流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺上皮細(xì)胞損傷及外泌體miRNA差異表達(dá)譜研究*

馬心悅， 朱夢晨， 盧芳國， 陳雨露， 王 平， 趙 澄， 黃家望， 李 玲

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)1中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，2醫(yī)學(xué)院，3中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208）

流感病毒作為一種常見呼吸道病原體，常分為4型（甲型、乙型、丙型和丁型），其中甲型流感病毒（in?fluenza A virus，IAV）具有較高的致病性和變異性［1］，可引發(fā)嚴(yán)重呼吸道感染，并造成大范圍流行［2-3］，其傳播具有季節(jié)性、周期性及高度傳染性的特點(diǎn)［4-5］。該病毒主要感染上呼吸道和下呼吸道，其典型表現(xiàn)為肺上皮損傷，嚴(yán)重時可發(fā)展為肺衰竭，引起急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）［6］，嚴(yán)重影響人類的健康及公共衛(wèi)生安全。因此，通過探究流感病毒誘導(dǎo)肺損傷的發(fā)病機(jī)制對防治流感極為重要。

外泌體在體內(nèi)分布廣泛，屬于細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的小囊泡，參與多種細(xì)胞生物的生理組織調(diào)節(jié)，在致病性損傷及器官重塑等多個生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。外泌體可攜帶細(xì)胞產(chǎn)生的一些功能性物質(zhì)，進(jìn)入靶細(xì)胞發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)，如參與免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等［7］。此外，研究表明外泌體可以參與病毒感染的過程，可以攜帶病毒相關(guān)的物質(zhì)傳遞至相關(guān)靶細(xì)胞，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的傳播［8］，如促進(jìn)病毒復(fù)制、激活炎癥細(xì)胞因子、進(jìn)行性誘導(dǎo)肺部炎癥損傷的發(fā)生發(fā)展等［9］。然而，目前對流感病毒感染后宿主細(xì)胞分泌的外泌體的功能及其生物學(xué)特征研究較少。本研究擬通過構(gòu)建穩(wěn)定的IAV 誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞損傷模型，并提取外泌體進(jìn)行高通量測序，篩選IAV 刺激后肺上皮細(xì)胞源性外泌體微小RNA（microRNA，miRNA）差異表達(dá)譜，為后續(xù)探索miRNA 在流感病毒感染小鼠肺上皮細(xì)胞中的作用及其調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞和病毒株小鼠肺上皮細(xì)胞MLE-12 為本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。IAV 小鼠肺適應(yīng)株（A/PR/8/34）為湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈，儲存在?80 ℃冰柜中備用。經(jīng)10 日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價1∶640 以上者供實(shí)驗(yàn)用。將病毒尿囊液以滅菌生理鹽水稀釋成每0.1 mL 50 LD50［即感染復(fù)數(shù)（multi?plicity of infection，MOI）=0.2］置于冰袋中備用。

1.2 主要試劑RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液、無外泌體培養(yǎng)液、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液和雙抗（Biological Industries）；病毒稀釋液含RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液、1 mol/L HEPES、1 g/L TPCK-Try、NaHCO3和雙抗；病毒維持液為含0.2% 胎牛血清的病毒稀釋液；CCK-8 細(xì)胞毒性檢測試劑盒（Biosharp，BS350A）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄引物、CD63抗體（ab134045）、CD81抗體（ab79559）和TSG101抗體（ab125011）均購自Abcam。

1.3 儀器CytExpert 流式細(xì)胞儀、Optima MAX-XP臺式超速離心機(jī)和濃縮管（Beckman Coulter）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和臺式高速冷凍離心機(jī)（Thermo）；CFX96 Touch 熒光定量PCR 儀和Western blot 工作系統(tǒng)（Bio-Rad）；ELx800 酶標(biāo)儀（BioTek）；Amicon Ultra-15，Ul?tracel-30K 超濾管（Merck Millipore）；透射電子顯微鏡；NS300 納米顆粒跟蹤分析（nanoparticle tracking analysis，NTA）儀（NanoSight）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)MLE-12 細(xì)胞用內(nèi)含10% 胎牛血清、1% 雙抗（青霉素和鏈霉素）、90% RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至鋪滿皿底90% 時，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。

2.2 造模濃度的選擇及分組病毒性肺泡上皮損傷模型的建立，根據(jù)不同濃度病毒在倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的變化和CCK-8 檢測結(jié)果，以及查閱文獻(xiàn)［10-11］，選取MOI=0.2。

實(shí)驗(yàn)分組：空白對照（control，CON）組和病毒干預(yù)組（IAV 組）。細(xì)胞按預(yù)設(shè)組鋪板孵育細(xì)胞長至皿底90%，棄去原來培養(yǎng)液，更換成稀釋液，IAV 組內(nèi)加入IAV 干預(yù)2 h 后，更換成維持液。通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，確定干預(yù)時間，從而進(jìn)行以下各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

2.3 CCK-8 法檢測細(xì)胞活力將對數(shù)生長期的MLE-12 細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種到96 孔板，細(xì)胞數(shù)量在每孔4×103個左右。待貼壁后，IAV 組用病毒稀釋液（MOI=0.2）干預(yù)，同步設(shè)CON 組，每組設(shè)5 個復(fù)孔。干預(yù)2 h后棄去上清，更換維持液繼續(xù)培養(yǎng)4、6、8、10 和12 h 后，根據(jù)CCK-8 試劑盒操作說明書進(jìn)行細(xì)胞活力檢測，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm 測量吸光度（A），并計算細(xì)胞活力抑制率（%）=（ACON組?AIAV組）/（ACON組?A空白）×100%，以及IC50。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡將對數(shù)期生長的MLE-12 細(xì)胞懸液接種到6 孔板，待細(xì)胞長至鋪滿皿底90%。設(shè)IAV 組和CON 組，分別用病毒稀釋液和稀釋液干預(yù)2 h，每組3個復(fù)孔，更換為維持液繼續(xù)培養(yǎng)8 h 后收集各組細(xì)胞，離心后棄上清，加預(yù)冷PBS清洗2 次，細(xì)胞重懸，制備細(xì)胞密度為5×109L?1的懸液。按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書，使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。

2.5 RT-qPCR 檢測分組和干預(yù)方式同前。采用Trizol法提取兩組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR 檢測。反應(yīng)體系：模板cDNA 取1 μL，上下游引物各取1 μL，qPCR SuperMix Plus 取10 μL，RNase Free Water 取7 μL，配至20 μL 總體積。反應(yīng)條件：95 ℃4 min 預(yù)變性；95 ℃變性30 秒，60 ℃退火30 秒，72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參照，按照2?ΔΔCt計算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Primer sequence for RT-qPCR

2.6 Western blot 檢測分組和干預(yù)方式同前。采用常規(guī)RIPA 裂解液裂解后用BCA 蛋白測定試劑盒檢測總蛋白濃度。變性蛋白樣品經(jīng)8%～10% SDSPAGE 分離后轉(zhuǎn)PVDF 膜。用1× TBST 洗滌后，5%BSA 室溫封閉1 h。用1× TBST 洗滌后，加入Ⅰ抗［甲型流感病毒核蛋白（nucleoprotein，NP）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）抗體］孵育4 ℃過夜，用1×TBST洗滌3 次后，HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1h。ECL 顯影曝光后化學(xué)發(fā)光儀檢測并分析。

2.7 外泌體的提取與鑒定

2.7.1 外泌體的提取將對數(shù)生長期的MLE-12 細(xì)胞接種在75 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，待細(xì)胞長至鋪滿皿底90%。分組和干預(yù)方式同前。收集2 組細(xì)胞的上清液，300×g離心10 min，去除上清液中的細(xì)胞；用冷PBS重懸，2 000×g離心10 min，去除上清液中的死細(xì)胞；10 000×g離心30 min，去除上清液中的細(xì)胞碎片。將處理好的上清液移入超濾過濾器內(nèi)，3 000×g離心15 min，棄離心管內(nèi)液體，收集過濾管內(nèi)濃縮后的上清液，并將液體移至超速離心管內(nèi)。按照超速離心機(jī)使用說明書，120 000×g離心90 min，提取外泌體樣本。

2.7.2 外泌體的電鏡檢測將收集的外泌體進(jìn)行常規(guī)固定。在室溫下孵育10 min 后，在銅網(wǎng)上取20 μL 外泌體懸液，用無菌蒸餾水沖洗，然后從濾紙吸收多余液體，然后滴3% 磷鎢酸溶液30 μL 室溫負(fù)染5 min，用濾紙吸干負(fù)染液，晾干。在透射電鏡下觀察銅網(wǎng)并拍攝照片。

2.7.3 NTA 檢測外泌體含量和粒徑分布將離心后的外泌體沉淀加入PBS 稀釋混勻，取1 mL 外泌體懸液加入比色皿中，使用NTA儀進(jìn)行檢測，并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.7.4 Western blot 檢測外泌體膜標(biāo)志蛋白將收集的外泌體常規(guī)RIPA 裂解液裂解后用BCA 蛋白測定試劑盒檢測總蛋白濃度。變性蛋白樣品經(jīng)8%～10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)PVDF膜。用1× TBST洗滌后，5% BSA 室溫封閉1 h。用1× TBST 洗滌后，加入Ⅰ抗（CD63、CD81 和TSG101 抗體）孵育4 ℃過夜，用1× TBST 洗滌3 次后，HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h。ECL顯影曝光后化學(xué)發(fā)光儀檢測并分析。

2.8 高通量單細(xì)胞測序分組、干預(yù)方式及提取外泌體方法同前。將收集的外泌體樣本交由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司進(jìn)行miRNA 文庫構(gòu)建及高通量測序，檢測2 組外泌體的miRNA 的表達(dá)差異譜。再通過RT-qPCR 驗(yàn)證高通量單細(xì)胞測序結(jié)果，引物序列見表2。

表2 miRNA引物序列Table 2.The primer sequences of miRNAs for RT-qPCR

3 統(tǒng)計學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布且具有方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間均數(shù)比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置相差顯微鏡觀測細(xì)胞形態(tài)

如圖1 所示，為確定流感病毒刺激細(xì)胞的最佳時間，對肺上皮細(xì)胞進(jìn)行時效實(shí)驗(yàn)檢測，在倒置相差顯微鏡觀察MLE-12細(xì)胞形態(tài)：空白對照組細(xì)胞呈梭形，貼壁生成，細(xì)胞形態(tài)完整，生長狀態(tài)良好；而加入病毒刺激后，在2 h 細(xì)胞狀態(tài)尚好，4 h 后細(xì)胞數(shù)量減少，形狀變圓，而病毒刺激8 h后，視野內(nèi)出現(xiàn)較多的細(xì)胞碎片，細(xì)胞損傷嚴(yán)重。

2 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2 所示，流感病毒刺激細(xì)胞后，在前8 h 內(nèi)，細(xì)胞活力抑制率隨著時間而升高，在8 h 達(dá)到最高［（22.00±0.02）%］。因此，以8 h 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡

如圖3 所示，基于細(xì)胞形態(tài)和CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取病毒抑制率最佳的時點(diǎn)8 h 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。與空白對照組（凋亡率為6.84±1.0%）相比，病毒干預(yù)組（凋亡率為24.11±0.17%）凋亡細(xì)胞顯著增多（P<0.01）。

4 RT-qPCR 檢測NP、TNF-α 和IL-6 mRNA 表達(dá)水平

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，病毒干預(yù)組NP、TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），見圖4。

5 Western blot 檢測NP、IL-6 和TNF-α 蛋白表達(dá)水平

Figure 1.Morphological observation of MLE-12 cells infected by influenza A virus（IAV）.Scale bar=200 μm.圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

Figure 2.The viability of MLE-12 cells after influenza A virus infection detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=4.圖2 流感病毒干預(yù)MLE-12細(xì)胞的時效實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，病毒干預(yù)組NP、IL-6 和TNF-α 蛋白表達(dá)顯著增加（P<0.01），病毒干預(yù)組NP 蛋白表達(dá)差異最為顯著，見圖5。

Figure 3.Apoptosis of MLE-12 cells detected by flow cytometry.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（CON）group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測MLE-12細(xì)胞凋亡

Figure 4.The relative mRNA expression levels of NP（A），IL-6（B）and TNF-α（C）detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（CON）group.圖4 RT-qPCR檢測NP、IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平

Figure 5.The relative protein expression levels of NP，IL-6 and TNF-α detected by Western blot test.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（CON）group.圖5 Western blot檢測NP、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)水平

6 外泌體的提取與鑒定

如圖6 所示，流感病毒誘導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞上清液來源的外泌體為圓形或橢圓形的囊泡結(jié)構(gòu)，大小均勻完整，與空白對照組細(xì)胞上清液來源的外泌體比較，形態(tài)上無明顯差異。

NTA 檢測結(jié)果顯示，提取的外泌體直徑在30～200 nm 之間，符合外泌體形態(tài)判斷標(biāo)準(zhǔn)；檢測結(jié)果同時提示，2 組外泌體的粒徑大小無顯著差異，但組間濃度有顯著差異，見圖7。

Western blot 對外泌體標(biāo)志物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在2 組細(xì)胞上清液提取的外泌體中均能檢測到外泌體膜性標(biāo)志蛋白CD63、CD81 和TSG101 的表達(dá)呈陽性，且病毒干預(yù)組CD63 和TSG101 表達(dá)水平高于空白對照組（P<0.01），而CD81表達(dá)水平無顯著差異，見圖8。

7 高通量單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)分析

Figure 6.Observation of exosomes by transmission electron microscopy（red arrows；scale bar=200 nm）.The exosome showed circu?lar vesicles between 30 to 200 nm in diameter and uniformly complete in size.圖6 透射電鏡觀察外泌體

Figure 7.Size and concentration of exosomes by NTA.A：control（CON）group，particle size of（80.40±27.25）nm，concentration of（4.41±0.71）×1011/L；B：IAV group，particle size of（86.75±40.65）nm，concentration of（3.57±0.83）×1011/L.圖7 Nanosight檢測外泌體的大小-濃度分布

Figure 8.Western blot detection of exosome membrane marker proteins.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（CON）group.圖8 Western blot檢測外泌體膜性標(biāo)志蛋白

7.1 miRNA 差異表達(dá)和聚類分析如圖9 所示，對病毒干預(yù)組與空白對照組的肺上皮細(xì)胞外泌體差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行分析，以顯著性P值（Pvalue）和差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）作為差異表達(dá)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)的miRNA：（1）當(dāng)P≤0.05，且FC≥2［log2（FC）≥1］，則判斷為上調(diào)；（2）當(dāng)P≤0.05，且FC≤0.5［log2（FC）≤?1］，則判斷為下調(diào)。

根據(jù)2 組樣品的miRNA 表達(dá)譜的相近程度，對miRNA 進(jìn)行聚類分析，能夠直觀地展示miRNA 在組間的不同表達(dá)情況，見圖10。

Figure 9.Volcanic distribution of significantly differentially expressed miRNAs.A total of 154 differently expressed miRNAs were de?tected by sequencing，120 of which were known miRNAs，and 34 were newly discovered miRNAs.There were 69 up-regu?lated miRNAs in the known miRNAs，while 51 were down-regulated.Among the newly discovered miRNAs，13 were upregulated，while 21 were down-regulated.A：the volcanic distribution of known differentially expressed miRNAs；B：the volcanic distribution of newly differentially expressed miRNAs.Each point in the figure represents an miRNAs，the abscis?sa is the fold change（FC）value，and the ordinate is the P value.Red point represents up-regulated miRNAs，while green point represents down-regulated ones.圖9 顯著差異表達(dá)miRNA的火山分布圖

Figure 10.Heat map of differentially expressed miRNAs.圖10 差異表達(dá)miRNA的熱圖

7.2 篩選差異表達(dá)顯著的miRNA根據(jù)測序結(jié)果中的miRNA 差異表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選出5 個病毒干預(yù)組高于空白對照組的miRNA，分別為mmu-miR-150-5p、mmu-miR-93-5p、mmu-miR-106a-5p、mmu-miR-363-3p_R-1 和mmu-miR-3470b-p3_1ss15GA，F(xiàn)C≥2 且P≤0.05；篩選出5 個病毒干預(yù)組低于空白對照組的miRNA，分別是mmu-miR-30b-5p、mmu-miR-1249-5p、mmu-miR-16-1-3p、mmu-miR-103-3p 和mmu-miR-340-5p，F(xiàn)C≤?1且P≤0.05，見表3。

表3 篩選出的差異表達(dá)的miRNATable 3.The screened differentially-expressed miRNAs

7.3 RT-qPCR 驗(yàn)證差異表達(dá)明顯的miRNA對根據(jù)測序結(jié)果篩選出來的10 個差異表達(dá)miRNA 進(jìn)行RT-qPCR 驗(yàn)證，如圖11 所示，有6 個與測序結(jié)果一致，其中2個為上調(diào)趨勢，4個為下調(diào)趨勢。

Figure 11.Validation results of the known differentially expressed miRNAs.A to J：the expression of miR-16-1-3p，miR-1249-5p，miR-106-5p，miR-150-5p，miR-30b-5p，miR-103-3p，miR-340-5p，miR-363-3p_R-1，miR-3470b-p3_1ss15GA and miR-93-5p，respectively.Mean±SD. n=4.**P<0.01 vs control（CON）group.圖11 已知差異表達(dá)miRNA的驗(yàn)證結(jié)果

討 論

IAV 每年都會引發(fā)人類呼吸道疾病，對社會經(jīng)濟(jì)和人類健康造成了巨大的負(fù)擔(dān)［12］，且流感病毒傳播速度快及病毒易于變異，使我們對流感病毒的預(yù)防和控制越來越困難［13］。有研究表明［14］，IAV 可通過病毒復(fù)制或過度炎癥免疫反應(yīng)，對宿主機(jī)體造成直接或間接的傷害，同時，過度炎癥反應(yīng)可引起肺組織損傷，導(dǎo)致高死亡率。IAV 毒感染人體后，介導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子，可誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），造成靶器官廣泛的病理損傷，出現(xiàn)ARDS、休克及多臟器功能衰竭［17］，其中IL-6 和TNF-α 作為主要的炎癥因子，能夠直接參與到機(jī)體的炎癥反應(yīng)，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用［18］。作為一種RNA 病毒，IAV的RNA 基因組中第5 節(jié)段編碼其核衣殼蛋白（NP），參與了病毒復(fù)制周期的多個階段，是病毒基因轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制過程中是必不可少的成分［15-16］。本研究證實(shí)，IL-6和TNF-α等炎癥因子在IAV誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，其機(jī)制可能是增加流感病毒NP 的表達(dá)，促進(jìn)病毒基因轉(zhuǎn)錄和基因組復(fù)制，從而抑制細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，激活I(lǐng)L-6 和TNF-α 等促炎因子介導(dǎo)的機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)，引起一系列炎癥反應(yīng)，這也提示，若能在早期進(jìn)行藥物干預(yù)，可有效的阻止IAV 誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降、細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，從而避免或減輕肺泡上皮細(xì)胞損傷。

外泌體是由細(xì)胞分泌的介導(dǎo)細(xì)胞間交流的圓形納米囊泡，在IAV 誘導(dǎo)的病毒性肺損傷的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［19-20］。外泌體可以通過攜帶病毒或宿主蛋白組分、核酸組分包括miRNA 等調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制，傳遞細(xì)胞間信號，激活和調(diào)節(jié)抗病毒反應(yīng)，參與肺部炎癥性疾?。?1-22］。此外，外泌體所攜帶miRNA 可以通過向受體細(xì)胞傳遞遺傳信息的方式，在腫瘤、肺系感染性疾病和神經(jīng)變性疾病等諸多疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［23-25］。有研究表明，miR-1249 在IAV 感染過程中能夠抑制堿性聚合酶2 的功能，從而影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［26-27］。miR-30b 和miR-103 在與炎癥相關(guān)的疾病中發(fā)揮抑制疾病進(jìn)展的作用［28-30］，調(diào)控多種蛋白以及信號通路減少氧化應(yīng)激損傷、促進(jìn)細(xì)胞生長、抑制細(xì)胞凋亡和細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)［31］。本實(shí)驗(yàn)表明，IAV 能引起肺泡上皮細(xì)胞釋放的外泌體的粒徑大小和濃度分布發(fā)生變化，改變外泌體所攜帶的miR-1249、miR-30b等miRNA特異性表達(dá)。

綜上所述，本研究在成功構(gòu)建A 型流感病毒感染誘導(dǎo)的病毒性肺損傷的模型的基礎(chǔ)上，分別提取病毒干預(yù)組和空白對照組分泌的外泌體，通過高通量單細(xì)胞測序技術(shù)檢測miRNA 的差異表達(dá)譜，為進(jìn)一步研究外泌體在IAV 誘導(dǎo)的流感病毒性肺損傷的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在未來的研究中，我們將針對miR-1249、miR-30b 等miRNA 在流感病毒誘導(dǎo)的病毒性肺損傷過程中的功能及作用機(jī)制開展深入研究。