基于Akt/ mTOR 信號通路探討藥熨療法對神經(jīng)根型頸椎病大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及自噬因子表達(dá)的影響

趙玉玲 黃 沂 周艷瓊 蔣菲菲 陳海燕

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院護(hù)理部，廣西南寧 530023

神經(jīng)根型頸椎?。╟ervical spondylotic radiculopathy，CSR）是臨床上最常見的頸椎病，神經(jīng)病理性疼痛系其主要癥狀。神經(jīng)根受壓導(dǎo)致的神經(jīng)根損傷是CSR患者疼痛的主要原因[1]，神經(jīng)根損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多。如何降低細(xì)胞凋亡，修復(fù)神經(jīng)根損傷是治療CSR 關(guān)鍵。細(xì)胞自噬與神經(jīng)病理性疼痛顯著相關(guān)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬可改善疼痛[2]。PI3K/Akt/mTOR 通路在細(xì)胞增殖與凋亡中起關(guān)鍵作用，是經(jīng)典的抗凋亡通路，Akt/mTOR 通路是細(xì)胞自噬重要的負(fù)性調(diào)控路徑[3]，激活該通路能減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)受損神經(jīng)恢復(fù)，發(fā)揮對細(xì)胞的保護(hù)作用。前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)藥熨療法可降低CSR 大鼠自發(fā)性疼痛評分，提高機(jī)械痛閾值[4]，本研究基于Akt/mTOR 通路探討藥熨療法調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬、減少細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為藥熨療法的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取體重150～200 g 的4 周齡SPF 級SD 大鼠18 只（斯貝福生物技術(shù)有限公司），許可證號：SCXK（京）2019-0010，予溫度（23±2）℃、濕度60%、12 h 循環(huán)燈光、標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水，飼養(yǎng)7 d 適應(yīng)環(huán)境，穩(wěn)定機(jī)能。隨機(jī)選取其中6 只作為空白組，其余建立CSR 模型。造模成功后，將其按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、藥熨組，每組各6 只。對大鼠處置遵從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 RIPA 裂解液（北京索來寶公司，貨號：R0020）；ECL 發(fā)光試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：sc-2048）；PVDF 膜（Millipore 公司，貨號：IPVH00010）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZB2301、ZB2305）；p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3A/B 抗體、β-actin（Affinity公司，貨號：AF0016、AF3308、AF5128、AF5402、AF7018）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 公司，centrifuge5417R）；核酸蛋白定量儀DS-11（美國丹諾爾Denovix 超微量紫外可見分光光度計(jì)）；半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（ATTO 公司，WSE-4040、AE6675L）；透射電子顯微鏡（HITACHI公司，HT7700）；成像系統(tǒng)（日本OLYMPUS 公司，UC90）。

1.3 造模方法

手術(shù)造模，造模大鼠禁食禁水12 h。采用10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）麻醉后手術(shù)，將無毒、性質(zhì)穩(wěn)定的0.5 mm 直徑尼龍魚線插入SD 大鼠C6-T1 位置，建立CSR 模型，術(shù)后取頸部患處神經(jīng)根節(jié)進(jìn)行HE染色，根據(jù)組織神經(jīng)元細(xì)胞核、胞質(zhì)及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)判斷是否造模成功[5]。

1.4 干預(yù)方法

造模7 d 后，藥熨組開始藥熨治療，連續(xù)藥熨7 d后處死。藥熨包制備：乳香、沒藥、紅花、桂枝、千年健、雞血藤、牛大力、飛龍掌血各30 g，打碎置于瓦罐，50 度米酒浸泡，泡制6 個(gè)月后取出濾過，濾過后的藥渣密封在陶罐。藥熨包加熱：藥渣裝入純棉藥熨包，將藥熨包置入玻璃器皿，淋米酒，藥熨包濕透但無液體滴出為宜，然后置于微波爐中火加熱5～6 min，擠出多余藥液，干燥棉紗布包裹。藥熨操作：刮除大鼠局部毛發(fā)，取膀胱經(jīng)、督脈、膽經(jīng)[6]，止血鉗持藥熨包以適當(dāng)力度沿大鼠背部督脈風(fēng)府穴自上而下燙至身柱穴，然后藥熨督脈兩側(cè)膀胱經(jīng)（天柱穴至膈俞穴），最后沿膽經(jīng)風(fēng)池穴經(jīng)過肩井穴藥熨到肩端，每條經(jīng)脈藥熨20 次，連續(xù)藥熨7 d，動(dòng)作輕柔連貫，以大鼠皮膚出現(xiàn)潮紅為宜。每次藥熨結(jié)束，喂大鼠適量溫水。空白組、模型組不予任何處理，正常飼養(yǎng)，與藥熨組同時(shí)處死。

1.5 評價(jià)指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 石蠟切片HE 染色實(shí)驗(yàn) 將三組固定的神經(jīng)組織樣本流水沖洗，依次梯度酒精脫水后包埋成蠟塊。切片、烤片后用蘇木精染液、伊紅染液染色，后依次在無水乙醇、二甲苯中脫色透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、分析。

1.5.2 透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞溶酶體、自噬小體及超微結(jié)構(gòu)改變 神經(jīng)組織樣本取材投入透射電子顯微鏡固定液固定2～4 h，神經(jīng)組織采用磷酸鹽緩沖液漂洗3 次去上清，1%鋨酸固定后再次磷酸鹽緩沖液漂洗。系列梯度酒精、丙酮脫水后滲透，加入包埋劑包埋固化后超薄切片，鈾鉛雙染色后于透射電子顯微鏡下觀察。

1.5.3 Western blot 檢測蛋白p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)量 取樣品，加入300 μl 的RIPA 裂解液，充分混勻，4℃冰箱裂解2 h。4℃，12 000 r/min 離心10 min（離心半徑5 cm），取上清，檢測蛋白濃度。制備SDS-PAGE 凝膠，樣品變性電泳，將分離的蛋白條帶用半干轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)膜方式轉(zhuǎn)印至PVDF 膜后對其孵育、檢測。用磷酸鹽緩沖液稀釋一抗；將封閉后的膜直接放入一抗工作液，4℃反應(yīng)過夜。根據(jù)最后的條帶亮度再次確定一抗的稀釋比例（Beclin-1、LC3A/B、p-Akt、p-mTOR 均為1∶1000），洗膜后，將二抗稀釋3000 倍；將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液，作用90 min 再次洗膜。根據(jù)條帶亮度適當(dāng)選擇曝光時(shí)間。用Image Pro Plus 5.0 圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，蛋白相對表達(dá)量用目標(biāo)灰度與β-actin 灰度值比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5 對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組HE 染色結(jié)果分析

空白組神經(jīng)根組織形態(tài)基本正常，神經(jīng)根外膜包裹完整，神經(jīng)纖維和胞體排列較整齊，纖維軸突和髓鞘完整，胞體數(shù)量較多。模型組神經(jīng)根組織受損較嚴(yán)重，神經(jīng)根外膜包裹不完整，纖維排列紊亂，部分纖維軸突消失；胞體數(shù)量明顯減少，核仁不明顯。藥熨組神經(jīng)根組織形態(tài)部分受損，神經(jīng)根外膜包裹較完整，纖維排列較整齊，胞體數(shù)量較空白組減少但比模型組多，間質(zhì)有輕度炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 三組HE 染色結(jié)果

2.2 三組透射電子顯微鏡

空白組細(xì)胞胞質(zhì)豐富，線粒體豐富，嵴排列清晰。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體密集，可見少量溶酶體與自噬小體。模型組細(xì)胞核有空洞，線粒體膜模糊，部分嵴斷裂，膜破裂。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)見大量溶酶體與自噬小體。藥熨組細(xì)胞質(zhì)豐富，線粒體部分膜破裂，部分嵴斷裂溶解。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)的溶酶體與自噬小體數(shù)量均較模型組顯著減少。見圖2。

圖2 三組透射電子顯微鏡下表現(xiàn)

2.3 三組p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比較

模型組p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)低于空白組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 高于空白組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。藥熨組p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)高于模型組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 低于模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖3。

圖3 三組p-Akt、p-mTOR、Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)比較（n=6）

3 討論

CSR 是由于頸部“陽化氣”功能衰弱[7]，風(fēng)寒濕邪侵襲致營衛(wèi)失和，濕性黏滯，造成寒凝瘀血痰濕等“陰翳”聚集。組織充血水腫、炎癥細(xì)胞浸潤，血液黏稠，阻滯脈絡(luò)，經(jīng)氣不通而痛[8]。前期研究顯示，循經(jīng)藥熨可顯著改善CSR 患者神經(jīng)病理性疼痛[4]，下調(diào)血清腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1L 的水平。自噬在神經(jīng)性疼痛發(fā)展中起重要作用[2]。過度自噬誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，自噬程度越高，細(xì)胞凋亡越多，兩者呈正相關(guān)[9]。PI3K/Akt/mTOR 通路是目前已知調(diào)控細(xì)胞自噬的抑制性通路[10]，Akt/mTOR 通路是自噬重要負(fù)性調(diào)控路徑[3]。自噬之后繼發(fā)凋亡是Akt/mTOR 通路被抑制的結(jié)果，激活A(yù)kt/mTOR 通路可抑制細(xì)胞凋亡。Akt 是重要的細(xì)胞凋亡抑制劑，是PI3K 下游主要靶因子，信號激活后被磷酸化為p-Akt，其表達(dá)量可反映磷酸化Akt 整體量[11-12]，是信號通路正向激活標(biāo)志[13]。mTOR 是Akt 下游重要轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，p-Akt 可直接激活其底物mTOR[14]，mTOR 可調(diào)控細(xì)胞自噬抑制基因，mTOR 磷酸化為pmTOR 后介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR 通路下游分子降低自噬活性，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[15-18]。結(jié)果顯示，模型組p-Akt、p-mTOR 表達(dá)低于空白組，藥熨組p-Akt、p-mTOR 表達(dá)高于模型組，提示藥熨組可上調(diào)p-Akt、p-mTOR 蛋白表達(dá)量，并激活A(yù)kt/mTOR通路，該路徑激活可抑制自噬蛋白活性，降低細(xì)胞自噬能力，并在抑制細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[19-20]。

Akt/mTOR 通路可作用于眾多靶分子調(diào)節(jié)自噬，如自噬關(guān)鍵基因Beclin-1、LC3[21]。Beclin-1 及LC3 是自噬標(biāo)志性蛋白。Beclin-1 可調(diào)控自噬體形成，促進(jìn)自噬小體起始囊泡形成，與自噬活性密切相關(guān)[22]。LC3是公認(rèn)自噬體特異性標(biāo)志分子，其蛋白表達(dá)量與自噬泡數(shù)量呈正相關(guān)[23]。LC3 分Ⅰ型、Ⅱ型，細(xì)胞自噬時(shí)，LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾生成其蛋白水解衍生物L(fēng)C3-Ⅱ[23]。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可評價(jià)自噬水平[24]，本研究模型組自噬因子Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平顯著提升，即應(yīng)激狀態(tài)下，神經(jīng)根損傷初期自噬較活躍，即細(xì)胞凋亡較多。HE 染色顯示造模后細(xì)胞有局部炎癥水腫、充血、浸潤改變。透射電子顯微鏡檢查也提示模型組細(xì)胞核出現(xiàn)空洞，線粒體的外膜模糊，部分存在嵴斷裂及膜破裂現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見大量溶酶體和自噬小體。藥熨組細(xì)胞質(zhì)豐富，溶酶體和自噬小體均較模型組顯著減少。自噬因子Beclin-1及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)均下調(diào)，亦提示細(xì)胞自噬活性下降。細(xì)胞自噬活性下降，可在一定范圍內(nèi)降低細(xì)胞過度凋亡，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞[25]。

藥熨療法通過對體表熱刺激，加以傳統(tǒng)中藥乳香、沒藥、紅花、桂枝、千年健、雞血藤、牛大力、飛龍掌血，具有溫經(jīng)活絡(luò)、散瘀鎮(zhèn)痛、祛風(fēng)除濕等功效[26]。通過加熱使藥物通透表里，深達(dá)脈絡(luò)以暢通氣血。藥熨鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與激活A(yù)kt/mTOR 通路，適度下調(diào)神經(jīng)細(xì)胞的自噬因子Beclin-1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡有關(guān)。