雞TRAF6基因外顯子區(qū)功能性SNP預(yù)測與分析

趙采芹，王燕碧，唐宏，邢靜如，石海英，段志強(qiáng)

摘要：采用生物信息學(xué)方法篩選雞TRAF6基因中的功能性非同義單核苷酸多態(tài)性（nsSNPs）位點(diǎn)。從dbSNP數(shù)據(jù)庫中檢索出TRAF6基因的8個(gè)nsSNPs，利用生物信息學(xué)軟件PROVEN、SIFT、PhDSNP和SNAP2分別對nsSNPs進(jìn)行功能性預(yù)測;使用IMutant2.0和Mupro對突變位點(diǎn)氨基酸的穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測;此外，利用Clustal Omega和Jalview對雞TRAF6基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化位點(diǎn)保守性預(yù)測。使用MutPred2預(yù)測突變可能造成的影響;最后使用Sopma和SWISSMODEL軟件分別預(yù)測TRAF6野生型和突變型的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和構(gòu)建它們的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明：從TRAF6基因的nsSNPs位點(diǎn)篩選出來3個(gè)有害突變位點(diǎn)rs736890315（S17R）、rs734934585（C20G）和rs734774178（V472E），其中V472E是四種軟件共同篩選出的突變位點(diǎn)。V472E突變位點(diǎn)可能影響雞TRAF6蛋白的功能，且所有位點(diǎn)突變都會(huì)使TRAF6蛋白穩(wěn)定性降低。保守性分析顯示，D16G、S17R和A307T為不保守位點(diǎn)，C20G、S40G、S40R、T42A和V472E為保守的功能性殘基;MutPred2預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，V472E位點(diǎn)的突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變，其他位點(diǎn)的突變均無顯著影響;二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，雞TRAF6蛋白主要以無規(guī)則卷曲和α螺旋為主，V472E、S40G和C20G這三個(gè)位點(diǎn)上的突變都導(dǎo)致了無規(guī)則卷曲百分比的提高和α螺旋百分比下降;三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRAF6蛋白的野生型和突變體的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。本研究預(yù)測發(fā)現(xiàn)V472E位點(diǎn)突變可能嚴(yán)重影響雞TRAF6蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，V472E可能是雞TRAF6基因的潛在功能性位點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：雞;TRAF6基因;非同義SNP;SNP功能預(yù)測;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S831.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2022）01-0001-010國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.01.001

Prediction and Analysis of Functional SNP on Exon Region of Chicken TRAF6? Gene

Zhao Caiqin1，2，Wang Yanbi1，2，Tang Hong1，2，Xing Jingru1，2，Shi Haiying1，2，Duan Zhiqiang1，2*

（1.Key Laboratory of Plateau Mountain Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：The purpose of this study was to screen the gene of chicken TRAF6 functional nonsynonymous single nucleotide polymorphisms （nsSNPs） by the bioinformatics method.In this study，the 8 nsSNPs of TRAF6 gene were retrieved from dbSNP database，and the functional prediction of nsSNPs was performed by using bioinformatics software PROVEN，SIFT，PhDSNP，and SNAP2，respectively; The amino acid stability of mutation sites was analyzed by IMutant2.0 and Mupro methods; In addition，Clustal Omega and Jalview were used to perform multiple sequence alignment and conservatively predict the evolution sites of amino acid sequences encoded by chicken TRAF6 gene，and Mutpred2 was used to predict the possible effects of mutations.Finally，Sopma and SWISSMODEL software were used to predict the secondary structure and construct the tertiary structure of TRAF6 wildtype and mutant proteins，respectively.The results showed that three harmful mutation sites，rs736890315 （S17R），rs734934585 （C20G），and rs734774178 （V472E），were screened out from nsSNPs sites of TRAF6 gene，of which V472E was the sites jointly screened by the four software.The V472E mutation site might affect the function of chicken TRAF6 protein and all site mutations would reduce the stability of TRAF6 protein.Conservative analysis showed that D16G，S17R，and A307T were not conserved sites，and C20G，S40G，S40R，T42A，and V472E were conserved functional residues; MutPred2 prediction results revealed that V472E mutation site led to changes in protein stability，while mutation at all other sites had no significant effects.The results of secondary structure analysis showed that the chicken TRAF6 protein was composed of the irregular coil and alpha helix.The mutations at V472E，S40G，and C20G all led to the decrease of the irregular coil and the increase of alpha helix.The tertiary structure analysis showed that the tertiary structure of the wildtype and mutant? of TRAF6 protein were consistent with the predicted secondary structure.This study predicted that V472E mutations might seriously affect the structure of chicken TRAF6 protein，and V472E may be a potential functional site of the chicken TRAF6 gene.

Keywords：chicken;TRAF6 gene;nonsynonymous SNP;SNP function prediction;bioinformatics

腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）是腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子家族（TRAFs）中研究最為廣泛的成員之一[1]。與TRAFs家族其他成員不同的是，TRAF6作為胞內(nèi)重要的多功能銜接分子和E3泛素連接酶，能特異性識(shí)別氨基酸序列，從而參與白介素1受體/Toll樣受體（IL1/TLR）和腫瘤壞死因子受體家族等炎癥信號(hào)通路，通過激活信號(hào)通路，對免疫細(xì)胞的存活和激活及其重要[2]。此外，TRAF6蛋白在人和不同動(dòng)物的組織中廣泛表達(dá)，其中在免疫器官脾臟、胸腺和法氏囊中分布較多，在腦和腿肌中也有表達(dá)[35]。研究證實(shí)TRAF6蛋白不僅介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo)，還在免疫應(yīng)答，以及淋巴結(jié)、細(xì)胞分化與凋亡、多種組織生長發(fā)育等過程中也起著關(guān)鍵作用[4，6]。

大量研究表明，基因多態(tài)性與許多疾病的發(fā)生相關(guān)。Strickson等[7]將小鼠野生型TRAF6的第74位氨基酸L突變?yōu)镠，小鼠可以存活5周，之后小鼠因?yàn)槠つw和器官出現(xiàn)炎癥而死亡。與野生型小鼠相比，突變后的L74H沒有出現(xiàn)骨質(zhì)疏松的現(xiàn)象且與野生型的巨噬細(xì)胞相比，信號(hào)傳導(dǎo)和抗炎因子的分泌都減弱了，在TRAF6敲除的小鼠胚胎來源的巨噬細(xì)胞中，無法誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，也沒有細(xì)胞因子的產(chǎn)生。陳子文[8]發(fā)現(xiàn)，TRAF6基因多態(tài)性位點(diǎn)rs5030411、rs5030416可能參與調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)風(fēng)痰癖阻證的炎性反應(yīng)過程，從而影響缺血性中風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。有研究者發(fā)現(xiàn)，位于染色體11p12處的TRAF6基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）和系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）相關(guān)[910]，TRAF6基因內(nèi)含子處rs540386多態(tài)性與自身免疫疾病表型存在關(guān)聯(lián)，TRAF6基因rs331457多態(tài)性可降低皮膚惡性黑色素瘤出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)[11]。此外，有研究報(bào)道，TRAF6基因缺乏會(huì)導(dǎo)致胸腺基質(zhì)異常發(fā)育，從而改變免疫耐受性[12]?？傊?，TRAF6作為一種多功能細(xì)胞因子，以上研究表明TRAF6在多種疾病的免疫應(yīng)答中起著調(diào)控作用。

遺傳變異可能會(huì)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，由此可見，遺傳變異與畜禽的抗病育種存在密切關(guān)系[13]。而單核苷酸多態(tài)性（SNP）是遺傳變異的主要形式，預(yù)測非同義單核苷酸多態(tài)性（nsSNPs）與疾病相關(guān)關(guān)系的研究在近些年也越來越多。nsSNPs通常被認(rèn)為是導(dǎo)致畜禽表型和基因型變異的重要因素[1415]。nsSNPs又可分兩類：若使提前終止蛋白質(zhì)翻譯，而不改變所編碼的氨基酸序，則稱為無義突變;若導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生改變，則稱為錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)與疾病的發(fā)生相關(guān)[16]。

近年來，對TRAF6的研究多見于人、小鼠和畜禽[1719]，此外，也存在于許多非脊椎動(dòng)物如青蛤[20]以及斑馬魚等魚類[21]。而目前對于TRAF6基因的多態(tài)性研究大多是其表達(dá)對于人類疾病的影響[22]，而對禽類TRAF6基因nsSNPs的功能研究報(bào)道較少。本研究利用生物信息軟件對雞TRAF6基因編碼區(qū)nsSNPs進(jìn)行分析，篩選其中可能具有潛在生物學(xué)功能的影響雞抗病育種的候選功能性錯(cuò)義突變位點(diǎn)，并預(yù)測其可能的作用機(jī)理。篩選和分析與雞免疫相關(guān)的TRAF6基因nsSNPs位點(diǎn)，為后續(xù)開展雞抗病育種工作提供理論參考。

1材料與方法

1.1雞TRAF6基因nsSNPs數(shù)據(jù)的收集

根據(jù)TRAF6基因的序列號(hào)（ENSGALT0000010 5433）從Ensembl genome browser（http：//asia.ensembl.org）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。由dbSNP（https：//ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/tag/dbsnp/）數(shù)據(jù)庫[23]檢索的信息收集各SNPs在基因中位置，篩選出位于編碼區(qū)的nsSNPs;從dbSNP數(shù)據(jù)庫中檢索收集nsSNPs（rs IDs）;從UniProtKB數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org/）檢索氨基酸序列;并使用Origin軟件繪制TRAF6基因的SNPs分布圖。

1.2雞TARF6基因功能性nsSNPs預(yù)測

利用SIFT（http：//sift.jcvi.org/）[24]、PROV EAN（http：//provean.jcvi.org/seq_submit.php）[25]、

PhDSNP（https：//snps.biofold.org/phdsnp/phdsnp.html）[26]、SNAP2（https：//www.rostlab.org/services/SNAP/）[27]四種軟件預(yù)測分析各nsSNPs對雞TRAF6蛋白功能的影響，運(yùn)用R語言繪制四種軟件預(yù)測結(jié)果的韋恩圖。

SIFT是一種主要利用SIFT算法，基于氨基酸序列同源性預(yù)測氨基酸替代是否影響蛋白功能的軟件[24]。PROVEAN是一款對單個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入和缺失進(jìn)行預(yù)測的開放性工具[25]。PhDSNP是一種支持向量機(jī)的分類器，基于SVM算法，預(yù)測分析目標(biāo)nsSNPs與疾病是否相關(guān)[26]。SNAP2是一種識(shí)別有影響和中性變異的工具[27]。

1.3雞TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析

利用IMutant2.0（https：//folding.biofold.org/imutant//pages/IMutant2.0_TutSeqVal.html）[28]和Mupro（http：//mupro.proteomics.ics.uci.edu/）[29]在線軟件預(yù)測nsSNP引起蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的改編。IMutant2.0是一個(gè)基于支持SVM的工具，可以自動(dòng)預(yù)測單點(diǎn)突變時(shí)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化[28]。

1.4雞TRAF6氨基酸多序列比對及進(jìn)化保守位點(diǎn)分析利用Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對TRAF6的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，并使用Jalview軟件分析TRAF6氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)化保守性。越是保守的位點(diǎn)發(fā)生變異，越可能影響蛋白質(zhì)的功能[30]。

1.5雞TRAF6基因與疾病表型相關(guān)nsSNPs預(yù)測

MutPred2（http：//mutpred.mutdb.org/）[30]是一款可以用于預(yù)測突變與疾病相關(guān)性的在線工具。預(yù)測結(jié)果有兩個(gè)重要分值總分?jǐn)?shù)（g）和屬性分?jǐn)?shù)（P），其中g(shù)表示氨基酸替換是有害或疾病相關(guān)的概率，P則表示蛋白結(jié)構(gòu)或功能是否有影響。結(jié)合g和P值，預(yù)測結(jié)果g>0.5且P<0.05的被稱為中假設(shè)可信，g>0.75且P<0.05的被稱為假設(shè)非?？尚臶30]。

1.6雞TRAF6蛋白質(zhì)二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用Sopma（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）[30，31]在線軟件對雞TRAF6蛋白及其突變體的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分別進(jìn)行預(yù)測，進(jìn)而評估nsSNPs可能造成的影響。

2結(jié)果與分析

2.1雞TRAF6基因nsSNPs的篩選

2.1.1雞TRAF6基因上的SNPs分布

從Ensembl數(shù)據(jù)庫中檢索到TRAF6基因的轉(zhuǎn)錄本TRAF6203（ENSGALT00000105433），檢索發(fā)現(xiàn)697個(gè)SNPs被標(biāo)記在雞TRAF6基因序列中，其中錯(cuò)義突變、同義突變、3′非翻譯區(qū)（3′UTR）變異和5′非翻譯區(qū)（5′UTR）變異分別有8個(gè)、20個(gè)、5個(gè)和1個(gè);415（含2個(gè)剪接區(qū)變異）個(gè)變異位于內(nèi)含子區(qū)，位于基因上游和下游的變異分別有120個(gè)和128個(gè)。SNPs數(shù)量百分比如圖1所示。

2.1.2雞TRAF6基因編碼區(qū)nsSNPs的分布

從dbSNP和Ensembl數(shù)據(jù)庫中共篩選出8個(gè)（rs733469223、rs736890315、rs734934585、rs735665 981、rs739156253、rs737140963、rs313558769和rs734774178）nsSNPs位于雞TRAF6基因的編碼區(qū)。通過IBS軟件繪制該8個(gè)nsSNPs的分布情況如圖2所示。

2.2.1SIFT預(yù)測功能性nsSNPs

預(yù)測的得分表示該位點(diǎn)突變對蛋白質(zhì)序列的影響。得分>0.05，可以耐受;得分≤0.05，有害。結(jié)果顯示“有害”的nsSNPs有2個(gè)，其ID分別為rs734774178、rs736890315;可耐受的nsSNPs有6個(gè)，分別為rs313558769、rs737140963、rs7391562 53、rs735665981、rs734934585、rs733469223（表1）。得分越低，說明該nsSNP對蛋白質(zhì)的功能影響越大。

2.2.2PROVEAN預(yù)測功能性nsSNPs

PROVEAN預(yù)測結(jié)果分為“有害”和“中性”兩類。分?jǐn)?shù)值≤-2.5預(yù)測為有害，分?jǐn)?shù)值>-2.5預(yù)測為中性。在所分析的8個(gè)nsSNPs中，“有害”的nsSNPs有1個(gè)，其ID是rs734774178，其余的nsSNPs均為中性（表2）。

2.2.3PhDSNP預(yù)測功能性nsSNPs

PhDSNP預(yù)測結(jié)果分為“疾病”和“中性”兩類，可靠性指數(shù)（RI）在0～9之間。預(yù)測的結(jié)果中為疾病的nsSNPs有1個(gè)，其ID是rs734774178，表明該位點(diǎn)突變可能致病;其余的7個(gè)nsSNPs均為中性（表3）。

2.2.4SNAP2預(yù)測功能性nsSNPs

SNAP2的預(yù)測結(jié)果分為“有影響”和“中性”兩類，輸出分?jǐn)?shù)值0～100預(yù)測為有影響，輸出分?jǐn)?shù)值-100～0預(yù)測為中性。預(yù)測的結(jié)果如表4所示，其中預(yù)測為有影響的有2個(gè)，其ID分別是rs734774178和rs734934585，預(yù)測為中性的有6個(gè)，分別是rs313558769、rs737140963、rs739156253、rs735665981、rs736890315、rs733469223。

2.2.5雞TRAF6基因功能性nsSNPs預(yù)測結(jié)果

通過R語言的“Venn”package繪制SIFT、PROVEAN、PhDSNP和SNAP2四種預(yù)測方法預(yù)測的韋恩圖（圖3），四種軟件功能性nsSNPs預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分別預(yù)測到2個(gè)V472E、S17R、1個(gè)V472E、1個(gè)V472E和2個(gè)V472E、C20G nsSNPs位點(diǎn)，其中V472E有4種方法預(yù)測為有害位點(diǎn)。由此推測，V472E位點(diǎn)可能為雞TRAF6基因功能性nsSNPs位點(diǎn)。

2.3雞TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析

大多數(shù)疾病相關(guān)的nsSNPs會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。利用IMutant2.0和Mupro評估氨基酸替代對突變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響。自由能變化<0，表示此nsSNPs降低了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，自由能變化>0，表示此nsSNPs增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果如表5所示，所有突變位點(diǎn)均使TRAF6蛋白質(zhì)穩(wěn)定性下降。其中V472E為之前預(yù)測的功能性突變位點(diǎn)。

2.4雞TRAF6蛋白的多序列比對和進(jìn)化保守性位點(diǎn)預(yù)測在UniProt數(shù)據(jù)庫中檢索TRAF6蛋白在原雞、火雞、綠頭鴨、鴻雁、黑天鵝和日本鵪鶉中的高度同源序列，通過Clustal Omega軟件對TRAF6氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，再使用Jalview軟件進(jìn)行作圖分析（如圖4所示），在不同物種中不保守的nsSNPs有3個(gè)，分別是D16G、S17R和A307T;在不同物種中保守的nsSNPs有5個(gè)，分別是C20G、S40G、S40R、T42A和V472E。

2.5TRAF6突變位點(diǎn)可能的功能后果預(yù)測

MutPred2在線工具預(yù)測與疾病相關(guān)的表型。得分（g）>0.5且P<0.05，為中度假設(shè)可信;g>0.75且P<0.05，為假設(shè)非?？尚?。從表6可以看出，V472E位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變，且V472E的功能后果預(yù)測為中度置信假設(shè)，其他位點(diǎn)的突變均無顯著影響。

2.6雞TRAF6突變體蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件Sopma對雞TRAF6蛋白的野生型和8種突變體進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果見表7。野生型TRAF6的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)有，α螺旋（3945%）、延伸鏈（11.56%）、β轉(zhuǎn)角（2.39%）、無規(guī)則卷曲（46.61%）4種結(jié)構(gòu)。其中，C20G位點(diǎn)的突變均造成了TRAF6蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致了α螺旋百分比下降和無規(guī)則卷曲百分比的提高，而A307T位點(diǎn)的突變未能影響α螺旋和無規(guī)則卷曲的比例;T42A、S40R、S17R、和D16G位點(diǎn)的突變均導(dǎo)致了α螺旋百分比上升和無規(guī)則卷曲百分比的下降;除S17R突變未能影響延伸鏈的比例外，其他7處突變都導(dǎo)致延伸鏈百分比下降;V472E和T42A突變都導(dǎo)致β轉(zhuǎn)角比例下降，其余6處突變均導(dǎo)致β轉(zhuǎn)角比例上升。二級結(jié)構(gòu)的變化通過影響蛋白的穩(wěn)定性從而影響蛋白翻譯調(diào)控過程，其穩(wěn)定性通過最小自由能表示，最小自由能越低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性越高。有研究表明，蛋白疏水性會(huì)隨著α螺旋比例的降低而隨著增大，隨β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲比例的升高而增大[32]。

2.7雞TRAF6蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SWISSMODEL在線軟件對雞TRAF6蛋白的野生型和突變體（V472E）的3D模型進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果如圖5所示，圖中不同的顏色代表不同的二級結(jié)構(gòu)，綠色、藍(lán)色、紅色和淺褐色分別代表α螺旋、無規(guī)卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角;由圖5看出，TRAF6蛋白的野生型和突變體（V472E）的三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致，主要結(jié)構(gòu)是α螺旋和無規(guī)卷曲。

3結(jié)論與討論

nsSNPs是基因編碼區(qū)可能對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性產(chǎn)生重大影響的單個(gè)氨基酸替換。近年來，隨著生物測序技術(shù)的發(fā)展，對功能型nsSNPs預(yù)測，已越來越多地應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)和畜牧學(xué)功能型SNP的研究中。在人類和畜禽生命中，絕大部分nsSNPs會(huì)影響人和畜禽的健康，導(dǎo)致許多疾病發(fā)生。僅有少部分的nsSNPs不會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能表達(dá)，不會(huì)影響人和畜禽的健康[33]。在家禽中，有研究者發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)基因型對三穗鴨的蛋殼品質(zhì)有影響，此外，SNP位點(diǎn)的突變可能影響動(dòng)物的表現(xiàn)型[34]。研究報(bào)道[35]，在人類大部分遺傳病中基因變異是由SNP導(dǎo)致的[17]。例如，Song等[17]通過對人TRAF6 mRNA表達(dá)水平與TRAF6內(nèi)含子SNP（rs4755453）基因型的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs475545與膿毒癥誘導(dǎo)人急性肺損傷的易感性顯著相關(guān)，這可能是rs4755453通過影響TRAF6 mRNA的表達(dá)，來增加炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而直接導(dǎo)致肺組織損傷。而少汗型外胚層發(fā)育不良（HED）疾病，其特征在于發(fā)育不良、汗?jié)癫蛔?。Fujikawa等[36]研究發(fā)現(xiàn)突變型TRAF6蛋白抑制了野生型TRAF6蛋白質(zhì)與外胚層A相關(guān)受體死亡域蛋白（EDARADD）之間的相互作用，在外胚層衍生器官發(fā)育過程中潛在地抑制了EDARADD介導(dǎo)的NFκB的活性，從而導(dǎo)致HED表型。此外，對動(dòng)物TRAF6基因的研究發(fā)現(xiàn)，TARF6是與生長發(fā)育、免疫調(diào)控相關(guān)的候選基因。研究報(bào)道，TRAF6自身泛素化的關(guān)鍵位點(diǎn)K132的突變抑制了NFκB的活性，隨之Li等[37]研究發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)帶石斑魚TRAF6的第132位氨基酸K突變?yōu)镽，突變后的K132R通過激活NFκB下游信號(hào)通路，從而在宿主抵御寄生蟲感染中起著關(guān)鍵作用。張芷毓等[38]在秦川牛TRAF6基因第六內(nèi)含子17 628 bp處檢測到的SNP位點(diǎn)形成兩種基因型，該突變基因型對肉牛的育種具有顯著影響。

本研究利用SIFT、PROVEAN、PhDSNPB和SNAP2四種生物信息學(xué)軟件對雞TRAF6基因外顯子區(qū)功能性nsSNPs進(jìn)行預(yù)測。這些方法既是相互獨(dú)立又是相互補(bǔ)充的，因此，為減少預(yù)測結(jié)果差異，本研究結(jié)合四種預(yù)測軟件進(jìn)行預(yù)測，篩選出S17R、C20G、V472E這3個(gè)nsSNPs，其中V472E是四種軟件共同篩選出的nsSNPs。研究發(fā)現(xiàn)，保守序列一般是生物體的生命所需，其突變常常致病。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性對生物學(xué)功能很重要，錯(cuò)義突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低，而IMutant2.0和Mupro是評估氨基酸替代對突變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響;MutPred2用于預(yù)測疾病表型。本研究通過對不同物種間的多序列比對和保守的多態(tài)性位點(diǎn)及其蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，V472E為保守的多態(tài)性位點(diǎn)且V472E位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變，使蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性下降。此外，MutPred2對氨基酸替代的功能預(yù)測與蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相同，V472E位點(diǎn)的突變均造成了TRAF6蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性改變。由此可知，V472E突變位可能嚴(yán)重影響雞TRAF6蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變會(huì)導(dǎo)致生物體的性狀改變，故推測V472E突變位點(diǎn)可能是影響雞生長發(fā)育和抗病育種的主要功能性SNPs。

本研究預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：rs734774178（V472E）nsSNPs使纈氨酸（Val）變成谷氨酸（Glu）。Val屬于家禽功能性必需支鏈氨基酸之一，是非極性氨基酸，具有疏水性，在肌肉中氧化代謝[39]。研究發(fā)現(xiàn)，Val可以抑制免疫器官的發(fā)育及免疫球蛋白的合成，從而影響免疫功能，增加Val含量可以增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗氧化能力[4041]。王宇波等[42]發(fā)現(xiàn)，低含量Val飼糧增加了肥育豬肌內(nèi)脂肪含量，從而影響肥育豬的生長性能。而Glu是一種帶負(fù)電荷的極性氨基酸，具有親水性，與多種疾病相關(guān)。一個(gè)氨基酸的疏水性和親水性，極性與非極性都會(huì)影響氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)功能的發(fā)揮及其各種酶和抗體、抗原之間的相互作用[43]。因此，本研究對V472E突變位點(diǎn)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)與三級結(jié)構(gòu)的功能預(yù)測相符。綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測篩選出致病的TRAF6基因的nsSNPs位點(diǎn)V472E，故推測V472突變位點(diǎn)可能影響雞抗病表型的形成，但該位點(diǎn)的具體功能與致病表型之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

雞TRAF6基因的rs734774178（V472E）位點(diǎn)可能是影響雞抗病育種的重要功能性突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)突變可能嚴(yán)重影響雞TRAF6蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)從而發(fā)揮蛋白功能。

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