基于肝X受體探討健脾祛痰法對高脂血癥大鼠肝內(nèi)膽固醇代謝通路的影響

洪詩曉，李墨辭，涂文玲，郭明章

(福建中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，福建 福州 350122)

近年來，高膽固醇血癥成為動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的高危因素，而AS可進一步導致冠心病、腦卒中等高危疾病[1]。研究發(fā)現(xiàn)，我國成人高脂血癥的患病率逐漸升高，已達20%，且該癥患病人群有年輕化趨勢[2]。西醫(yī)臨床多以他汀類、貝特類等為主要抗脂手段，長期服用則出現(xiàn)肌肉疼痛、橫紋肌溶解、痙攣等副作用，而中藥具有副作用低、療效顯著、愈后良好的優(yōu)勢。因此，明確高膽固醇血癥的發(fā)病機理，尋找安全有效的中醫(yī)藥治療高脂血癥的方法為臨床迫切所需。

肝X受體(Liver X receptor，LXR)作為核受體，它在肝組織、腸道以及其他組織中廣泛存在，目前普遍認為，其表達是調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的重要途徑之一。LXR中的亞型之一，LXRα促進膽汁酸合成，從而降低血脂的作用途徑，主要通過前反饋激活CYP7A1導致膽汁酸合成增加[3]。LXR還可通過影響下游因子ABCG5、ABCG8的表達，促進膽固醇直接排入膽汁以助膽固醇排出體外[4]。近年來的研究表明，中醫(yī)運用健脾祛痰法治療高脂血癥及其引發(fā)的心血管疾病，與LXR通過對下游因子的影響作用，促進肝臟中膽固醇分解代謝并排出體外的途徑較為相似。其中，健脾祛痰法經(jīng)典方溫膽湯化裁方在改善血液脂質(zhì)水平，抵抗血液黏稠凝聚等療效明顯，但其具體作用機理尚未明確[5-7]。因此，本課題以LXR為切入點，探索健脾祛痰法對肝內(nèi)膽固醇分解代謝及排出通路的影響機制，以期深入研究其代謝途徑，并為今后用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

40只SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(180±20)g，購自上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司(許可證號：SCXK(滬)2017-0012)。動物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，照明周期以12 h/12 h交替，換氣頻率為10～20次/h，溫度(23±2)℃。每組動物均自由飲水。本課題通過福建中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查，批準文號：FJTCM IACUC 2020069。

1.2 藥物及飼料

本課題方藥溫膽湯化裁方藥物均購自福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院中藥房，組成為：薏米30 g、茯苓30 g、浙貝10 g、竹茹10 g、扁豆10 g、枳殼10 g、桔梗15 g、陳皮5 g、甘草5 g。配置方法：用蒸餾水將中藥材水煎30 min，提取兩次。將兩次煎液混合后用雙層紗布過濾，待藥液中無明顯雜質(zhì)后，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，該藥液配置完畢后需置于4℃冰箱保存，每次取用時須放置至常溫，方可進行灌胃。給藥劑量：溫膽湯化裁方3組灌藥的劑量通過人與大鼠體表面積比率換算法計算為6 g/kg、12 g/kg、25 g/kg。其余兩組分別按相應比例蒸餾水代替溫膽湯化裁方灌服，每次用藥體積均按1 mL/100 g計算，本次實驗給藥與造模同時進行。本課題使用的高脂飼料均購自上海帆泊生物技術有限公司，配方見表1。

表1 高脂飼料配方

1.3 主要試劑及儀器

1.3.1 試劑 主要試劑或試劑盒如下：大鼠膽固醇7a羥化酶(CYP7A1)、G5(ABCG5)、G8(ABCG8)試劑盒。江蘇酶免(SOD)、(MDA)試劑盒(TBA法)、江蘇酶免(GSH-PX)試劑盒(比色法)(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號如下：MM-0685R1、MM-70740R1、MM-70743R1、A001-3-2、A003-1-2、A005-1-2)。Trizol (RNA 提取試劑盒)、cDNA一鏈合成試劑盒、Gelred、SYBR Green熒光定量試劑盒(Vazyme公司，批號分別為：R401-01、R123-01、GR501-01、Q311)；PCR Mix、DNA maker II(北京艾德萊公司，批號分別為：PC0903、DM0702)。

1.3.2 儀器 本研究使用儀器見表2。

表2 主要實驗儀器

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

40只大鼠分開適應性喂養(yǎng)7 d后，按體質(zhì)量隨機平均分配為5組，分組情況和每組飼養(yǎng)情況見表3。

表3 大鼠分組情況

2.2 給藥方法及標本采集

從造模第一天起同時給藥，按1 mL/100 g鼠體質(zhì)量的比例計算藥量。連續(xù)灌胃4周，取材前一晚禁食不禁水。20%烏拉坦(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉，待麻醉后經(jīng)腹主動脈取血，分離血清以便后續(xù)實驗使用；迅速取下肝左葉同樣部位組織，部分置于凍存管中保存于-80 ℃冰箱待測，部分置于4%多聚甲醛液中固定備用。

2.3 檢測指標及檢測方法

2.3.1 血清脂質(zhì)含量 測定血清TC、TG、HDL、LDL 的含量：血液常溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，抽取上清液，全自動生化分析儀檢測上清液相關指標。

2.3.2 肝功及病理指標檢測 使用生化檢測方法對肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和脂質(zhì)過氧化物(MDA)的病理指標進行檢測。

2.3.3 肝臟形態(tài)學觀察 將已固定的肝組織進行包埋、切片、HE染色，光學顯微鏡下觀察其病理形態(tài)。

2.3.4 分子生物學檢測 采用qPCR方法對LXRαmRNA表達水平進行測定。取適量肝組織進行碾磨，提取RNA，用紫外分析儀測其濃度與純度。進行PCR擴增時以mRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板。反應體系為：TB Green Ex Taq(TilRaseH Plus)(2x)10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50x)0.4 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL，cDNA 2 μL。反應條件為：90 ℃ 30 s、90 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒上的說明進行操作，其中，引物序列見表4。

表4 引物序列

2.3.5 ELISA法檢測肝組織中CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平 分組、加樣、溫育、顯色等操作按說明書依次進行。終止反應后用450 nm 波長測量各孔的吸光度(OD值)。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量變化情況

實驗期間，正常組大鼠體型勻稱，皮毛順滑光澤，活動靈活，性情較為溫順；模型組大鼠體型肥胖，行動較為懶惰，與正常組相比皮毛較為暗淡蓬亂，易被激怒。各組大鼠體質(zhì)量變化見表5。實驗末期，模型組大鼠體質(zhì)量增長速度高于正常組大鼠(P<0.01)。與模型組比較，低劑量組大鼠體質(zhì)量增長無差異，中、高劑量組體質(zhì)量增量降低(P<0.01)。

表5 各組大鼠體質(zhì)量增量比較

3.2 各組大鼠血清TC、TG、HDL、LDL 含量變化

與正常組比較，模型組TC、TG、LDL急劇上升(P<0.001，P<0.001，P<0.05)，HDL急劇下降(P<0.001)，這提示模型構(gòu)建成功。與模型組比較，低劑量組TG明顯降低(P<0.001)。中、高劑量組TC、TG顯著降低(P<0.01，P<0.001)、LDL各自有不同程度的下降(P<0.05，P<0.001)、HDL顯著增高(P<0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義。這表明溫膽湯化裁方在不同劑量時，均有相應的降脂效果。見表6。

表6 各組大鼠血清TG、TC、HDL、LDL含量比較

3.3 各組大鼠肝組織中SOD、GSH-PX、MDA的比較

模型組MDA明顯上升(P<0.001)，SOD、GSH-PX顯著下降(P<0.001)。低劑量組有所下降，但差異并無統(tǒng)計學意義。中、高劑量組MDA隨著藥物劑量的增長，其結(jié)果呈逐漸下降趨勢(P<0.01，P<0.001)，而SOD、GSH-PX也隨藥物劑量的增加呈現(xiàn)不同程度的上升趨勢(P<0.01，P<0.001)。見表7。

表7 各組大鼠肝組織SOD、GSH-PX、MDA水平組間比較

3.4 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學變化

正常組大鼠細胞排列呈以中央靜脈為圓心的條索狀，無空洞，細胞結(jié)構(gòu)完整，未見異常凋亡，無明顯脂肪樣變性。模型組大鼠細胞排列凌亂，難以辨認細胞邊界和肝小葉形態(tài)，細胞可見壞死或脂質(zhì)樣改變、中性粒細胞浸潤，且出現(xiàn)大量空洞；與模型組比較，各治療組均有所改善，其中，以高劑量組病理改善效果為佳。見圖1。

3.5 各組大鼠肝組織中LXRαmRNA表達水平變化

模型組LXRαmRNA表達相對于正常組降低(P<0.05)。與模型組比較，低、中、高劑量組LXRαmRNA水平變化隨著給藥濃度增加而增加，其中，低、中劑量組差異無統(tǒng)計學意義，高劑量組LXRαmRNA表達水平則顯著增加(P<0.01)。見表8。

注：A為正常組，B為模型組，C為低劑量組，D為中劑量組，E為高劑量組。圖1 溫膽湯化裁方對高膽固醇血癥大鼠肝組織形態(tài)學變化的影響(HE，×400)

表8 各組大鼠肝組織中LXRαmRNA表達水平的變化

3.6 各組大鼠肝組織中CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平變化

與正常組比較，模型組大鼠肝組織CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平均明顯降低(P<0.001，P<0.05，P<0.001)。與模型組比較，低劑量組CYP7A1、ABCG5的蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，ABCG8的蛋白表達水平無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；中、高劑量組CYP7A1、ABCG5和ABCG8蛋白表達水平明顯上升(P<0.05，P<0.01，P<0.001)。見表9。

表9 各組大鼠肝組織中CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平變化

4 討論

在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，雖無明確高脂血癥病名，但在論述此類病癥時，多以“膏”“痰”“濕”表述[8]。當體內(nèi)臟腑陰陽不平衡時，氣血津液的生化代謝也會出現(xiàn)障礙，最后聚積成為痰濕。在中醫(yī)理論中，生痰之源為脾胃，若脾胃陰陽失調(diào)，功能不健，則津液積聚不能代謝，最后成為痰濕脂膏入血脈，脂質(zhì)含量必然隨之增高。因此有醫(yī)家提出，高脂血癥雖病位在血液，但其致病本質(zhì)還在于脾胃失調(diào)，不能運化黏稠的代謝產(chǎn)物，最終堆積則為血濁，堵塞脈道。

本病脾胃為虛，痰濁脂膏為實，證屬本虛標實，治療當以健運脾胃、祛痰化濕。通過增強脾胃運化的功能，使得積聚的痰濕脂膏運化排出，則高脂血癥得以改善。這種治法，與現(xiàn)代醫(yī)學研究中通過調(diào)控LXR對下游因子的影響，促進肝臟中膽固醇分解代謝并排出體外的途徑非常相近。從研究結(jié)果看，①模型組大鼠的TC、TG、LDL均顯著增高，且HE染色結(jié)果顯示其肝組織細胞出現(xiàn)脂質(zhì)變性，說明在高脂飼料喂養(yǎng)下，該組大鼠體內(nèi)膽固醇出現(xiàn)病理性堆積，進一步出現(xiàn)高膽固醇血癥，而通過溫膽湯化裁方干預的大鼠，其TC、TG、LDL均有不同程度的降低，其中，高劑量組效果最為明顯。這表明溫膽湯化裁方可有效減少大鼠肝組織脂肪變性，幫助脂質(zhì)代謝，從而防治高膽固醇血癥；②從qPCR結(jié)果看，模型組大鼠LXRαmRNA表達水平明顯降低，通過藥物干預后，LXRαmRNA表達水平逐步上升，其中，高劑量組的效果最為明顯。這說明溫膽湯化裁方可有效提高LXRαmRNA表達水平，促進其激活CYP7A1，導致膽汁酸合成增加，使膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化，從而達到降低血脂的目的；③從CYP7A1、ABCG5和ABCG8的蛋白表達水平的變化結(jié)果看，模型組大鼠表達均降低，而中藥組大鼠表達則逐漸上升，數(shù)據(jù)顯示溫膽湯化裁方中、高劑量組的蛋白表達水平均增加明顯。這表明在溫膽湯化裁方干預下，限速酶CYP7A1增強自身表達，促進了膽固醇合成為膽汁酸。ABCG5和ABCG8表達的增強也對膽固醇向膽汁中排放具有推動作用，從而達到降低體內(nèi)脂質(zhì)的目的[9-12]。

因此，本研究探討健脾祛痰法，研究其對LXR通路的影響機制，并在選方上選用了以理氣化痰、和胃利膽為主的溫膽湯化裁方。在原方半夏、竹茹、枳實、陳皮、甘草、茯苓的基礎上減半夏，加浙貝、扁豆、薏米、桔梗。方中浙貝、竹茹、陳皮、桔梗、枳殼祛痰理氣，茯苓、扁豆、薏米、甘草健脾祛濕。全方以脾胃痰濕較盛之多見證候而立，可改善血液濃、黏、凝、聚狀態(tài)[13-17]，臨床上適應人群較廣，副作用低，適合長期服用，對于高脂血癥的臨床具有未病防治、既病防變的獨特優(yōu)勢。

綜上，本研究結(jié)果表明：溫膽湯化裁方可有效降低肝組織脂質(zhì)變性，增強膽汁酸合成，促進膽固醇向膽汁中排放，從而有效防治高脂血癥。其作用機制與上調(diào)CYP7A1表達，促進膽汁酸轉(zhuǎn)化，上調(diào)ABCG5和ABCG8的蛋白表達，促進膽固醇排放有關。相比于臨床上運用西藥治療，該方效果明顯，且副作用少、不良反應小，對治療高脂血癥，降低心腦血管疾病有防治作用。