刺五加標準湯劑制備及質量標準研究

張金秋，邊 雨，曹玉春，魏曉雨，鄒 慧

(吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司，吉林 長春 130012)

刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanaxseuticosus(Rupr.et Maxim.)Harms的干燥根和根莖或莖。春秋二季采收，洗凈，干燥。刺五加主要分布于東北三省、山西、河北等地，其中黑龍江和吉林產地為道地產區(qū)[1]。主要化學成分有黃酮、皂苷、氨基酸及有機酸等，具有益氣健脾、補腎安神等功效[2-3]。相比傳統(tǒng)湯劑的服用、儲存以及不方便攜帶等問題，中藥配方顆粒具有質量可控性、療效可靠、服用便捷等優(yōu)點[4-6]。

依據國家藥典委員會發(fā)布的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》(征求意見稿)[7]，以下簡稱《征求意見稿》，中藥配方顆粒的制備，除制劑工藝外，其余應與傳統(tǒng)湯劑基本一致，即以水提取，以物理方法固液分離、濃縮、干燥、顆粒成型等工藝生產。中藥配方顆粒藥效物質應與中藥飲片水煎湯劑保持基本一致[5]。

本研究收集全國主要刺五加產地樣品，按照《征求意見稿》進行標準湯劑的制備，測定紫丁香苷含量，建立指紋圖譜，進行系統(tǒng)聚類分析和主成分分析，以評價不同產地刺五加標準湯劑的質量，為后續(xù)生產配方顆粒的質量控制提供參考依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(Thermo公司，美國，型號：Ultimate3000)；多鍋煎藥機(山東青州精誠醫(yī)藥設備制造有限公司，型號：JY-8)；冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：Scientz-30)；超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SB-1200D)；薄層成像系統(tǒng)(上?？普苌萍加邢薰?，型號：GoodLook-1000)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，型號：ME204E、AB135-S)。

1.2 試劑與試藥

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，來自Fisher公司，其他試劑均為分析純，水為超純水。

對照品：原兒茶酸(批號110809-201205，純度：99.90%)、紫丁香苷(批號111574-201605，純度：98.8%)、綠原酸(批號110753-201716，純度：99.3%)均購買于中國食品藥品檢定研究院。

1.3 樣品

刺五加藥材：包含了刺五加藥材的道地產區(qū)及主產區(qū)，依次編號為A1-A16，具體信息見表1。

表1 16樣品信息

2 方法與結果

2.1 標準湯劑的制備

參照《征求意見稿》中技術要求進行制備，方法如下：取刺五加藥材飲片100 g，分別加9倍、7倍量水進行煎煮，第一次浸泡30 min，武火煮沸、文火保持微沸，煎煮時間分別為60 min、40 min，過濾，合并濾液，溫度低于50 ℃減壓濃縮至100 mL。將濃縮液置于培養(yǎng)皿中，-56 ℃凍存12 h，冷凍干燥，即得刺五加標準湯劑凍干粉。依次編號為S1-S16。如表1所示。

2.2 紫丁香苷含量測定

參照2015版《中國藥典》[1]刺五加藥材項下紫丁香苷含量測定方法進行測定。

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水(20∶80)為流動相；檢測波長為265 nm。色譜見圖1。

圖1 對照品(S1)、藥材供試品(S2)、標準湯劑供試品(S3)HPLC色譜

2.2.2 對照品溶液的制備 取紫丁香苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含紫丁香苷0.50 mg的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加20 mL甲醇溶解，超聲(功率250W，頻率50 kHz)20 min，取出，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，即得。

2.2.4 測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2.5 方法學考察 (1)線性關系的考察：精密稱取紫丁香苷對照品21.94 mg(中國食品藥品檢定研究院，批號111574-201504，98.7%)，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲溶解，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，即得2.165 5 mg·mL-1的紫丁香苷對照品貯備液；分別精密移取貯備液0.125、0.25、0.5、1、2.5 mL，至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，得濃度分別為0.054 2、0.108 5、0.216 9、0.433 9、1.084 7 mg·mL-1的對照品溶液。按照“2.2.4”項下方法測定。以濃度(mg·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。得回歸曲線y=44.659x+0.115，相關系數r=0.999 8。結果表明，紫丁香苷在0.054 2～1.084 7 mg·mL-1范圍內線性良好。

(2)精密度試驗：取同一批樣品(編號S1)約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL。按“2.2.1”項下色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，結果紫丁香苷峰面積RSD=0.23%，表明儀器精密度良好。

(3)重復性試驗：取同一批(編號S1)刺五加標準湯劑干粉約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備6份供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL。按“2.2.1”項下色譜條件測定，測得同一批標準湯劑干粉中紫丁香苷的含量均值為1.48%，RSD=1.49%(n=6)，表明方法重復性良好。

(4)穩(wěn)定性試驗：取同一批(編號S1)刺五加標準湯劑干粉約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL。按“2.2.1”項下色譜條件測定，分別在制備后放置0、4、8、12、16、24 h進樣檢測，結果紫丁香苷峰面積RSD=1.70%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

(5)回收率試驗：取已知含量的紫丁香苷標準湯劑干粉(編號S1)，約0.1 g(共6份)，精密稱定，分別置于25 mL容量瓶中，分別精密加入對照品溶液各1 mL(對照品溶液濃度為1.462 7 mg·mL-1)，加入一定量的紫丁香苷對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”色譜條件進行液相分析。結果，平均回收率為98.71%，RSD為1.47%(n=6)，表明本方法準確度良好。

2.2.5 指標成分含量測定 按照“2.2.1”項下色譜條件測定16批標準湯劑中紫丁香苷的含量，并計算紫丁香苷轉移率，結果見表2。

表2 16批標準湯劑中紫丁香苷測定結果 (%)

結果，16批標準湯劑平均出膏率為5.74%，按照均值±30%的范圍浮動為4.02%～7.46%；標準湯劑中紫丁香苷平均含量為4.41%，按照均值±30%的范圍浮動為3.09%～5.73%；紫丁香苷平均轉移率為42.25%，按照均值±30%的范圍浮動為29.58%～54.93%，本研究的16批標準湯劑出膏率、紫丁香苷含量及轉移率均在此范圍內，表明制備工藝規(guī)范，穩(wěn)定、可行。

2.3 指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件 色譜柱為WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相；梯度洗脫，0～30 min，8%～16%乙腈；30～40 min，16%～25%乙腈。檢測波長為220 nm，柱溫為25 ℃，流速為0.8 mL·min-1。此色譜條件下，各色譜峰的分離度良好，峰形對稱。色譜見圖2。

2.3.2 混合對照品溶液的制備 取原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸對照品適量，加入甲醇，即得每1 mL含原兒茶酸39.6 μg、紫丁香苷80 μg、綠原酸170 μg的混合對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粉末約0.2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加20 mL甲醇溶解，超聲(功率250 W，頻率50 Hz)20 min，取出，冷卻至室溫，加甲醇至刻度，即得。

2.3.4 方法學考察 (1)精密度試驗：取同一批刺五加標準湯劑干粉約0.2 g，精密稱定，按照“2.3.3”方法制備供試品溶液一份，按“2.3.1”項下方法連續(xù)進樣6次，以紫丁香苷(S)為參照峰，計算7個共有峰的相對峰面積，結果RSD均在3%以內，表明儀器精密度良好。

(2)重復性試驗：取同一批刺五加標準湯劑干粉約0.2 g，精密稱定6份，按照“2.3.3”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下方法進行測定，以紫丁香苷(S)為參照峰，計算7個共有峰的相對峰面積，結果RSD均在3%以內，表明方法重復性良好。

(3)穩(wěn)定性試驗：取同一批刺五加標準湯劑干粉約0.2 g，精密稱定，按照“2.3.3”方法制備供試品溶液，分別在制備后放置0、4、8、12、16、24 h后，按照“2.3.1”項下方法進行測定，以紫丁香苷(S)為參照峰，計算7個共有峰的相對峰面積，結果RSD均在3%以內，表明供試品溶液在24 h穩(wěn)定性良好。

峰2：原兒茶酸；峰3(S)：紫丁香苷，峰4：綠原酸。圖2 刺五加標準湯劑HPLC對照指紋圖譜

(4)指紋圖譜的建立與分析：按照“2.3.1”項下色譜條件測定16批刺五加標準湯劑指紋圖譜，將所得到的色譜數據導入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)軟件》，采用多點校正將譜峰自動匹配，中位數法計算得出樣品指紋圖譜的共有模式。刺五加標準湯劑指紋圖譜中呈現(xiàn)7個共有峰，通過與對照品圖譜比較，指認峰2為原兒茶酸，峰3為紫丁香苷，峰4為綠原酸，其中以紫丁香苷為參照峰(S峰)，16批次刺五加標準湯劑HPLC指紋圖譜相似度均在0.9以上。色譜見圖3。

圖3 16批刺五加標準湯劑HPLC色譜

2.3.5 聚類分析 將16批刺五加標準湯劑干粉(編號S1-S16)指紋圖譜中的7個共有峰峰面積為變量，采用SPSS 21.0 軟件，以組間平均數連接法、平方Euclideam距離為度量標準進行聚類分析。結果，16批刺五加標準湯劑干粉可聚為4類，其中S1聚為一類，S7聚為一類，S5、S8、S15聚為一類、剩余其他聚為一類，詳見圖4。

圖4 16批刺五加標準湯劑干粉的聚類分析樹狀圖

2.4 主成分分析

采用SPSS 21.0軟件對16批刺五加標準湯劑干粉的7個共有峰峰面積進行主成分分析，以特征值>1為判斷標準。特征值和方差貢獻率見表7，由表7可知，共提取了3個主成分，3個主成分的累積方差貢獻率為67.649%，詳見表3。

表3 特征值和方差貢獻率

主成分載荷矩陣(也稱主成分系數)不等同于因子載荷矩陣，可通過因子載荷矩陣計算得到，根據表3結果按公式計算，Ui=Ai/√λ[6](式中，Ui為載荷矩陣，Ai為因子載荷矩陣，λ為特征值)，峰1、峰2(原兒茶酸)、峰7在第1主成分有較高載荷，峰3(紫丁香苷)、峰4(綠原酸)、峰5在第2主成分有較高載荷，峰2(原兒茶酸)在第2主成分有較高載荷，結果見表4。

表4 主成分矩陣

每一個載荷量表示主成分與對應變量的系數，第1主成分得分為Z1=0.295X1+0.466X2-0.045X3-0.060X4-0.126X5-0.599X6+0.561X7，第2主成分得分Z2=-0.005X1-0.070X2+0.601X3+0.517X4+0.571X5-0.162X6+0.120X7，第3主成分得分Z3=-0.742X1+0.378X2+0.244X3-0.367X4+0.108X5+0.174X6+0.265X7，綜合得分Z=(27.163%×Z1+25.402%×Z2+15.084%×Z3)/67.649%；綜合得分越高，表示質量越好。結果，16批樣品中，吉林安圖(S1)最優(yōu)，吉林通化(S8)和黑龍江哈爾濱(S9)較佳，詳見表5。

表5 16批刺五加標準湯劑綜合得分結果

3 討論

刺五加藥材飲片中紫丁香苷平均含量為0.7%，平均出膏率為5.74%，標準湯劑中紫丁香苷平均含量為4.41%，從刺五加藥材飲片到標準湯劑凍干粉中紫丁香苷轉移率為42.25%。

中藥標準湯劑是在中醫(yī)藥理論指導下依據臨床湯劑煎煮方式規(guī)范化進行煎煮、分離、濃縮并干燥制得的，為衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑是否基本一致的標準參照物，目前指紋圖譜作為衡量中藥材、標準湯劑、配方顆粒的綜合有效手段[5]。

本實驗采用HPLC法建立刺五加標準湯劑的指紋圖譜，采用二極管陣列檢測器(DAD)進行200～400 nm掃描，將各波長下的色譜圖進行比較分析，結果發(fā)現(xiàn)在檢測波長220 nm處，色譜信息豐富，基線穩(wěn)定，故波長選擇220 nm為檢測波長。采用乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸進行梯度洗脫，結果表明，以乙腈-0.2%磷酸系統(tǒng)梯度洗脫對刺五加標準湯劑的分離效果較好。測定16批標準湯劑中有7個共有峰，并指認出原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸3種成分，16批標準湯劑指紋圖譜相似度均在0.9以上，說明其質量穩(wěn)定性較好，同時對其方法學進行了考察，結果均良好，說明此方法確定可行。

聚類分析法可將不同產地品質較接近的藥材進行聚類，直觀地表現(xiàn)藥材間的親疏關系及產地信息，并對它們進行歸類，是一種很好的評價中藥飲片質量的統(tǒng)計方法[8]。當類間的距離在10～15之間時，黑龍江伊春、吉林通化與黑龍江哈爾濱的刺五加親緣關系較近聚為一類，吉林安圖聚為一類，遼寧沈陽聚為一類，剩余其他樣本聚為一類。主成分分析確定了3個主成分，累計方差貢獻率67.649%，其中原兒茶酸、紫丁香苷、綠原酸對3個主成分貢獻較大，這與文獻報道基本一致[9-10]。按照綜合得分計算吉林安圖得分最高，說明質量最好。

綜上所述，本研究應用指紋圖譜和指標成分紫丁香苷含量測定相結合，初步建立了刺五加標準湯劑的質量評價方法。采用聚類分析和主成分分析法，將樣本來源進行歸類以及主要成分進行分析確定其主成分，從整體定性和指標成分定量的角度為刺五加相關制劑的制備和質量控制提供參考依據。