銀杏葉中蛋白質的提取工藝研究

楊興變，張蜀美，李俊，王黔陽，何珺

摘要：為建立經(jīng)濟、簡便、有效的銀杏葉蛋白質提取方法，采用正交法對銀杏葉中蛋白質進行提取，紫外分光光度法對其進行含量測定。結果表明： 銀杏葉蛋白質在λ=560 nm波長條件，在050～500 mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好，其標準曲線為y=00645x+00037，R2=0998;銀杏葉中蛋白質提取工藝為：料液比為1∶8、提取時間為2 h、提取溫度為70 ℃。本方法經(jīng)濟、簡便，重復性好，可快速有效地從銀杏葉中提取蛋白質，為充分利用銀杏葉資源提供實踐依據(jù)。

關鍵詞：銀杏葉;蛋白質;提取

中圖分類號：R93文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2022）01-0089-004國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.01.013

Study on the Protein Extraction Technology of Ginkgo Biloba Leaves

Yang Xingbian1，Zhang Zhumei1，2，Li Jun1，2 ，Wang Qianyang3，He Jun1*

（ 1.Research Center of Biochemistry Engineering of Guizhou Province，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.College of Pharmacy，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;3.Guizhou Beiyinte Biotechnology Co.，Ltd，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：To establish an economic，simple and effective method for protein extraction from Ginkgo biloba leaves.The orthogonal method was used to extract the protein from the leaves of Ginkgo biloba，and the content of protein of Ginkgo biloba leaves was determined by ultraviolet spectrophotometer （λ=560 nm）.The results showed that the standard curve was y= 0.0645x+0.0037，R2=0.998 and Ginkgo biloba protein had a good relationship in the range of 0.50～5.00 mg/mL.The optimum extraction parameters were as follows：the ratio of material to liquid was 1∶8，the extraction time was 2 h and the extraction temperature was 70 ℃.This method was economical，simple and reproducible，and it can be used to extract protein from Ginkgo biloba leaves quickly and effectively，which provides practical basis for rational and full utilization of Ginkgo biloba leaves resources.

Keywords：Ginkgo biloba leaves;protein;extraction

中國是銀杏主產(chǎn)國，約占全球的80 %，銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，具有斂肺、平喘、活血化瘀、止痛的功效[1]，主要含有黃酮類、萜內(nèi)酯類、有機酸類、酚類、多糖、蛋白質等多種活性成分，其中黃酮類、萜內(nèi)酯類為銀杏葉提取物的主要活性成分，是銀杏葉開發(fā)利用的重點[2-5]，而對其蛋白質相關研究較少[6]，從銀杏葉中提取蛋白質更是未見報道，只見以雜質形式被祛除的報道[7]。蛋白質是生命體重要的組成部分，是食物中的重要組成部分，同時也是藥物研究的重要靶點，但目前蛋白質資源短缺尤為嚴峻[8-11]，因此，解決蛋白質資源短缺已經(jīng)成為全球關注的熱點問題。據(jù)查閱文獻， 銀杏干葉中蛋白質含量598 %，可以作為一種蛋白質來源加以利用[6，11]。銀杏葉蛋白質中含有亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和色氨酸等人體必需的6種氨基酸。然而，在生產(chǎn)銀杏葉提取物時，大量的水溶液、水洗液被直接丟棄，而銀杏葉中的蛋白質就在被直接丟棄的水溶液、水洗液中，造成了資源的浪費。因此，本文利用正交法建立銀杏葉中蛋白質的提取方法，使銀杏葉在生產(chǎn)銀杏葉提取物的同時，可對其蛋白質進行提取回收利用。這不僅可以提高銀杏葉資源的綜合利用率，還可以減少生產(chǎn)廢液的排放，為銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

電子天平（BSA124S，賽多利斯科學儀器公司）;紫外可見分光光度計（Cary 60 UV-Vis，Agilent Technologies）;電熱鼓風干燥箱（GZX-9140 MBE，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療廠）;電熱恒溫水鍋?。℉HW21-600C，常州華奧儀器制造有限公司）;粉碎機（FSJ-A05N6，龍港市創(chuàng)達商貿(mào)有限公司）等。

氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅，均為分析純;水為娃哈哈純凈水。

1.2試驗材料及對照品

材料：銀杏葉（8年生干銀杏葉，2020年7月20號購于道真華山綠色產(chǎn)業(yè)公司）;

對照品：酪蛋白（含量>96%，批號：202009 02，山東萍聚生物科技有限公司）;

雙縮脲試劑：精密稱取3015 g的氫氧化鈉溶于300 mL的水中得到A液，精密稱取酒石酸鉀鈉599 g和無水硫酸銅150 g溶于500 mL的水中得到B液，將A、B液混合搖勻即得。

酪蛋白標準品溶液的制備：精密稱取05002 g酪蛋白于100 mL容量瓶中，加入005 mol/mL的氫氧化鈉溶液，定容，搖勻，即得500 mg/mL的酪蛋白標準品溶液。

1.3試驗方法

1.3.1蛋白質標準曲線繪制

取7支具塞試管，按表1系列梯度精密移取酪蛋白標準溶液和純水。

快速在每支試管中加入6 mL的雙縮脲試劑，振蕩均勻，加完后置于室溫下反應30 min，然后在560 nm波長下，以純水為空白，迅速測其吸光度并繪制標準曲線。

銀杏葉蛋白質含量測定：分別將對應的對照品溶液與供試品溶液放入紫外分光光度儀，記錄各自吸光度值，根據(jù)線性關系計算相應的濃度，其質量及含量按公式（1）、（2）計算：

蛋白質的質量（mg）=測定蛋白質濃度（mg/mL）×樣液體積（mL）（1）

蛋白質的含量=蛋白質質量（mg）/樣品的質量（mg）×100%（2）

1.3.2銀杏葉中蛋白質提取單因素考察

將銀杏葉放在60 ℃的電熱鼓風干燥箱中烘至完全干燥，粉碎，過 80目篩，得到銀杏葉粉末供試品。

提取溫度考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。按1∶10的料液比加入蒸餾水，分別在設定的溫度20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃條件下，水浴提取1 h，趁熱抽濾即得不同溫度提取的供試品溶液;按照銀杏葉蛋白質含量測定方法測其吸光度值。

料液比考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。分別按不同的1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14等料液比加入蒸餾水，在80 ℃條件下，水浴提取1 h，趁熱抽濾即得不同料液比提取的供試品溶液;按照銀杏葉蛋白質含量測定方法測其吸光度值。

提取時間考察：精密稱取 1 g 的銀杏葉供試品粉末于 10 mL具塞試管中，共稱取5份。按1∶10的料液比加入蒸餾水，在80 ℃條件下，分別水浴提取1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，趁熱抽濾即得不同時間提取的供試品溶液;按照銀杏葉蛋白質含量測定方法測其吸光度值。

1.3.3銀杏葉蛋白質提取正交試驗

根據(jù)單因素結果，結合文獻[12-15]和實際大生產(chǎn)的經(jīng)驗，以水為溶劑，料液比、提取時間、溫度為主要因素，各個因素設置三個水平，進行正交試驗分析，因素和水平值見表2。

精密稱取銀杏葉粉末1.00 g置于試管中，根據(jù)正交試驗因素水平表中料液比的要求，加入相對應的純水并將其密封好，平行操作下水浴加熱提取，濾過，獲得提取液，將其稀釋不同倍數(shù)并加入雙縮脲溶液60 mL，在室溫下反應30 min，在560 nm測其吸光度，根據(jù)公式（1）、（2）和線性關系計算含量。

1.3.4重復性驗證試驗

平行稱取三批次銀杏葉粉末，按正交試驗最佳方法提取銀杏葉中的蛋白質，濾過，得到提取液，取樣測其含量。

2結果與分析

2.1線性關系的結果

以對照品濃度為X軸（橫坐標），以吸光度值為Y軸（縱坐標）繪制標準曲線，結果見圖1。

由圖1得到酪蛋白在λ=560 nm波長條件，其標準曲線為y=00645x+00037（R2=0998），表明酪蛋白在050～500 mg/mL的范圍內(nèi)線性關系良好，可用于后續(xù)銀杏葉中提取蛋白質的檢測。

2.2單因素考察結果

以計算得到銀杏葉中蛋白質的百分含量與對應的提取溫度、料液比、提取時間作圖，結果分別見圖2、圖3和圖4。

由圖2可知，隨著溫度的上升，銀杏葉中蛋白質提取百分含量逐漸上升，80 ℃達到最高，溫度繼續(xù)上升反而降低，這有可能溫度過高，導致蛋白質不可逆變性沉淀，檢測時保證溶液的清亮而被過濾損失，故選擇 60 ℃、70 ℃、80 ℃ 三個水平進行正交試驗。

由圖3可知，料液比為1∶8時，銀杏葉中蛋白質基本被完全提取出來，隨著料液比增加，銀杏葉中蛋白質的提取百分含量已經(jīng)平穩(wěn)，故選擇料液比1∶6、1∶8、1∶10 三個水平進行正交試驗。

由圖4可知，隨著提取時間的增加，銀杏葉中蛋白質提取百分含量逐漸上升，提取越充分，但到達2 h后，銀杏葉中蛋白質的提取百分含量增加較緩慢，故選擇提取時間1 h、2 h、3 h 三個水平進行正交試驗。

2.3正交試驗數(shù)據(jù)與結果

由極差分析結果（表3）可以看出，C因素影響效果比較顯著;考察因素強度為C>B>A，A因素中A2>A3>A1，B因素中B2>B1>B3，C因素中C2>C3>C1，最佳工藝條件為A2B2C2，即是料液比為1∶8，提取時間為2 h，提取溫度為70 ℃ 。

2.3驗證試驗數(shù)據(jù)與結果

從驗證試驗結果（表4）可以看出，三批次提取液中含量相差不大，說明工藝穩(wěn)定，可以有效的提取銀杏葉中的蛋白質。

3結論與討論

蛋白質是一切生命活動的基礎，也是構成生物細胞的重要成分，是動物或者人類都不可缺少的物品。然而目前遇到非常嚴峻的問題，在全球約有1/5的人口嚴重缺乏蛋白質的補充，蛋白質資源短缺已經(jīng)成為全球關注的問題，特別是發(fā)展中國家[10]。除此之外，蛋白質也是藥物研究的重要靶點。因此，解決蛋白質資源短缺已經(jīng)成為全球關注的熱點問題。

中國是世界上銀杏分布最廣的區(qū)域，約占全球的85 %，銀杏葉富含多種活性物質，例如黃酮、內(nèi)酯、多糖和烷基酚酸等。目前，銀杏的研究一直以來都吸引無數(shù)國內(nèi)外科研工作者的眼球，尤其是以黃酮、萜內(nèi)酯為主要有效成分的銀杏葉提取物的研究最受矚目，是銀杏葉開發(fā)利用的重點[2-5]。據(jù)文獻[6，11]報道，銀杏葉中蛋白質含量相對來說不少，可作為蛋白質來源的一種。本文采用正交法，以水為溶劑，料液比、提取時間、溫度為主要因素對銀杏葉中蛋白質提取，紫外分光光度法對其進行含量測定。通過正交試驗得到銀杏葉中蛋白質提取工藝為：料液比為1∶8、提取時間為2 h、提取溫度為70 ℃。驗證試驗得到三批次提取液中蛋白質含量為3.72 %，RSD%為0.12，說明該工藝穩(wěn)定，可以有效的提取銀杏葉中的蛋白質，該方法經(jīng)濟、簡便，重復性好，可快速有效地從銀杏葉中提取蛋白質，使銀杏葉在生產(chǎn)銀杏葉提取物的同時，可對其蛋白質進行提取回收利用。這不僅可以提高銀杏葉資源的綜合利用率，還可以減少生產(chǎn)廢液的排放，為充分利用銀杏葉資源提供實踐依據(jù)。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：329-330.

[2]夏曉暉，張宇，郗硯彬，等.銀杏葉化學成分研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15（9） ：100-104.

[3]Van Beek T A.Chemical analysis of Ginkgo biolba leaves and extracts[J].Journal of? Chromatography A，2002，967（1）：21-55.

[4]Sing B，Kaur P，Gopichan D，et al.Biology and chemistry of Ginkgo biloba[J].Fitoterapia，2008，79：401-418.

[5]楊興變，郁建平，李洪慶.注射劑用銀杏葉提取物生產(chǎn)工藝監(jiān)控研究[J].貴州大學學報（自然科學版），2013，30（3）：62-64，86.

[6]梁紅，徐斌，潘偉民，等.銀杏種子和葉的蛋白質分析[J].植物資源與環(huán)境學報，2000，9（4）：5-8.

[7]王筱瑜，季子非，薩日娜，等.銀杏落葉粗多糖除蛋白方法的篩選及優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2019，40（10）：232-237.

[8]梁玉.檢驗食品中蛋白質含量標準測定方法的改進[J].現(xiàn)代食品，2020（7）：210-212.

[9]劉高強，周虎.復合胰蛋白酶提取松毛蟲蛹中總蛋白質的工藝[J].食品科技，2008，33（12）：140-143.

[10]劉高強，周虎，魏美才，等.馬尾松毛蟲蛹中蛋白質的提取及其營養(yǎng)價值評價[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36（5）：113-116.

[11]蔣瀅.氨基酸的應用[M].北京：世界圖書出版公司，1996：168-215.

[12]孫藝煒.銀杏蛋白與黃酮相互作用影響功能特性及產(chǎn)品開發(fā)研究[D].武漢：武漢輕工大學，2019：1-73.

[13]李盼盼.銀杏蛋白超聲波輔助提取及特性研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學，2012：1-58.

[14]裴月湖，婁紅祥.天然藥物化學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2018：20-21.

[15]楊文盛，張軍東，劉璐，等.不同來源蛋白質提取分離技術的研究進展[J].中國藥學雜志，2020，55（11）：861-866.