的微環(huán)境中成功分化生長(zhǎng)，并在細(xì)胞片中檢測(cè)到杯狀細(xì)胞特異性標(biāo)志物MUC5AC。在正常結(jié)膜上皮中，杯狀細(xì)胞通常聚集在一起，幾乎插入到整個(gè)層狀上皮中，與相鄰層狀上皮細(xì)胞形成緊密的連接。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)三維微環(huán)境和復(fù)層結(jié)膜上皮可能為杯狀細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支持。

細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用決定細(xì)胞片的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。種子細(xì)胞與支架之間缺乏足夠的生物力學(xué)特性，在移植過(guò)程中容易出現(xiàn)上皮層脫落，這將極大地影響細(xì)胞片的實(shí)際臨床應(yīng)用。層粘連蛋白和IV 型膠原是結(jié)膜基質(zhì)的主要成分，在增強(qiáng)細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用中起著重要作用［30］。IV型膠原的主要作用是在結(jié)膜基底膜中形成特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為上皮細(xì)胞的黏附提供支架，而層粘連蛋白是大分子糖蛋白，主要作用可促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的黏附，促進(jìn)細(xì)胞分裂、鋪展和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，提高細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力和趨化性，幫助細(xì)胞形成接觸和伸展［31］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白和IV 型膠原在RAD16-I 構(gòu)建的細(xì)胞片中均陽(yáng)性表達(dá)，且明顯強(qiáng)于對(duì)照組。結(jié)合cadherin 的陽(yáng)性表達(dá)，初步證實(shí)RAD16-I 自組裝多肽水凝膠可以促進(jìn)培養(yǎng)微環(huán)境中細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用。

我們的結(jié)果表明，RAD16-I 自組裝多肽水凝膠具有模擬細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的能力，促進(jìn)細(xì)胞的活力、增殖及胞間連接，從而可以有效地在dcECM表面快速形成復(fù)層上皮。盡管我們使用的材料均具有良好的生物相容性，但其安全性仍需進(jìn)一步深入系統(tǒng)地探討，同時(shí)RAD16-I 促進(jìn)結(jié)膜上皮細(xì)胞復(fù)層的具體分子機(jī)制也是我們下一階段的研究重點(diǎn)。